Name: Viral Concentración Determinación A través de placa Ensayos: El uso de tradicionales y novedosos sistemas de superposición (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Aprende a cuantificar virus mediante ensayos de placa comparando recubrimientos semisólidos tradicionales con microcelulosa cristalina líquida. Este método simplifica la aplicación y mejora el alto rendimiento en virología.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nos gustaría agradecer a FMC BioPolymer USA por las muestras de productos de Avicel. Este trabajo fue apoyado a través de la subvención de la Agencia de Reducción de Amenazas de Defensa HDTRA1-13-1-0005 a KK y la subvención de investigación de los NIH 1R15AI100001-01A1to KK.

1. Preparación de Células y Reactivos <ol><li> El día antes del ensayo, la placa de células huésped apropiadas para el virus en cuestión (Tabla 1 y 2) a 90 - 100% de confluencia. </li><li> Preparar la solución de fijación de formaldehído al 10% en dH 2 O. En el ejemplo, la mezcla 5,56 ml de 36% de la formaldehído con 14,44 ml de H 2 O destilada (dH2O). NOTA: Use las prácticas de manejo seguro apropiado y ventilación cuando se utiliza formaldehído. </li><li> Preparar mancha cristal violeta: 1% de cristal violeta (CV) en etanol al 20% y DH 2 O. </li><li> Preparar los medios de comunicación de la placa 2x (tipo celular dependiente a la concentración 2x; véase la Tabla 2). Filtrar sobre un filtro de 0,2 micras si cualquier reactivo no son estériles. </li><li> Preparación de las placas de inmovilización (Tabla 3) <ol><li> Para superposiciones de líquidos, hacer una solución de 2,4% estéril de Avicel en dH 2 O. Para evitar la formación de grumos, añadir el polvo a un matraz que contiene agua ªen que se mezcla rápidamente con una barra de agitación, se vierte lentamente en Avicel y revolver rápidamente a temperatura ambiente (TA). Cuando la solución resulta demasiado viscoso para una barra de agitación para homogeneizar, cambiar a un agitador de matraces para&gt; 30 min con agitación fuerte para asegurar una homogeneización. NOTA: Las soluciones madre se pueden hacer a concentraciones más bajas, pero las soluciones pueden separar y tendrán que ser remezclado para asegurar la homogeneización. Las soluciones de trabajo de Avicel pueden utilizarse van desde 0,6 hasta 3%. </li><li> Después de la homogeneización, autoclave la solución y tienda sellada a temperatura ambiente. </li><li> Para agarosa y carboximetilcelulosa (CMC) superposiciones, preparar una solución de reserva en dH 2 O de 2% de CMC o agarosa al 0,6%. Mezclar con una barra de agitación y autoclave o microondas para poner en solución. </li></ol></li></ol> 2. Las diluciones e Infecciones <ol><li> El día después de la siembra, compruebe visualmente la confluencia y la viabilidad de las células antes de comenzar el ensayo. Asegurar un estándar celular morfologíaencontrar una monocapa confluente ~ 90% está presente. </li><li> Realizar una dilución en serie de diez veces de las muestras infecciosas. Utilice el medio de crecimiento celular para la propagación viral como el diluyente (Tabla 2). Variar el número de diluciones requeridas basado en el título esperado del virus en cuestión, y siempre utilizar una muestra de control no infectado para asegurar de forma independiente la viabilidad celular y ayuda en la identificación de la placa. </li><li> De las diluciones en serie, infectar las células durante 45 min a 1 h (Tabla 1). Utilice un volumen suficiente de inóculo para cubrir las células, mientras que manteniendo el volumen lo más bajo posible para maximizar el contacto con la monocapa viral (Tabla 4). Placas de roca suavemente cada 20 minutos para asegurar una cobertura uniforme y evitar la monocapa celular se seque. </li><li> Después de la infección, superponer un volumen apropiado de medio de inmovilización directamente a los inóculos en el pozo (Tabla 2) usando una mezcla 1: 1 de los medios de placa 2x y la immobilizing superposición de elección (CMC, agarosa o Avicel). Agite suavemente para mezclar. <ol><li> Para superposiciones de líquidos, mezclar 1: 1 con los medios de placa 2x calentado y 1.2 a 2.4% de RT Stock Avicel para obtener una solución de trabajo de 0,6 a 1,2% de medio de superposición Avicel. </li><li> Para una capa de agarosa, utilice una mezcla 1: 1 de los medios de placa 2x calentado y una solución madre de 0,6% de agarosa climatizada, lugar en un baño de agua 56 ° C durante 30 min para equilibrar la temperatura de la obtención de una concentración de agarosa / superposición final de 0,3 %. </li><li> Para CMC, preparar una solución de 2% y el tratamiento que el descrito para la capa de agarosa. </li><li> Cuando se aplica el recubrimiento a la monocapa, siempre equilibrar agarosa caliente o CMC en un 56 ° C el agua para evitar daños a la monocapa. Asegúrese de que la solución es cálido, pero no caliente al tacto para evitar la muerte de las células y los títulos virales reducidos. La mayoría de las superposiciones de agarosa comenzarán a solidificarse por debajo de 42 ° C, trabajar de forma rápida y / o preparar pequeños lotes para evitar la solidificación durante la manipulación. </li></ol></li><li> Después de la adición de la superposición, incubar las placas para producir placas distintas que son claramente contable. La formación de placas puede tomar 2-14 días dependiendo del virus que se analizaron, la Tabla 1. NOTA: Una vez que las placas superpuestas líquidos se colocan en la incubadora, no moverlos. Movimiento de las superposiciones de líquidos durante el período de incubación se traducirá en placas untadas. Agarosa y CMC superposiciones son semisólido y se pueden mover o revisados ​​periódicamente bajo un microscopio de luz para controlar el desarrollo de la placa. </li></ol> 3. Fijación y tinción de las células <ol><li> Para fijar las células, verter o aspirar la superposición Avicel, y fijar las células utilizando la solución de formaldehído al 10% durante 30 min a durante la noche (&lt;1 ml por pocillo de una placa de 6 pocillos). <ol><li> Para agarosa o CMC, añadir directamente la solución de formaldehído a la superposición durante 1 hora a toda la noche. NOTA: Las muestras pueden mantenerse durante largos períodos de tiempo en el fijador siempre lo haceno se evapore y seque ya que esto puede distorsionar la monocapa. </li></ol></li><li> Antes de la tinción y después de la fijación, deseche el formaldehído y quitar los tapones semisólidos para la agarosa y CMC, ya sea con agua corriente o manualmente con una espátula. Enjuague Avicel placas con agua para eliminar residual superposición / fijador antes de la tinción. </li><li> Para la tinción, cubrir las células con una cantidad mínima de solución de cristal violeta durante ~ 15 min. Placas de roca si es necesario para asegurar una cobertura uniforme. </li><li> Lavar suavemente la mancha violeta cristal con agua. Una vez fijado, manchado, y se seca, almacenar las placas de forma indefinida para futuros análisis. </li></ol> 4. Determinación de títulos virales <ol><li> Cuente las placas en cada pocillo, tomando el promedio de los técnicos repeticiones de la misma dilución. Para los grandes formatos de placas, pozos de descuento con menos de 5 o mayor de 100 placas. Tome nota del tamaño de la placa y la morfología. El control negativo debe tener una monocapa uniforme yse puede utilizar como un control de referencia. </li><li> Determinar el título viral de la muestra de stock de tomar el número medio de placas para una dilución y la inversa del factor de dilución total. </li></ol><img alt="Ecuación 1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52065/52065eq1.jpg" width="300" /> NOTA: Como un ejemplo, 30 y 32 placas contada por repeticiones de la 1 x 10 -7 dilución [31 (promedio) / 10 -7 (dilución) x 0,4 ml (inóculo)] produciría un título de 7,75 x 10 8 pfu / ml.

<ol><li>Cooper, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plaque+assay+of+animal+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Virus+Res%22%5BJournal%5D)">The plaque assay of animal viruses.</a> Adv. Virus Res. 8, 319-378 (1961).</li>
<li>Dulbecco, R., Vogt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+problems+of+animal+virology+as+studied+by+the+plaque+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Symp.+Quant.+Biol%22%5BJournal%5D)">Some problems of animal virology as studied by the plaque technique.</a> Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 18, 273-279 (1953).</li>
<li>Hartley, J. W., Rowe, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+culture+cytopathic+and+plaque+assays+for+mouse+hepatitis+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Soc.+Exp.+Biol.+Med.+Soc.+Exp.+Biol.+Med.+N.+Y%22%5BJournal%5D)">Tissue culture cytopathic and plaque assays for mouse hepatitis viruses.</a> Proc. Soc. Exp. Biol. Med. Soc. Exp. Biol. Med. N. Y. 113, 403-406 (1963).</li>
<li>Juarez, D., Long, K. C., Aguilar, P., Kochel, T. J., Halsey, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+plaque+assay+methods+for+alphaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Assessment of plaque assay methods for alphaviruses.</a> J. Virol. Methods. 187, 185-189 (2013).</li>
<li>Shurtleff, A., Keuhne, A., Biggins, J., Keeney, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+alternative+overlays+in+plaque+assays%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Use of alternative overlays in plaque assays.</a> , USAMRIID. Fort Detrick, MD USA. (2011).</li>
<li>Shurtleff, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+the+Filovirus+Plaque+Assay+for+Use+in+Preclinical+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Standardization of the Filovirus Plaque Assay for Use in Preclinical Studies.</a> Viruses. 4, 3511-3530 (2012).</li>
<li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+low-viscosity+overlay+medium+for+viral+plaque+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Virol.+J%22%5BJournal%5D)">New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays.</a> Virol. J. 3, 63(2006).</li>
<li>Klebe, R. J., Harriss, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technically+simple+%E2%80%98non-lethal%E2%80%99+vital+staining+procedure+for+viral+plaque+and+cell+transformation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Virol%22%5BJournal%5D)">A technically simple ‘non-lethal’ vital staining procedure for viral plaque and cell transformation assays.</a> Arch. Virol. 81, 359-362 (1984).</li>
<li>Gaush, C. R., Smith, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+and+plaque+assay+of+influenza+virus+in+an+established+line+of+canine+kidney+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells.</a> Appl. Microbiol. 16, 588-594 (1968).</li>
<li>Abiko, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outbreak+of+Human+Metapneumovirus+Detected+by+Use+of+the+Vero+E6+Cell+Line+in+Isolates+Collected+in+Yamagata%2C+Japan%2C+in+2004+and+2005%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Outbreak of Human Metapneumovirus Detected by Use of the Vero E6 Cell Line in Isolates Collected in Yamagata, Japan, in 2004 and 2005.</a> J. Clin. Microbiol. 45, 1912-1919 (2004).</li>
<li>Baer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+DNA+damage+signaling+upon+Rift+Valley+fever+virus+infection+results+in+cell+cycle+arrest+and+increased+viral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Induction of DNA damage signaling upon Rift Valley fever virus infection results in cell cycle arrest and increased viral replication.</a> J. Biol. Chem. 287, 7399-7410 (2012).</li>
<li>Austin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+Activation+following+Rift+Valley+Fever+Virus+Infection+Contributes+to+Cell+Death+and+Viral+Production%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">p53 Activation following Rift Valley Fever Virus Infection Contributes to Cell Death and Viral Production.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li>
<li>Böttcher-Friebertshäuser, E., Stein, D. A., Klenk, H. -D., Garten, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+influenza+virus+infection+in+human+airway+cell+cultures+by+an+antisense+peptide-conjugated+morpholino+oligomer+targeting+the+hemagglutinin-activating+protease+TMPRSS2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2.</a> J. Virol. 85, 1554-1562 (2011).</li>
<li>Youil, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+influenza+virus+replication+in+Vero+and+MDCK+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparative study of influenza virus replication in Vero and MDCK cell lines.</a> J. Virol. Methods. 120, 23-31 (2004).</li>
<li>Tobita, K., Sugiura, A., Enomoto, C., Furuyama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plaque+assay+and+primary+isolation+of+influenza+a+viruses+in+an+established+line+of+canine+kidney+cells+%28MDCK%29+in+the+presence+of+trypsin%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Microbiol.+Immunol.+%28Berl.%29%22%5BJournal%5D)">Plaque assay and primary isolation of influenza a viruses in an established line of canine kidney cells (MDCK) in the presence of trypsin.</a> Med. Microbiol. Immunol. (Berl.). 162, 9-14 (1975).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar ni intereses financieros o en competencia en el protocolo o los productos descritos.

El factor más crítico para el éxito de un ensayo de placa se encuentra en la optimización del protocolo para el cultivo viral particular en cuestión ya que las condiciones pueden variar significativamente. Los puntos clave a tener en cuenta son: la sede de la compatibilidad celular con el virus en cuestión, las condiciones de crecimiento viral apropiados, los rangos de dilución suficiente con el fin de diferenciar claramente las placas, y la selección de superposición correcta y tinción de las células y de virus en cuestión. Mientras VEEV y RVFV tanto crecen bajo condiciones muy similares que utilizan muchos de los mismos tipos de células huésped, las diferencias en la morfología y cinética de crecimiento de placa varían significativamente. Cuando se utilizan células Vero para los ensayos de placa, que se han utilizado tradicionalmente como una línea celular de propagación y el indicador de virus y alfavirus fiebre hemorrágica, VEEV normalmente crece hasta títulos más altos que RVFV y demuestra el aumento de la cinética de replicación, el desarrollo de grandes placas uniformes a 48 hpi 4, 10-12. En contraste con VEEV, RVFV requiere 72 hpi y demuestra placas que son típicamente mucho más pequeño y de tamaño variable. En oposición a RVFV y VEEV, el virus de la gripe es altamente específica de la célula huésped y puede ser difícil para propagarse a través de cultivo de tejidos. Para el virus de la influenza, la entrada viral y fusión normalmente se inicia por la unión del receptor de la superficie celular con la hamagglutinin glicoproteína viral (HA), que media la entrada en la célula diana mediante la unión con el receptor de superficie de ácido α-siálico de la célula huésped. HA es una glicoproteína trimérico que está presente en la envoltura de la membrana de todos los virus de la gripe y requiere la escisión en el HA1 y HA2 subunidades por una proteasa específica de la célula huésped. Para complicar aún más el asunto, estos sitios de escisión a menudo pueden variar entre cepas virales 13. Como la expresión de proteasas capaces de escindir HA está restringida a tejidos específicos, proteasas are menudo añadido a medios de cultivo celular con el fin de facilitar la fusión viral y la entrada en la célula huésped seleccionada 13. TPCK-tripsina es un ejemplo de una proteasa de uso común que se utiliza en el cultivo de células MDCK tanto con y células Vero: facilitar la replicación multi-ciclo (en ausencia de cualquier suero inactivar la tripsina) a través de la activación proteolítica de HA viral 14,15. Como se demuestra en este estudio y otros, las diferencias en los ciclos de vida virales pueden influir en las selecciones de superposición, los formatos de placas, y los tiempos de recogida, con variaciones significativas entre diferentes clases y especies de virus. En nuestro estudio, las superposiciones de agarosa demostraron placas más claras en los títulos más altos que cualquiera de CMC o superposiciones de líquidos, tanto para RVFV y el virus de la influenza B, reforzando su utilidad entre una amplia gama de virus y tipos de células. Usando una concentración final de agarosa de bajo gran medida con la ayuda en la eliminación de los tapones sólidos y tinción simplificado. CMC demostró en general la peficacia oorest como una superposición de los tres virus probadas y producidas placas muy pequeñas y poco definidos para el virus de la influenza B. Aunque en general CMC demostró las características menos deseables, su uso en rápido crecimiento y extremadamente virulentas de virus podrían resultar ventajoso, como lo hizo parece reducir tamaño de la placa con sólo una mínima disminución en el título. La superposición líquido resultó ser el más versátil en que era extremadamente sencillo de preparar, mayor facilidad de uso, y fue comparable a agarosa a través de todos los virus seleccionados. En un formato de placa de un mayor rendimiento de 96 pocillos, aplicación y eliminación no fue inhibida debido a la solidificación como con revestimientos tradicionales, y proporcionado resultados precisos y consistentes. Una consideración cuando se utiliza superposiciones líquidos se encuentra en la coloración opaca y la incapacidad para controlar la formación de placa como las placas no se pueden mover hasta el punto de recogida, limitando esta adaptación a los virus con cinética de replicación previamente caracterizadas. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Pequeñas modificaciones en las condiciones de ensayo de placa pueden alterar significativamente los resultados, y la evaluación y el rendimiento de cualquier nuevo sistema o técnica está siempre garantizado. Mientras que un protocolo de ensayo de placa optimizada y estandarizada no existe para cada situación, nuestro informe demuestra la versatilidad y facilidad de uso en el tradicional, así como nuevos recubrimientos líquidos para ensayos de placa, mientras que proporciona un fondo suficiente para otras modificaciones de usuario.

El aislamiento y la cuantificación exacta de las muestras virales viables ha sido siempre un objetivo de la investigación en curso en virología. No fue sino hasta el advenimiento de la placa de ensayo en 1952 que un medio para calcular cuantitativamente y cualitativamente los títulos virales de los animales fue desarrollado por primera vez 1,2. Esta técnica se ha adaptado y modificado a partir de ensayos de fagos, que previamente habían sido utilizados para calcular los títulos de los bacteriófagos de valores en biología vegetal 1,2 en primer lugar. Mientras que medios alternativos para la cuantificación viral Desde entonces se han desarrollado y adaptado, tales como inmunoensayos, fluorescencia y microscopía electrónica de transmisión, la detección de impulsos resistiva sintonizable (TRPS), citometría de flujo, sistemas indicadores recombinantes, y reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa (QRT-PCR) , estos métodos no logran identificar y cuantificar de replicación de viriones competentes 1,3. Si bien los avances en las tecnologías y técnicas continúan refinando y alterar el paisaje; handensayos e siguen representando el estándar de oro en la determinación de las concentraciones virales de viriones infecciosos líticas 1,4. Durante un ensayo de placa, una monocapa confluente de células huésped está infectado con un virus lítico de una concentración desconocida que se ha diluido en serie a una gama contable, típicamente entre 5-100 viriones. Las monocapas infectadas se cubren con un medio de recubrimiento de inmovilización para prevenir la infección viral de forma indiscriminada difusión a través de ya sea el flujo de convección mecánica o del medio líquido durante la propagación viral. Mientras que se han utilizado tradicionalmente superposiciones sólidos o semisólidos tales como agarosa, celulosa de metilo o carboximetil celulosa (CMC), superposiciones de líquidos se han convertido en una alternativa cada vez más atractiva con el desarrollo de nuevos recubrimientos líquidos tales como Avicel 5- 7. Ensayos de placas que utilizan líquido frente superposiciones tradicionales tienen varias ventajas como la superposición puede ser aplied a temperatura ambiente, y la aplicación y la eliminación es mucho más fácil. Como superposiciones líquidos no requieren calentamiento, virus lábiles delicados y de calor también pueden resultar más fáciles de placa. Después de la infección inicial y la aplicación de la superposición de inmovilización, las placas individuales, o zonas de muerte celular, comenzará a desarrollar una infección viral y la replicación como se ven limitados a la monocapa circundante. Las células infectadas continuarán el ciclo de replicación-lisis-infección, propagación aún más la infección, lo que resulta en placas cada vez más distintas y discretas. Dependiendo de la cinética de crecimiento y célula huésped viral usado, una placa visible normalmente formar dentro de 2-14 días. Monocapas celulares pueden entonces ser contadas con un microscopio de campo claro estándar, o más típicamente fijos y counterstained por el rojo o cristal violenta neutral con el fin de identificar fácilmente las placas con el ojo desnudo. Hay una amplia variedad de manchas de contador de placa disponibles, cada uno con ésimoEIR ventajas y desventajas específicas. Violeta cristal se añade típicamente en el punto de recogida y después de la fijación / extracción de la superposición, proporcionando una mancha contador rápido y distinto que permite la identificación de placas muy pequeñas cuando morfología mixta está presente. El rojo neutro tiene la ventaja de la aplicación temprana y el contacto constante con la superposición, lo que permite el seguimiento en vivo de desarrollo de la formación de placa, que es particularmente útil cuando se trabaja con un desconocido cinética de virus o de replicación. Sin embargo, hemos encontrado que la tinción normalmente no es tan distinta cuando se utiliza rojo neutro. 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-tetrazolio bromuro de difenil (MTT) ofrece varias ventajas, como las manchas de tinte de color amarillo viven células placas azules oscuras y virales pueden contarse sin eliminación de la superposición como con rojo neutro. El alto contraste entre células vivas y muertas que ofrece el MTT también permite la detección de pequeñas placas en una infección punto anterior post tiempo, Aunque el almacenamiento seguiría exigiendo la eliminación de la superposición de 8. Como cristal violeta se puede simplemente hizo en una solución de agua y alcohol, y ofrece un alto grado de sensibilidad para la morfología de la placa mixta, hemos elegido como una mancha counter preferente y simplificado para el protocolo demostró como estamos utilizando varias familias de bien virus caracterizados. Después de la fijación y tinción de la monocapa celular infectada, las placas se cuentan en orden para titular muestras de valores virales en términos de unidades formadoras de placa (pfu) por mililitro. Una gota de registro debe señalar entre diluciones en serie y, dependiendo del tamaño de la placa, entre 5-100 placas contadas, con un control negativo utilizado como referencia. Muestras estadísticamente variarán en un 10% por cada 100 placas contadas al comparar la muestra replica 3. La ventaja de usar ensayos de placas para determinar los títulos virales reside en su capacidad para cuantificar el número real de partículas virales infecciosas wentro de la muestra. Como múltiples viriones podrían potencialmente infectar una sola célula, se utiliza la terminología de las unidades frente a viriones durante titulaciones de placa 1,2. Morfología de la placa puede variar enormemente en condiciones de crecimiento diferentes y entre las especies virales. Tamaño de la placa, la claridad, la definición de fronteras, y la distribución deben tenerse en cuenta todos, ya que pueden proporcionar información valiosa sobre los factores de crecimiento y virulencia del virus en cuestión. Principios ensayo de placa de base también se pueden adaptar y modificar en un número de maneras diferentes, tales como en el uso de ensayos de formación de enfoque (AGL). AGL no se basan en la lisis celular y la contratinción para detectar la formación de placa, sino más bien inmunotinción emplean técnicas para detectar directamente las proteínas virales intracelulares a través de anticuerpos etiquetados. Aumento de la sensibilidad, la disminución de los tiempos de incubación después de la infección, y lo más importante la capacidad para cuantificar los virus no lítico son todos distintosventajas cuando se emplean ácidos grasos libres. Aunque se usan ampliamente, los factores limitantes críticos en AGL frente a un ensayo de placa tradicional se encuentra en la necesidad de anticuerpos apropiados y la capacidad de sólo sonda para subunidades de proteínas virales frente a viriones infecciosos reales 4. A los efectos de este estudio, vamos a limitar nuestra discusión a ensayos de placas clásicos y describir el uso de superposiciones de sólidos y semisólidos tradicionales (agarosa y CMC), junto con superposiciones de celulosa microcristalina líquido novedosos.

<table><tbody><tr><td>Placa CellStar de 6 pocillos para cultivo de tejidos</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658 160</td><td></td></tr><tr><td>Placa CellStar de 12 pocillos para cultivo de tejidos</td><td>Greiner Bio-One</td><td>665 180</td><td></td></tr><tr><td>Placa CellStar de 96 pocillos para cultivo de tejidos</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655 180</td><td></td></tr><tr><td>placa de pocillos profundos de 96-2 ml</td><td>USA Scientific C15046314</td><td></td><td>Para diluciones en serie</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Quality Biológicos</td><td>112 013 101</td><td>Medios Celulares/Diluyente</td></tr><tr><td>2x EMEM para placas Biológicos de</td><td>Calidad</td><td>115 073 101</td><td>Cálido a 37 &#176; C</td></tr><tr><td>MEM 100x&nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>25 025 Cl</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de Sodio&nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>25 000 Cl</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140 122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030 081</td><td></td></tr><tr><td>HyClone FBS&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30910.03</td><td>Inactivación del calor antes de su uso a 62 &#176; C durante 30 min</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma Aldritch</td><td>A7030-50G</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina TPCK</td><td>Sigma Aldritch</td><td>T1426-50mg</td><td>Hacer alícuotas/Evitar la congelación y descongelación</td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>DEAE-Dextrano</td><td>Sigma Aldritch</td><td>D9885-10G</td><td></td></tr><tr><td>Cristal Violeta</td><td>Sigma Aldritch</td><td>C3886-25G</td><td></td></tr><tr><td>Solución de formaldehído</td><td>Sigma Aldritch</td><td>F8775-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Etanol desnaturalizado Grado de reactivo</td><td>Sigma Aldritch</td><td>362808-1L</td><td></td></tr><tr><td>Avicel RC-591 NF</td><td>FMC BioPolymer USA</td><td>RC-591 NF</td><td>Agitar vigorosamente al reconocer&nbsp; durante >30 min para homogeneizar</td></tr><tr><td>UltraPure Agarose&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16500-100</td><td></td></tr><tr><td>Carboximetilcelulosa, sal de sodio viscosidad media&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4888</td><td></td></tr></tbody></table>

viral concentración determinación a través de placa ensayos: el uso de tradicionales y novedosos sistemas de superposición

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Ensayos de placas siguen siendo uno de los métodos más precisos para la cuantificación directa de los viriones infecciosos y sustancias antivirales a través del conteo de placas discretas (unidades infecciosas y zonas muertas celulares) en el cultivo de células. Aquí se demuestra cómo realizar un ensayo de placa de base, y cómo superposiciones y técnicas diferentes pueden afectar la formación de placa y la producción. Típicamente sustratos de superposición sólidos o semisólidos, tales como agarosa o celulosa carboximetil, se han utilizado para restringir la propagación viral, prevención de la infección indiscriminada a través del medio de crecimiento líquido. Superposiciones inmovilizados restringen la infección celular para la monocapa que rodea inmediatamente, lo que permite la formación de focos contable discreto y formación de la placa posterior. Para superar las dificultades inherentes en el uso de recubrimientos tradicionales, una novela superposición de líquido que utiliza celulosa microcristalina y carboximetil celulosa de sodio se ha utilizado cada vez más como un sustituto en la normala placa de ensayo. Ensayos de placa de superposición líquidas se pueden realizar fácilmente en 6 o 12 formatos de placas, así como estándar por las técnicas tradicionales y no requieren equipo especial. Debido a su estado líquido y la posterior facilidad de aplicación y remoción, formatos de placas de microcultivo, alternativamente, se pueden utilizar como una rápida, precisa y de alta alternativa rendimiento para titulaciones virales de mayor escala. El uso de un polímero líquido viscoso climatizada no ofrece la oportunidad de racionalizar el trabajo, conserve los reactivos, espacio incubador, y aumenta la seguridad operativa cuando se utiliza en los laboratorios de contención tradicionales o altos como ningún calentamiento del reactivo o material de vidrio son obligatorios. Superposiciones líquidas también pueden ser más sensibles que los recubrimientos tradicionales para ciertos virus lábiles al calor.

La capacidad de los ensayos de placa de evaluar con precisión los títulos virales depende de numerosos factores: la selección de células huésped apropiado, medios y condiciones de crecimiento adecuadas para la viabilidad celular y viral, la propagación viral inmovilizado, y una determinación exacta del período de incubación viral para permitir un tiempo adecuado para distinta y la formación de placa contable. Para este estudio, se eligieron tres familias de virus representativos para demostrar diferencias en: la selección de superposición, períodos de incubación, y morfología de la placa a través de diferentes tipos de muestras. La encefalitis equina venezolana (VEEV) fue seleccionado como un modelo viral (+) ARN de cadena simple, que puede causar enfermedad significativa en las especies y seres humanos equinos y representa la familia Togaviridae. Influenza B cepa Taiwán, una segmentado (-) de virus ARN de cadena simple que infecta principalmente los seres humanos, representa a la familia Orthomyxoviridae. Valle del Rift virus de la fiebre (RVFV), a - virus de ARN de cadena simple artrópodo nacido infectando principalmente artrópodos, ()rumiantes y los seres humanos, fue seleccionado como representante de la familia Bunyaviridae. Para RVFV (Figura 1), los títulos se determinaron a partir de una solución madre de una cepa viva atenuada recombinante MP12 de RVFV en un formato de placa de 12 pocillos utilizando CMC, agarosa, o Avicel superposiciones que se incubaron de lado a lado para después de la infección 72 hr (HPI). Un plato representativo que muestra diluciones que van desde 10 -4-10 -7 se puede ver en el panel A. Las placas utilizando CMC y superposiciones de agarosa mostró placas pequeñas, claras y distintas, con un borde circular bien definida. Las placas con una capa de líquido fueron ligeramente más abundantes y de mayor tamaño en comparación con las placas de agarosa y CMC, y proporcionaron una frontera menos distintas. Los títulos virales se compararon en el Panel B con todas las superposiciones realizar comparable. Con el fin de obtener una comparación visual más clara entre las superposiciones de MP12, junto con un tamaño de muestra mayor para determinar reproduccibilidad, una placa de 6 pocillos también se probó por triplicado (Figura 2). En el formato de placa de 6 pocillos, el uso de una superposición de CMC mostró placas más pequeño que cualquiera superposiciones de agarosa o líquidos, que eran comparables en tamaño a la otra. Mientras que los títulos virales fueron similares entre los tres superposiciones (Panel D), placas formadas en las capas de agarosa y líquidos resultaron más fáciles de contar debido a su mayor tamaño. En contraste con RVFV, los títulos de VEEV y morfología de la placa entre las superposiciones de diferentes variaron notablemente (Figura 3A). Placas formadas en las capas de CMC demostraron una morfología clara y distinta cuando se utiliza un formato de placa de 12, a expensas de tamaño y sensibilidad de la placa (Panel B). En contraste con CMC, el uso de agarosa y líquidos superposiciones resultó en placas significativamente más grandes, lo que indica la inhibición viral más baja y aumento de la sensibilidad a la replicación VEEV. Esto fue confirmado previamente cuando se comparan exclusivamente agarosa frente a CMC en apaper publicado por Juárez et al. 4. Mientras agarosa y líquidos superposiciones producen placas más grandes que CMC, las placas habían bordes mal definidos y eran difíciles de contar en un formato de 12 pocillos, con superposiciones de líquidos que proporcionan la mayor difusión frontera. Cuando las placas se probaron en placas de 6 pocillos (Figura 4), ​​el más grande formato de 6 pocillos negada la cuestión de la abiertamente grandes placas que eran difíciles de diferenciar en el formato de 12 pocillos, con agarosa y superposiciones de líquidos que demuestren superior a las superposiciones de CMC en términos de definición placa y sensibilidad (Figura 4D). En comparación con RVFV o VEEV, influenza proporciona varios desafíos únicos cuando formación de placas, tales como el requisito de una proteasa externa. La sensibilidad de los virus de la influenza a las diferentes selecciones de superposición también ha sido bien documentado en el pasado ya que se han observado cambios significativos cuando las modificaciones de menor importancia como como diferentes marcas de agarosa tienen seres usado 9. Es interesante para la cepa de la influenza B Taiwán, el uso de la CMC como una superposición dio lugar a placas notablemente más pequeños que eran difíciles de contar y resultaron difíciles de marcar de forma fiable (Figura 5A). El uso de una capa de agarosa proporcionó las mejores placas (Panel C), y resultó en una mancha de fondo más oscuro (probablemente debido a un aumento de la viabilidad monocapa), y mostró placas más claras y nítidas en comparación directa con el uso de la superposición de líquido (Panel B ). Una clara ventaja de polímeros líquidos más de superposiciones sólidas y semisólidas, tales como agarosa y CMC, se encuentra en la facilidad de eliminación y aplicación. Superposiciones semiduros requieren calefacción, y la solidificación puede ser problemático cuando la manipulación y eliminación. Con el fin de sacar provecho de estas ventajas y determinar la viabilidad de la utilización de Avicel en forma de alto rendimiento para RVFV, un formato de placa de 96 pocillos se probó en diferentes concentrati superposicióncomplementos (Figura 6). Para RVFV MP-12, las diluciones se realizaron por cuadruplicado en ambos 0,6 y 1,2% concentraciones finales de Avicel. Aplicación de superposición y la eliminación demostraron simple, sin diferencias aparentes entre repeticiones o entre las concentraciones observadas, lo que demuestra un alto grado de reproducibilidad. Al puntuar, las placas eran distintos y contable a simple vista, lo que demuestra la viabilidad de la utilización de superposiciones de líquidos en un alto rendimiento para RVFV manera. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6.5in" width="650" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig1highres.jpg" /> Figura 1: Placa RVFV comparaciones de superposición utilizando placas de 12 pocillos se sembraron a Veros 2,5 x 10 5 células en placas de 12 pocillos y se infectaron con 200 l usando la misma muestra de partida diluido en serie de MP12.. Después de la infección 1,5 ml superposiciones de agarosa al 0,3%, 0,6% Avicel, o 1% de CMC (c definitivaoncentrations), se aplicaron con el fin de comparar directamente las superposiciones como se ha demostrado en el Panel A. Las placas se contaron y se titularon en el Panel B. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig2highres.jpg" /> Figura 2: placa RVFV comparaciones de superposición utilizando placas de 6 pocillos Veros se sembraron a 5 x 10 5 células en placas de 6 pocillos y se infectaron con 400 l usando la misma muestra de partida diluido en serie de MP12.. Tres ml superposiciones de agarosa al 0,3%, 0,6% Avicel, o 1% de CMC, se aplicaron con el fin de comparar directamente las superposiciones como se demuestra en el Panel A, B, y C. experimentos separados se llevaron a cabo de forma idéntica como se describe para paneles de AC, con las placas se contaron y se titularon en el Panel D (N = 3). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig3highres.jpg" /> Figura 3: &lt;strong&gt; placa VEEV comparaciones de superposición utilizando placas de 12 pocillos se sembraron Veros. a 2,5 x 10 5 células en placas de 12 pocillos y se infectaron con 200 l utilizando la misma muestra diluido en serie a partir de la cepa de la vacuna VEEV TC-83. Después de la infección 1,5 ml superposiciones de agarosa al 0,3%, 0,6% Avicel, o 1% de CMC, se aplicaron con el fin de comparar directamente las superposiciones como se demuestra en el Panel A. Las placas se contaron y se titularon en el Panel B. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig4highres.jpg" /> Figura 4: V EEV comparaciones de superposición de la placa que utilizan placas de 6 pocillos Veros se sembraron a 5 x 10 5 células en placas de 6 pocillos y se infectaron con 400 l usando la misma muestra de partida diluido en serie de VEEV TC-83.. Después de la infección, 3 ml superposiciones de agarosa al 0,3%, 0,6% Avicel, o un 1% de CMC, se aplicaron con el fin de comparar directamente las superposiciones como se ha demostradoen los Paneles A, B y C. experimentos separados se llevaron a cabo de forma idéntica a la descrita para Paneles A - C, con placas contadas y tituladas en el Panel D (N = 3). <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig5highres.jpg" /> Figura 5: INFLUENZA placa comparaciones de superposición de las células MDCK se sembraron a 5 x 10 5 células en placas de 6 pocillos y se infectaron con 400 l de inóculo utilizando la misma muestra de partida diluido en serie de Influenza B Taiwan.. No suero bovino fetal (FBS) se utilizó en el medio de crecimiento o superposiciones, como FBS puede inhibir la propagación de la influenza mediante la inhibición de ciertas proteasas que son necesarios para la fusión viral. TPCK-tripsina se añadió a todas las superposiciones antes de la aplicación con el fin de facilitar la fusión viral y la entrada con las células huésped. Después de la infección, 3 ml superposiciones de agarosa al 0,3%, 0,6% Avicel, o 1% de CMC se aplicaron con el fin de comparar directamentelas superposiciones como se demuestra en el Panel A, B y C. experimentos separados se llevaron a cabo de forma idéntica como se describe en los Paneles A - C, con placas contadas y tituladas en el Panel D (N = 3). Mientras que en promedio fue tomada por placas CMC que resultaron difíciles de contar de forma fiable, ya que demostraron fronteras difusas y tamaños muy pequeños de placa. <img alt="Figura 6" fo:content-width="6.5in" width="650" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig6highres.jpg" /> Figura 6:. Superposiciones de placa de alto rendimiento Una placa de 96 pocillos de Veros en placas a 3 x 10 4 células por pocillo, se infectaron con 50 l de inóculo utilizando la misma muestra de partida diluido en serie de RVFV MP12 durante 1 hora, por cuadruplicado. Para las superposiciones, 0,6 y 1,2% concentraciones finales de Avicel se probaron para determinar la viabilidad y reproducibilidad de la utilización de superposiciones de líquidos de una manera de alto rendimiento, paneles A y B. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VEEV </td><td> Influenza B </td></tr><tr><td> Tipo de la célula </td><td> Vero </td><td> Vero </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> Período de infección </td><td> 1 hora </td><td> 1 hora </td><td> 45 min </td></tr><tr><td> El tiempo de incubación </td><td> 3 días </td><td> 2 días </td><td> 3 días </td></tr></tbody></table> Tabla 1: La placa de ensayo de inoculación condiciones y tipos de células <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VEEV </td><td> Influenza B </td></tr><tr><td> Tipo de la célula </td><td> Vero </td><td> Vero </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> Tipo de crecimiento</td><td> DMEM 1 </td><td> DMEM 1 </td><td> DMEM 2 </td></tr><tr><td> Placa de Medios </td><td> Un 2xEMEM </td><td> Un 2xEMEM </td><td> 2xEMEM B </td></tr></tbody></table> 1. Medio de Eagle Modificado de Dulbecco suplementado con 10% suero bovino fetal, 1% de L-glutamina, 1% Penicllin / estreptomicina. 2. Medio de Eagle Modificado de Dulbecco suplementado con 1% de L-glutamina, 1% Penicllin / estreptomicina, 0,2% albúmina de suero bovino, HEPES 0,025%, DEAE-dextrano 50 ug / ml. A. 2x Medio Esencial Mínimo (500 ml) suplementado con FBS al 5% (25 ml), 1% Esencial Mínimo Amino Acids (5 ml), 1% de piruvato sódico (5 ml), 1% de L-glutamina (5 ml), 2% penicilina / estreptomicina (10 ml). B. 2x Medio Esencial Mínimo (500 ml) suplementado con 0,2% de albúmina de suero bovino, aminoácidos esenciales 1% mínimo (5 ml), 50 ug / ml, 0,025% HEPES, DEAE-dextrano, Tripsina-TPCK * * Justo antes de la preparación, añadir 1 l por cada 25ml de 2 mg / ml de tripsina-TPCK a la alícuota que va a utilizar para mezclar con agarosa para placas. Tabla 2: La placa y Viral / Celular Crecimiento Medios <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VEEV </td><td> Influenza B </td></tr><tr><td> Tipo de la célula </td><td> Vero </td><td> Vero </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> Período de infección </td><td> 1 hora </td><td> 1 hora </td><td> 45 min </td></tr><tr><td> El tiempo de incubación </td><td> 3 días </td><td> 2 días </td><td> 3 días </td></tr></tbody></table> Soluciones de superposición no expirarán cuando se hace siempre y cuando se mantenga la esterilidad. Tabla 3: Superposiciones Stock <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> 6 así </td><td> 12 así </td><td> 96 así </td></tr><tr><td> Nº de células / pocillo </td><td> 5 x 10 5 </td><td> 2,5 x 10 5 </td><td> 3 x 10 4 </td></tr><tr><td> Volumen de inóculo (l) </td><td> 400 </td><td> 200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> volumen de superposición (ml) </td><td> 3 </td><td> 1.5 </td><td> 0,100 </td></tr></tbody></table> Tabla 4: Formatos de placas

Los ensayos de placa son el estándar de oro para la cuantificación viral, ya que utilizan superposiciones atrapantes en las monocapas celulares del huésped para determinar los títulos virales. Si bien tradicionalmente se han utilizado varias superposiciones semisólidas, aquí demostramos técnicas de placa que comparan las superposiciones semisólidas con una nueva celulosa microcristalina líquida entre varias familias de virus.

Viral Concentración Determinación A través de placa Ensayos: El uso de tradicionales y novedosos sistemas de superposición

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

El objetivo general de este procedimiento es determinar la concentración viral mediante la cuantificación de partículas infecciosas contando placas discretas en cultivo celular. Esto se logra primero sembrando células para formar una monocapa confluente destinada a la infección. El segundo paso consiste en realizar diluciones seriadas de la muestra viral desconocida que se desea cuantificar. A continuación, se infectan las monocapas confluentes utilizando las diluciones seriadas del inóculo viral, seguido por la aplicación de una capa sobrepuesta inmovilizadora. El paso final es fijar y teñir las placas tras el tiempo de incubación adecuado para el virus en cuestión, con el fin de contar las placas discretas. En definitiva, los ensayos de placas pueden utilizarse y modificarse de diversas maneras para determinar los títulos virales de una muestra viral desconocida.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como la capa intermedia semisólida, es que su aplicación y eliminación son mucho más sencillas tanto en aplicaciones de alto rendimiento como tradicionales. Además, no se requiere calentar los reactivos. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la investigación de muchos virus líticos diferentes, ya que el uso de una capa intermedia líquida en formato de placa de 96 pocillos permite el cribado rápido de compuestos terapéuticos novedosos, lo que puede reducir considerablemente las largas horas pasadas en el laboratorio realizando ensayos tradicionales de placas. El día anterior al ensayo, siembre las células adecuadas para el virus en cuestión con el fin de alcanzar una confluencia del 90 al 100% el día de la infección. Las soluciones stock también pueden prepararse el día anterior al ensayo. Primero, prepare una solución fijadora de formaldehído al 10% en agua destilada mezclando 5,56 mililitros de formaldehído stock al 36% con 14,44 mililitros de agua destilada. Luego, prepare la tinción de violeta de cristal compuesta por violeta de cristal al 1% en etanol al 20%, diluido con agua destilada. A continuación, trabajando bajo condiciones estériles, prepare el medio de placas 2x adecuado para el tipo de células que se están utilizando. Filtre la solución a través de un filtro de 0,2 micrones si alguno de los reactivos no es estéril. Para preparar una capa líquida para usar en el ensayo de placas, añada 2,4 gramos de Avicel a un matraz que contenga 97,6 mililitros de agua destilada que se esté mezclando rápidamente con una barra de agitación. Mezcle la solución a temperatura ambiente hasta que se vuelva demasiado viscosa para la barra de agitación. En este punto, transfiera el matraz a un agitador orbital y agite vigorosamente durante 30 minutos para asegurar una homogeneización uniforme. Finalmente, esterilice la solución en autoclave a 121 grados Celsius y 14 PSI durante 30 minutos.Y cuando el programa haya finalizado, almacene sellado a temperatura ambiente. Para una capa superior de agarosa, prepare una solución stock de agarosa al 0,6 % en agua destilada, mezcle con una barra de agitación y autóclave para disolver. Para una capa superior de carboximetilcelulosa, prepare una solución de carboximetilcelulosa al 2 % en agua destilada y mezcle. Luego autóclave como antes.Al día siguiente de la siembra, utilice un microscopio invertido para verificar la confluencia y viabilidad de las células antes de comenzar el ensayo. Asegúrese de que las células presenten una morfología celular estándar y una confluencia aproximada del 90 %.Realice una dilución seriada por diluciones decimales de las muestras infecciosas en medio de crecimiento celular, variando el número de diluciones necesarias según el título esperado del virus en cuestión. Además, prepare una muestra control no infectada para garantizar independientemente la viabilidad celular y ayudar en la identificación de las placas. Pipetee la muestra control no infectada y la dilución seriada en los pocillos de la placa, teniendo cuidado de no perturbar la monocapa.Utilice un volumen suficiente de inóculo para cubrir las células, manteniendo el volumen lo más bajo posible para maximizar el contacto vírico con la monocapa. Coloque las placas en el incubador de cultivo de tejidos e infecte las células durante 45 minutos a una hora. Cada 20 minutos, agite suavemente las placas para asegurar una cobertura uniforme y evitar que la monocapa celular se seque. Durante la infección, prepare la solución de trabajo para recubrimientos líquidos. Mezcle a partes iguales medio para placas tibio y Stock de Avicel al 1,2 a 2,4% a temperatura ambiente para obtener una solución de trabajo con un medio de recubrimiento de Avicel al 0,6 a 1,2%. Para recubrimientos de agarosa o CMC, mezcle a partes iguales medio para placas tibio y una solución stock de agarosa al 0,6% calentada o CMC al 2%, respectivamente. Luego, coloque la mezcla en un baño de agua a 56 grados Celsius durante 30 minutos para lograr la equilibración térmica. Asegúrese de que la solución esté tibia pero no caliente al tacto, para evitar la muerte celular y la reducción de los títulos virales. Después de la infección, aplique los recubrimientos sobre las monocapas infectadas. Tras la adición del recubrimiento, incube las placas a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante dos a 14 días, según el virus que se esté analizando. Para fijar las células con una capa líquida, deseche o aspire la capa de Avicel y luego agregue solución de formaldehído al 10% en los pocillos, dejando fijar a temperatura ambiente durante 30 minutos hasta toda la noche. Para agarosa o CMC, agregue directamente la solución de formaldehído sobre la capa durante una hora hasta toda la noche a temperatura ambiente. Después de la fijación, deseche el formaldehído y luego retire manualmente los tapones semisólidos de agarosa con la espátula.Lave las placas celulares de Avicel con agua para eliminar el fijador residual de la capa antes de la tinción.Cubra las células con una cantidad mínima de solución de violeta de cristal durante aproximadamente 15 minutos. Agite suavemente las placas si es necesario para asegurar una cobertura uniforme. Lave cuidadosamente el colorante violeta de cristal con agua. Una vez fijadas, teñidas y secas, almacene las placas indefinidamente para su análisis futuro. Cuente las placas en cada pocillo, excluyendo aquellos con menos de cinco o más de 100 placas. Tome el promedio de cualquier réplica técnica de la misma dilución. Tenga en cuenta el tamaño y la morfología de las placas. Determine la titulación viral de la muestra original tomando el número promedio de placas para una dilución y el inverso del factor de dilución total.Esta imagen muestra comparaciones del recubrimiento de placas del virus de la fiebre del Valle del Rift utilizando placas de 12 pocillos. Las células Veros se sembraron a 2,5 veces 10 a la quinta células en placas de 12 pocillos e infectaron con 200 microlitros usando la misma muestra inicial diluida en serie del MP 12. Tras la infección, se aplicaron recubrimientos de 1,5 mililitro de agarosa al 0,3%, Avicel al 0,6% o CMC al 1% para comparar directamente los recubrimientos. Este histograma muestra los resultados de los conteos de placas y las titulaciones para los tres recubrimientos. Aquí se muestran comparaciones del recubrimiento de placas del VEEV utilizando placas de 12 pocillos. Las células Veros se sembraron como antes e infectaron con un volumen de 200 microlitros usando la misma muestra inicial diluida en serie de la cepa vacunal VEEV-TC 83; tras la infección, se aplicaron recubrimientos de 1,5 mililitro de agarosa al 0,3%, Avicel al 0,6% o CMC al 1% como antes.Nuevamente, el histograma muestra los resultados de los conteos de placas y la titulación para los tres recubrimientos. Esta imagen muestra un ejemplo de recubrimientos de placas de alto rendimiento. Una placa de 96 pocillos con células Veros sembradas a tres veces 10 a la cuarta células por pocillo se infectó con 50 microlitros de inóculo utilizando la misma muestra inicial del virus de la fiebre del Valle de Rift MP 12 diluida en serie, durante una hora y en cuadruplicado. Para los recubrimientos, se probaron concentraciones finales del 0,6 y 1,2 % de Avicel cell con el fin de determinar la viabilidad y la reproducibilidad del uso de recubrimientos líquidos de manera de alto rendimiento. Este histograma muestra las titulaciones determinadas a partir de cada recubrimiento. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que cada virus es diferente y que pueden ser necesarias optimizaciones, como el uso de diferentes tipos celulares, tiempos de incubación y/o medio de crecimiento. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar un ensayo de placas básico utilizando recubrimientos líquidos y semisólidos.

viral-concentration-determination-through-plaque-assays-using

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Cuando se trabaja con medios y reactivos utilizados para los microorganismos de cultivo, una técnica aséptica debe ser practicada para asegurar la contaminación se minimiza. Una variedad de métodos de enchapado se utilizan habitualmente para aislar, propagar, o bacterias enumerar y fagos, todos los cuales incorporan procedimientos que mantienen la esterilidad de materiales experimentales.

Técnicas de laboratorio asépticas: Métodos de Revestimiento

Aquí se describe un método para cuantificar las partículas infecciosas de norovirus murino (MNV), que es el norovirus que sólo se replica de manera eficiente en cultivo celular. El ensayo de placa se aprovecha de MNV tropismo para macrófagos murinos y puede ser adaptado para su uso con muestras biológicas o ambientales que contienen MNV.

Placa de Ensayo para Norovirus murino

Source: Morales Vasquez, D., et al. Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the protocol for carrying out plaque assay–based viral titration for quantifying infectious virus levels in tissue sample collected from a virus–infected mouse model.

Plaque Assay–Based Quantification of Viral Load in an Infected Mouse Tissue Sample

Este video describe el ensayo de placa viral del virus infeccioso del herpes simple o VHS. Las partículas virales diluidas se inoculan a la monocapa de células epiteliales. Tras la incubación, el virus forma placas y se cuenta visualmente para determinar el título del virus infeccioso.

Ensayo de placa viral: una técnica para medir el virus del herpes simple infeccioso mediante la cuantificación de placas formadas en una monocapa de células infectadas por el virus

Este video muestra el método para realizar un ensayo de placa utilizando un virus obtenido de córnea porcina infectada. La córnea porcina se utiliza para probar la eficacia antiviral de fármacos experimentales.

Determinación de la eficacia antiviral de fármacos experimentales mediante un ensayo de placa

Este artículo presenta un método basado en la expresión de luciferasa de alto rendimiento para valorar varios virus de ARN y ADN utilizando manipuladores de líquidos automatizados y manuales.

De Alto Rendimiento La titulación de luciferasa que expresan virus recombinantes

Este estudio describe una   -Imagen basado ensayo de micro-neutralización para analizar las relaciones antigénicas entre los virus. El protocolo emplea un escáner de superficie plana y tiene cuatro pasos, incluyendo la titulación, la cuantificación de titulación, neutralización, y la cuantificación de neutralización. El ensayo funciona bien con pdm09 corriente que circula la gripe A (H1N1), A (H3N2), virus A y B.

Optimización de un ensayo cuantitativo micro-neutralización

Se describe un método para generar y amplificar genéticamente modificados virus sincitiales respiratorios (RSVs) y un ensayo de placa optimizada para RSVs. Ilustramos este protocolo mediante la creación de dos virus recombinantes que respectivamente permiten cuantificación de replicación RSV y análisis de cuerpos de inclusión de RSV y gránulos asociada a cuerpos de inclusión dinámica en vivo.

Generación, amplificación y titulación de virus sincitiales respiratorios recombinantes

Plaquing es un método de rutina utilizado para cuantificar virus vivos en una población. Aunque el plaquing se enseña con frecuencia en varios currículos de microbiología con bacterias y bacteriófagos, el plaquing de virus de mamíferos es más complejo y requiere más tiempo. Este protocolo describe los procedimientos que funcionan de manera confiable para el trabajo regular con virus del herpes simple.

Plaquing de los virus del herpes simple

El presente protocolo describe la propagación del virus del Zika (ZIKV) en células de riñón de mono verde africano Vero y la cuantificación del ZIKV utilizando métodos de inmunodetección colorimétrica basados en células en formatos de 24 y 96 pocillos (alto rendimiento).

Propagación de virus y cuantificación colorimétrica basada en células

Aprende a cuantificar virus mediante ensayos de placa comparando recubrimientos semisólidos tradicionales con microcelulosa cristalina líquida. Este método simplifica la aplicación y mejora el alto rendimiento en virología.

Viral Concentración Determinación A través de placa Ensayos: El uso de tradicionales y novedosos sistemas de superposición

Explorar más videos