Viral Concentración Determinación A través de placa Ensayos: El uso de tradicionales y novedosos sistemas de superposición

El objetivo general de este procedimiento es determinar la concentración viral a través de la cuantificación de varión infeccioso mediante el recuento de placas discretas en cultivo celular. Esto se logra primero colocando células en placas para formar una monocapa confluente para la infección. El segundo paso es realizar la dilución en serie de la muestra viral desconocida que se va a cuantificar.

A continuación, las monocapas confluentes se infectan mediante la dilución en serie del stock viral, seguida de la aplicación de una capa inmovilizadora. El paso final es fijar y teñir las placas después del tiempo de incubación adecuado para el virus en cuestión con el fin de contar las placas discretas. En última instancia, los ensayos de placa se pueden utilizar y modificar de varias maneras diferentes para determinar los títulos virales de una muestra viral desconocida.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la superposición semisólida, es que la aplicación y la eliminación son mucho más sencillas tanto en las aplicaciones tradicionales como en las de alto rendimiento. Además, no es necesario calentar los reactivos. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la investigación de muchos virus líticos diferentes como el uso de una capa líquida.

En un formato de 96 pocillos permite la detección rápida de nuevos compuestos terapéuticos, lo que puede disminuir en gran medida las largas horas que se pasan en el laboratorio realizando ensayos de placa tradicionales el día anterior a la placa de ensayo, las células adecuadas para el virus en cuestión con el fin de lograr una fluidez del 90 al 100% el día de la infección. Las soluciones madre también se pueden preparar el día antes del ensayo: primero preparar una solución de fijación de formaldehído al 10% en agua destilada mezclando 5,56 mililitros de formaldehído al 36% con 14,44 mililitros de agua destilada. A continuación, prepare la tinción de cristal violeta que consiste en un 1% de cristal violeta en un 20% de etanol diluido con agua destilada.

A continuación, mientras trabaja en condiciones estériles, prepare los dos medios de placa adecuados para el tipo de células que se utilizan. Filtre la solución a través de un filtro de 0,2 micras si alguno de los reactivos no es estéril. Para preparar una capa de líquido para su uso en la placa, ensaye 2,4 gramos de pila avy en un matraz que contiene 97,6 mililitros de agua destilada que se mezcla rápidamente con una barra de agitación.

Mezcle la solución a temperatura ambiente hasta que se vuelva demasiado viscosa para la barra revolvente. En este punto, transfiera el matraz a un agitador de matraces y agite intensamente durante 30 minutos para garantizar una homogeneización uniforme. Finalmente, autoclave la solución a 121 grados Celsius a 14 PSI durante 30 minutos.

Y cuando el programa haya terminado, guárdelo sellado a temperatura ambiente para obtener una superposición de aros. Prepare una solución de agro stock al 0,6% en agua destilada. Mezcle con una barra agitadora y un autoclave para obtener una solución o una capa de carboximetilcelulosa.

Prepare una solución de metilcelulosa al 2% carboxila en agua destilada y mezcle en autoclave como antes del día después del enchapado. Utilice un microscopio invertido para comprobar la fluidez y viabilidad de las células antes de comenzar el ensayo. Asegúrese de que las células exhiban una morfología celular estándar y aproximadamente un 90% de fluidez.

Realizar una dilución seriada diez veces de las muestras infecciosas en medios de crecimiento celular, variando el número de diluciones necesarias en función del título esperado del virus en cuestión. Además, prepare una muestra de control no infectada para garantizar de forma independiente la viabilidad celular y ayudar en la identificación de la placa. Pipetear el control no infectado y la dilución en serie en los pocillos de la placa, teniendo cuidado de no interrumpir la monocapa.

Utilice un volumen suficiente de inóculo para cubrir las células, manteniendo el volumen lo más bajo posible para maximizar el contacto viral con la monocapa. Coloque las placas en la incubadora de cultivo de tejidos e infecte las células durante 45 minutos a una hora cada 20 minutos. Meca suavemente las placas para asegurar una cobertura uniforme y evitar que la monocapa celular se seque durante la infección.

Prepare la solución de trabajo de superposición para superposiciones líquidas. Mezcle medios de placa calentados y una celda de stock de 1,2 a 2,4 % a temperatura ambiente en una proporción de uno a uno para obtener una solución de trabajo de 0,6 a 1,2 % de medio de recubrimiento de celda promedio o medios de placa calentados mixtos de superposición AROS o CMC, y una solución madre de 0,6 % de AROS o 2 % de CMC calentada en una proporción de uno a uno. Luego colóquelo en un baño de agua a 56 grados centígrados, 30 minutos para equilibrar la temperatura.

Asegúrese de que la solución esté tibia pero no caliente al tacto para evitar la muerte celular y reducir los títulos virales. Después de la infección, aplique las placas de recubrimiento a las monocapas infectadas después de la adición de la capa de incubación de placas a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante dos a 14 días, dependiendo del virus que se esté analizando, para fijar las células con una capa de líquido, vierta o aspire la capa de células e, luego pipetee la solución de formaldehído al 10% en los pocillos y fíjela a temperatura ambiente durante 30 minutos durante toda la noche o aros o CMC directamente. Agregue la solución de formaldehído a la capa durante una hora o toda la noche a temperatura ambiente después de la fijación, deseche el formaldehído y luego retire manualmente los tapones semisólidos donde se encuentran los aros con la espátula.

Enjuague las placas de células de aby con agua para eliminar el fijador de superposición residual antes de teñir. Para teñir, cubra las células con una cantidad mínima de solución de violeta cristalina durante aproximadamente 15 minutos. Balancee las placas si es necesario para garantizar una cobertura uniforme.

Lave suavemente la mancha de violeta cristalino con agua una vez fijada, manchada y secada almacene el plex indefinidamente para análisis futuros. Cuente las placas en cada pozo, descontando los pozos con menos de cinco o más de 100 placas. Tome el promedio de cualquier réplica técnica de la misma dilución.

Tome nota del tamaño y la morfología de la placa. Determine el título viral de la muestra de stock tomando el número promedio de placas para una dilución y el inverso del factor de dilución total. Esta imagen muestra comparaciones de superposición de placas del virus de la fiebre del Valle del Rift utilizando placas de 12 pocillos, se sembraron 2,5 veces 10 de las quintas celdas en placas de 12 pocillos y se infectaron con 200 microlitros utilizando la misma muestra inicial diluida en serie de MP 12.

Después de la infección, se aplicaron superposiciones de 1,5 mililitros de 0,3%aros, 0,6%AVY o 1%CMC para comparar directamente las superposiciones. Este histograma muestra los resultados de los recuentos de placas y las puntuaciones de las tres superposiciones. Aquí. Se muestran las comparaciones de superposición de placas ViiV utilizando placas de 12 pocillos, las oficinas se cubrieron como antes y se infectaron con un volumen de 200 microlitros utilizando la misma muestra inicial diluida en serie de la cepa de la vacuna ViiV TC 83 después de la infección, se aplicaron superposiciones de 1,5 mililitros de 0,3%aros, 0,6% de células avy o 1% CMC como antes.

Una vez más, el histograma muestra los resultados de los recuentos de placas y los títulos de las tres superposiciones. Esta imagen muestra un ejemplo de superposiciones de placa de alto rendimiento. Se probó una placa de 96 pocillos de VIRs sembrada a tres veces 10 de las cuartas celdas por pocillo con 50 microlitros de inóculo utilizando la misma muestra inicial diluida en serie del virus de la fiebre del Valle del Rift MP 12 durante una hora en duplicado cuádruple para las superposiciones de 0,6 y 1,2% Las concentraciones finales de la célula avy se probaron para determinar la viabilidad y reproducibilidad de utilizar superposiciones líquidas de una manera de alto rendimiento.

Este histograma muestra los títulos determinados a partir de cada superposición. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que cada virus es diferente y puede ser necesario realizar optimizaciones, incluida la utilización de diferentes tipos de células, tiempos de incubación o medios de crecimiento. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar un ensayo básico de placa utilizando superposiciones líquidas y semisólidas.