Name: Ligadura Altamente Eficiente de los Pequeños ARN moléculas de microARN cuantificación mediante secuenciación de alto rendimiento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 15 s
Description: Aprende a clonar microARN mediante ligación eficiente de oligonucleótidos para secuenciación de alto rendimiento. Este método permite la cuantificación precisa del transcriptoma completo de microARN con resolución de nucleótido individual.

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Los autores desean agradecer a los miembros del laboratorio Yi, especialmente a Zhaojie Zhang, por sus fructíferas discusiones sobre el diseño de enlazadores y la eficiencia de la ligadura, así como a la Sociedad Americana del Cáncer por apoyar este trabajo a través de una beca postdoctoral (#125209) a J.E.L. La investigación reportada en esta publicación también fue apoyada por el Instituto Nacional de Artritis y Enfermedades Musculoesqueléticas y de la Piel de los Institutos Nacionales de Salud bajo el Número de Premio R01AR059697 (a R.Y.) y una beca de investigación del Instituto Linda Crnic para el Síndrome de Down. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

NOTA: Es fundamental para mantener las condiciones-RNasa libre durante todo el procedimiento. 1. adenilación de 3 &#39;vinculador <ol><li> Diluir oligonucleótido de ADN diseñada para las reacciones de 3 &#39;de ligación a 100 micras de nucleasa libre de H 2 O. NOTA: El oligonucleótido debe tener un &#39;grupo fosfato, un dinucleótido aleatorizado en el 5&#39; 5 final, y un &#39;didesoxicitosina 3. El 5 &#39;grupo fosfato es un requisito de la enzima para una eficiente Mes 5&#39; adenylation 10. El fosfato puede ser añadido por el pre-tratamiento del oligonucleótido con un polinucleótido quinasa, o pedir con la modificación directamente. El dinucleótido aleatorizado en el extremo 5 &#39;es importante para minimizar la preferencia que ligasas de ARN de exposiciones con certeza de extremo a extremo de unirse a las reacciones sobre otros 6 secuencia. El 3 &#39;didesoxicitosina coloca un elemento de bloqueo en el extremo 3&#39; del oligonucleótido to inhibir la formación de concatámeros enlazador-enlazador durante los pasos posteriores de ligación y también sirve para bloquear el extremo de la molécula de los genes miARN-Enlazador formado en el extremo de 3 &#39;de la reacción de ligación 3 11. La secuencia de engarce oligonucleótido elegido para el método de miR-Seq imparcial es como sigue: 5&#39;PO 4 NNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-dideoxyC3 &#39;. </li><li> Montar la siguiente reacción adenylation: 200 pmol oligonucleótido 3 &#39;enlazador, 4 l de 10x 5&#39; tampón adenylation ADN, ATP 4 mM l 1, 4 l Mes ARN ligasa, libre de nucleasa H 2 O hasta un volumen final de 40 l. </li><li> Incubar la reacción a 65 ° C durante 1 hora. Terminar reacción por calentamiento a 85 ° C durante 5 min. </li><li> Precipitar enlazador adenylated por la adición de 2,5 volúmenes de etanol al 100% y 1/3 volumen de acetato de amonio 10 M para eliminar ATP residual y para evitar ligaduras no anticipados en futuras reacciones. <ol><li> En pocas palabras, mezclar la colcohol, la sal, y la solución de oligo hasta la homogeneidad, haciendo girar a toda velocidad en una microcentrífuga (~ 15.000 xg) a 4 ° C durante 20 min. Lavar el precipitado en etanol al 70%, secado al aire, y se resuspende en el volumen apropiado de libre de nucleasa H 2 O para producir 50-100 M de oligo adenilado. </li></ol></li><li> Confirmar adenylation mediante la ejecución de un gel de poliacrilamida al 18%. <ol><li> Preparar el gel mezclando juntos la siguiente: 6,3 g de urea, 6,75 ml de 40% de acrilamida, y 1,5 ml de 10x TBE. Añadir H2O y 15 ml. </li><li> Mezclar hasta que la urea se disuelve completamente y añadir 150 l 10% (w / v) de persulfato de amonio (APS) y 15 l tetramethlyethylenediamine (TEMED). </li><li> Una vez que se ha fijado gel, pre-carrera durante 30 min a 24 V / cm de anchura de gel con TBE 1x tampón a temperatura ambiente. Una vez que 30 minutos es hasta los pozos inmediatamente con tampón. </li><li> Mezclar 5 pmol de oligonucleótidos con adenilados y un volumen igual de 2x tampón de desnaturalización del ARN de carga (95% (v / v) formamida,0,02% (w / v) SDS, 0,02% de azul de bromofenol (w / v), 0,01% (w / v) de xileno cianol, EDTA 1,0 mM), calentar brevemente a 75 ° C, y SNAP enfriado en hielo. Prescindir de toda la muestra en el pocillo del gel. También incluya una cantidad idéntica de control no adenilado, y los bajos estándares de tamaño de peso molecular. </li><li> Correr el gel a 24 V / cm hasta que el azul de bromofenol es ¾ de la forma de la parte inferior del gel. Desmontar el aparato, gel post-tinción con solución SYBR-oro en 1x 1x TBE y visualizar el cuadro de UV-transiluminador (Figura 2). NOTA: Gel purificar el oligo adenylated de una manera similar a la descrita anteriormente si &quot;no ARN de entrada&quot; controles están resultando en una alta cantidad de producto de PCR en comparación con las muestras con ARN de entrada. </li></ol></li></ol> 2. vinculador Ligadura a 3 &#39;Fin de miARN <ol><li> 3 &#39;La ligadura <ol><li> Ensamble los componentes siguientes en el hielo en el orden indicado: 1.0 l 50% (w / v) PEG 8000, 0,5 y# 956; l de 10x tampón de ligasa de ARN (500 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM de MgCl 2, DTT 10 mM), 1,0 l adenylated 3 &#39;Enlazador (100 mM), inhibidor de ARNasa 0,5 l, 0,5-8,0 g RNA total, 0,5 l de ARN ligasa de T4 2, libre de nucleasa H 2 O hasta un volumen final de 5 l. </li><li> Mezclar la reacción mediante pipeteo como la solución es demasiado viscoso para vórtice debido a la alta concentración de PEG 8000. Una vez bien mezclados, coloque la reacción en un termociclador con una tapa calentada. Ajuste el bloque a 16 ° C, y se incuba durante 4 horas. NOTA: La reacción puede hacerse a escala hasta un volumen final de 20 l, sin ninguna pérdida en la eficiencia de la ligadura. Reaccionar durante 4 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C para producir la eficiencia de ligación esencialmente idénticas. </li></ol></li><li> Purificación en gel <ol><li> Después de 3 &#39;de la ligación, la mezcla de la reacción con un volumen igual de tampón de carga 2x ARN. Calentar a 70 ° C durante 5 min, y broche de presión enfriar en hielo. </li&gt; <li> Ejecutar la muestra en un gel de poliacrilamida al 15% para la purificación PAGE. <ol><li> Preparar un gel de poliacrilamida al 15% que contiene urea 7 M, en una manera similar a la descrita previamente en el paso 1.5. </li><li> Pre-correr el gel a 24 V / cm de anchura de gel por lo menos durante 30 minutos. Apague la fuente de alimentación, los pozos de descarga, carga y muestra de gel de carrera en mismo voltaje que antes de la carrera. </li><li> Cargue la muestra y ejecutar la página hasta que el azul de bromofenol sólo ha salido del gel. El producto deseado migrará cerca de la cianol xileno. </li></ol></li></ol></li><li> La tinción, visualización, y Escisión <ol><li> Desmontar aparato de gel y el lugar de gel en la bandeja limpia con 1x tampón (TBE), 1x SYBR-oro, y roca durante 15 min. </li><li> Retire gel de placa de tinción y visualizar el cuadro de transiluminador UV cubierta con una envoltura de plástico limpio. El producto de ligación debe ser alrededor de 45 nucleótidos de longitud. </li><li> Impuestos especiales de la región que contiene el producto de ligación con un razo limpiohoja r y colocar en 0,5 ml tubo de micro-centrífuga. </li></ol></li><li> El aislamiento del producto y Precipitación <ol><li> Pierce inferior de 0,5 ml tubo de microcentrífuga con una aguja de 30 G y colocar el tubo perforado en un segundo, baja retención de limpia, de 1,5 ml tubo de microcentrífuga. Centrifugar durante 5 min a ~ 15.000 x g. </li><li> Visualmente confirmar que toda la porción de gel se ha movido a través del agujero en el tubo interior. Si es necesario, utilice una punta de pipeta limpia para empujar algunos fragmentos de gel más cerca del agujero. </li><li> Desechar el tubo 0,5 ml vacío y añadir 400 l de tampón de la columna de alta sal (HSCB NaCl 400 mM, Tris-HCl 25 mM, pH 7,5, 0,1% SDS) a la suspensión de acrilamida. Tubo (s) de la roca a 4 ° C durante la noche. </li><li> Transferencia de lechada a una columna de centrifugación de acetato de celulosa de 0,22 micras utilizando una punta de pipeta de gran calibre. Centrifugar durante 3 min a temperatura ambiente a ~ 15.000 xg para recoger todo el líquido lejos de matriz de gel de acrilamida. </li><li> Trasvasar el líquido a una, bajo la retención limpia, tubo de 1,5 ml contieneing 1 l de 20 mg / ml de glucógeno. Añadir un volumen igual de isopropanol y 1/10 de acetato de sodio volumen XX. Mezclar solución invirtiendo tubo varias veces y precipitar en -80 ° C congelador durante 20 min. </li><li> Centrifugar a toda velocidad a 4 ° C durante 20 min para sedimentar el ácido nucleico. Eliminar el sobrenadante y lavar en etanol al 70%. Aire pellet seco durante 10 min a temperatura ambiente y proceder directamente a 5 &#39;etapa de ligación. </li></ol></li></ol> 3. vinculador ligadura de extremo 5 &#39;de los genes miARN-3&#39; Enlazador híbrido <ol><li> Para ácido nucleico granulado, añadir los siguientes componentes: 2 l de PEG 8000 (50% w / v), 0,5 l de 10x RNA Ligase Buffer, 0,5 l ATP (10 mM), 0,5 l NN-ARN oligo (100 mM), y H 2 O hasta un volumen final de 4 l. NOTA: La composición de la &#39;NN-ARN oligo&#39; es el siguiente 5 &#39;invertida-didesoxi-TCUACAGUCCGACGAUCNN3&#39; y se purificó por medio de HPLC por el fabricante. </li><li> Mezclaresta muestra pipeteando arriba y abajo varias veces. Haga esto durante algún tiempo (hasta 5 min) para asegurarse de que el sedimento ha sido re-solubilizado por completo. Si re-solubilización es problemático, calentar la muestra brevemente (3-5 min) a 37 ° C y reanudar pipeteado para mezclar. </li><li> Una vez que la pastilla está de vuelta en solución, transferir el contenido de un tubo de PCR limpio que contiene 1 l de una mezcla 1: 1 de inhibidor de RNasa y T4 ARN ligasa 1 (5 unidades). Una vez más la mezcla pipeteando arriba y abajo. </li><li> Incubar la reacción en un ciclador térmico a 37 ° C durante 4 h. Proceda inmediatamente a la síntesis de ADNc. </li></ol> 4. Transcripción inversa / cDNA Synthesis <ol><li> Añadir los siguientes componentes a los 5 &#39;reacción de ligación: 2 l de tampón 5x RT, 0,75 l de DTT 100 mM, 1 l Illumina RT Primer 5&#39;-GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#39; (1 M), y 0,5 mu l dNTPs (10 mM). </li><li> Mezclar mediante pipeteo y se calienta a 65 ° C durante 5 min. Luego enfriar lentamente en el banco top. </li><li> Una vez que la reacción se ha enfriado a temperatura ambiente, colocar el tubo en hielo y añadir 0,5 l de cada uno de enzima transcriptasa inversa y un inhibidor de RNasa. Mezclar mediante pipeteo y el lugar en el termociclador para la etapa de extensión se indica en las instrucciones del fabricante. </li><li> Una vez completa add 5 l de nucleasa libre de H 2 O para llevar el volumen final de la biblioteca de ADNc de hasta 15 l. </li></ol> 5. Biblioteca Preparación <ol><li> Para la indexación PCR, montar la siguiente reacción en hielo: 6 l 5x Phusion Buffer, 1 mu l dNTPs (10 mM), 0,9 l de DMSO, 0,75 l Cebador 5 &#39;(25 mM), 0,75 l cebador 3&#39; (25 mM), biblioteca de ADNc de 3 l (concentración variable en función de la cantidad de la entrada), 0,5 l de la polimerasa Phusion (1 unidad), libre de nucleasa H 2 O hasta un volumen final de 30 l. Elegir las secuencias de cebadores para asegurar la compatibilidad con la plantilla y la plataforma de secuenciación deelección. <ol><li> Ejecutar la reacción de PCR con los siguientes ajustes: desnaturalización inicial a 98 ° C durante 3 min, durante los primeros 4 ciclos, desnaturalizar 98 ° C durante 15 s, recocido a 50 ° C durante 15 s, se extienden a 72 ° C durante 15 s . NOTA: En función de la cantidad del material de entrada, varía el número total de ciclos de PCR. Típicamente, para una entrada de 1-2 g de RNA total, 13 ciclos totales de PCR son suficientes para generar la biblioteca de miR-Seq. </li><li> Llevar a cabo los ciclos posteriores, por ejemplo, los ciclos 5-12, de una manera en dos etapas, donde se combinan y se llevaron a cabo a 70 ° C durante 30 segundos y la desnaturalización de los ciclos de recocido y extensión es de nuevo 98 ° C durante 15 s. NOTA: El volumen de reacción es de 30 l para permitir una pausa en el programa de PCR y retirar una alícuota de 10 l en los números de ciclo pre-determinados para monitorizar la apariencia del producto deseado. Típicamente, los ciclos 10, 13, y 16 son elegidos para las pruebas de una muestra de ARN total. </li></ol></li><li> Prepararun no desnaturalización gel de acrilamida al 8% mediante la mezcla de 2 ml de 40% de acrilamida, 1 ml de TBE 10x, y H 2 O a 10 ml. A continuación, añadir 100 l de 10% de APS y 10 l de TEMED. Vierta en gel y dejar establecido. <ol><li> Pre-correr el gel a 12 V / cm de anchura de gel durante 30 min. Lavar los pozos. Añadir 1 l de 10x tampón de carga (15% de Ficoll-400, EDTA 66 mM, 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,1% (w / v) SDS, 0,01% (w / v) de azul de bromofenol), añadir 10 l de muestra a cada pocillo de dimensiones 5 mm x 1 mm x 15 mm. Por lo general, cada pozo puede cargar hasta 30 l de muestras. Ejecutar la muestra de gel a 10 V / cm de anchura de gel en tampón 1x TBE hasta que el colorante azul de bromofenol sólo se ejecuta fuera de la parte inferior del gel. </li><li> Mancha y visualizar en gel como se describe en el paso 2.3. </li><li> Escindir la banda de par 146 base y eluir durante la noche en 0,25 ml de HSCB de una manera similar a lo que se describe en la sección 2.4. Precipitado de ADN en un volumen igual de isopropanol y acetato de décimo volumen de sodio XX. Lavar la pella en el 70% eTHANOL y resuspender en tampón TE. </li><li> Cuantificar la biblioteca utilizando PicoGreen de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-ligase-dependent+biases+in+miRNA+representation+in+deep-sequenced+small+RNA+cDNA+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries.</a> RNA. 17 (9), 1697-1712 (2011).</li>
<li>Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+RNA+cloning+enables+accurate+quantification+of+miRNA+expression+by+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing.</a> Genome Biology. 14 (10), 109(2013).</li>
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<li>Linsen, S. E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+and+possibilities+of+small+RNA+digital+gene+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Limitations and possibilities of small RNA digital gene expression profiling.</a> Nature Methods. 6 (7), 474-476 (2009).</li>
<li>Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+remediation+of+biases+in+the+activity+of+RNA+ligases+in+small-RNA+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 39 (21), 141(2011).</li>
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<li>Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+bias+in+T4+RNA+ligase-mediated+3%E2%80%B2-adapter+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3′-adapter ligation.</a> Nucleic Acids Research. 40 (7), 54(2012).</li>
<li>Harrison, B., Zimmerman, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer-stimulated+ligation%3A+enhanced+ligation+of+oligo-+and+polynucleotides+by+T4+RNA+ligase+in+polymer+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions.</a> Nucleic Acids Research. 12 (21), 8235-8251 (1984).</li>
<li>Torchia, C., Takagi, Y., Ho, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Archaeal+RNA+ligase+is+a+homodimeric+protein+that+catalyzes+intramolecular+ligation+of+single-stranded+RNA+and+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Archaeal RNA ligase is a homodimeric protein that catalyzes intramolecular ligation of single-stranded RNA and DNA.</a> Nucleic Acids Research. 36 (19), 6218-6227 (2008).</li>
<li>Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Abundant+Class+of+Tiny+RNAs+with+Probable+Regulatory+Roles+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An Abundant Class of Tiny RNAs with Probable Regulatory Roles in Caenorhabditis elegans.</a> Science. 294 (5543), 858-862 (2001).</li>
<li>Yi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DGCR8-dependent+microRNA+biogenesis+is+essential+for+skin+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">DGCR8-dependent microRNA biogenesis is essential for skin development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (2), 498-502 (2009).</li>
<li>Leung, A. K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+Ago2+binding+sites+from+mouse+embryonic+stem+cells+with+and+without+mature+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of Ago2 binding sites from mouse embryonic stem cells with and without mature microRNAs.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 18 (2), 237-244 (2011).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

La metodología descrita en este documento hace uso de varias variables clave para maximizar la eficiencia de ligación, a saber, las altas concentraciones de PEG, el uso de enlazadores aleatorios, y alta concentración de enlazadores 2,6,9. Este enfoque permite a las bibliotecas de secuenciación de forma fiable cuantitativos de muestras de ARN total de 2. Hemos llevado a cabo múltiples titulaciones de ARN de entrada y han concluido que la metodología anterior es el más adecuado para las cantidades de...

Metodologías basadas secuenciación de alto rendimiento han sido ampliamente aplicado a muchas muestras biológicas en los últimos años en expansión en gran medida nuestra comprensión de la complejidad molecular de los sistemas biológicos 3,4. Sin embargo, la preparación de muestras de ARN de secuenciación de alto rendimiento a menudo imparte sesgos específicos inherentes a la metodología empleada, lo que limita la utilidad potencial de estas técnicas de gran alcance. Estos sesgos de métodos específicos han sido bien documentados para las preparaciones de bibliotecas basado en la ligadura, pequeño-ARN 1,2,5,6. Estos sesgos como resultado la variación de 1.000 veces en lee los números de miRNAs sintéticos equimolares, hacer inferencia de miARN abundancia a partir de datos de secuenciación tremendamente variable y propenso a errores. Estudios centrados en las propiedades de T4 ARN ligasas derivadas de fagos han documentado que las enzimas exhiben preferencias basadas en nucleótidos 7, que se manifiestan como bibliotecas sesgadas en experimentos de secuenciación de alto rendimiento <sarriba&gt; 1,2,8. A fin de minimizar los sesgos impartidas por ARN ligasas, múltiples estrategias se han empleado; macromolecular crowding 9, la aleatorización de la secuencia de nucleótidos en el adaptador que es proximal al sitio de la ligadura de 6, y el empleo de altas concentraciones de adaptador de ligadura 2. A través de una combinación de estos tres enfoques, hemos desarrollado un flujo de trabajo para la preparación imparcial de pequeñas bibliotecas de ARN compatibles para la secuenciación de alto rendimiento (Figura 1). Para las comparaciones directas entre los protocolos actuales y nuestro método optimizado, por favor consulte nuestro informe reciente 2. Este método produce optimizado la eficiencia de ligación de más del 95% tanto en 3 &#39;y 5&#39; pasos y permite la ligadura imparcial de pequeñas moléculas de ARN de las muestras sintéticas y biológicas 2.

<table><tbody><tr><td>Enlazador de 3' (5' fosforilado, 3' bloqueado)</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>personalizado</td><td></td></tr><tr><td>Enlazador de 5' Integrated</td><td>DNA Technologies</td><td>personalizado</td> 5<td>' bloqueado, purificado por HPLC</td></tr><tr><td>T4RNL2 (1-249 K227Q)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0351S</td><td>Especializado para la ligadura de adaptadores de ADN preadenilados</td></tr><tr><td>10x Tampón de ligadura (sin ATP)</td><td>Nueva Inglaterra Biolabs</td><td>Incluido con tampón de ligadura M0351S</td><td></td></tr><tr><td>10x (con ATP)</td><td>New England Biolabs</td><td>Incluido con M0204L</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT</td><td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenglicol (mol. Wt. 8,000)</td><td>New England Biolabs</td><td>Incluido con M0204L</td><td></td></tr><tr><td>Agua sin nucleasas</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td>Hemos encontrado que el agua recogida de un aparato de destilación es de calidad equivalente.</td></tr><tr><td>T4RNL1</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204L</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III RT kit</td><td>Invitrogen</td><td>18080-051&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kit de PCR Phusion</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Illumina RP1 cebador</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>personalizado</td><td>Información de secuencia disponible en Illumina</td></tr><tr><td>Illumina RT cebador</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>personalizado</td><td>Información de secuencia disponible en Illumina</td></tr><tr><td>Illumina cebador(es) de índiceIntegrated</td> <td>DNA Technologies</td><td>personalizado</td><td>Información de secuencia disponible en Illumina</td></tr><tr><td>40% Acrilamida</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP14081</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U6504</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amonio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametetilididiamina (TEMED)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>2x Tampón de carga de ARN desnaturalizante</td><td>New England Biolabs</td><td>incluido con M0351S</td><td></td></tr><tr><td>Hojas de afeitar</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>SpinX Tubos Centricon Costar</td><td></td><td>CLS8161</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microfuga de baja retención</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-320</td><td></td></tr><tr><td>Sybr Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S-11494</td><td></td></tr><tr><td>Kit de adenilación</td><td>New England Biolabs</td><td>E2610L</td><td></td></tr></tbody></table>

ligadura altamente eficiente de los pequeños arn moléculas de microarn cuantificación mediante secuenciación de alto rendimiento

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

Mirna clonación y secuenciación de alto rendimiento, denominado miR-Sec, destaca como un enfoque de todo el transcriptoma de cuantificar miRNAs con resolución de un solo nucleótido. Esta técnica captura miRNAs por fijar los adaptadores 3 &#39;y 5&#39; de oligonucleótidos a las moléculas de miARN y permite de novo miARN descubrimiento. El acoplamiento con potentes plataformas de secuenciación de próxima generación, el miR-Sec ha sido fundamental en el estudio de la biología de miRNA. Sin embargo, los sesgos significativos introducidos por pasos de ligación de oligonucleótidos han impedido que el miR-Sec de ser empleado como una herramienta de cuantificación exacta. Estudios previos demuestran que los sesgos en los métodos de miR-Seq actuales a menudo conducen a la cuantificación inexacta miARN con errores hasta 1.000 veces por algunos miRNAs 1,2. Para resolver estos sesgos impartidas por la ligadura de ARN, hemos desarrollado un pequeño método de ligadura de ARN que se traduce en eficiencias de ligación de más del 95% para ambos 3 &#39;y 5&#39; de ligación pasos. Evaluación comparativa de este improbado método de construcción de la biblioteca utilizando miRNAs sintéticos equimolares o diferencialmente mixtos, produce consistentemente lee los números con una desviación de menos de dos veces del valor esperado. Por otra parte, este método de gran eficacia miR-Sec permite precisa de todo el genoma de perfiles de miARN in vivo total de muestras de ARN 2.

Los resultados esperados por el método anterior deben ser inicialmente la observación de un solo turno de nucleótidos (aumento) en el tamaño del oligonucleótido de ADN que fue objeto de adenylation por Mes ARN ligasa (Figura 2). Después de 3 'de la ligación, la visualización del gel de acrilamida indica (véase la Figura 3) bandas de peso molecular alto afilados evidente en la región de nucleótidos 100-300 de la gel. Esto indica que la muestra de ARN total que se utiliza es de a...

Los microRNAs (miRNAs) son una clase ampliamente conservada de moléculas reguladoras. Aquí describimos un método de clonación de miRNA que se basa en dos potentes pasos de ligadura seguidos de una secuenciación de alto rendimiento. Nuestro método permite una cuantificación precisa de miRNAs en todo el genoma.

Ligadura Altamente Eficiente de los Pequeños ARN moléculas de microARN cuantificación mediante secuenciación de alto rendimiento

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

El objetivo general de este procedimiento es preparar de forma imparcial los microARN para la secuenciación de alto rendimiento. Esto se logra preparando o comprando primero oligonucleótidos de ADN que son competentes para la ligadura a los tres extremos principales del micro ARN. El segundo paso es ligar los tres oligonucleótidos principales del ADN a los tres extremos principales del micro ARN.A continuación, el producto de ligadura se purifica en gel y el enlazador de oligonucleótidos de ARN de cinco primos se liga al extremo de cinco primos del micro ARN. El paso final es convertir las moléculas híbridas en CDNA y luego amplificar el CDNA mediante la reacción en cadena de la polimerasa. En última instancia, la clonación de microARN y la secuenciación de alto rendimiento se utilizan para mostrar el perfil amplio del transcriptoma de los microARN de forma cuantitativa con una resolución de nucleótidos individuales.La principal ventaja de nuestra técnica sobre las técnicas existentes, como la microsecuenciación de microrrayos, es que nuestra técnica refleja mejor el nivel real de microrayos en una escala de laboratorio de transcripción amplia con una resolución de un solo nucleótido. Si bien este método puede proporcionar información sobre la biología de los microARN, también se puede aplicar a otras tecnologías de secuenciación de alto rendimiento como HC clip y RNA-Seq. Los oligonucleótidos de ADN para este procedimiento están diseñados para tres reacciones de ligadura de primos y deben tener un grupo fosfato de cinco primos, un dinucleótido aleatorio en el extremo de cinco primos y una citosina de tres primos que diluye los oligonucleótidos de ADN a 100 micromolares en agua libre de nucleasas.Ensamble la reacción de ventilación mediante la combinación de estos agentes reactivos: 200 picomoles del oligonucleótido enlazador principal, cuatro microlitros de tampón de ventilación de cinco ADN primario, cuatro microlitros de un TP, cuatro microlitros de M-T-H-R-N-A, ligasa y agua libre de nucleasas hasta un volumen final de 40 microlitros. Incubar la reacción a 65 grados centígrados durante una hora. Termine la reacción calentando a 85 grados centígrados durante cinco minutos.Precipite el enlazador TED añadiendo 2,5 volúmenes de etanol al 100% y un tercio de volumen de acetato de amonio 10 molar. Para eliminar un TP residual y evitar ligaduras imprevistas en futuras reacciones, mezcle la solución de alcohol, sal y oligonucleótidos hasta obtener homogeneidad girando a toda velocidad en una microcentrífuga a cuatro grados centígrados durante 20 minutos. Lave el pellet con etanol al 70% y seque al aire y vuelva a suspender el pellet en el volumen adecuado de agua libre de nucleasas para producir de 50 a 100 micromolares de un oligonucleótido ventilado.Confirmar una ventilación del oligonucleótido por electroforesis en un gel de poliacrilamida al 18%. Deje correr previamente el gel durante 30 minutos a 24 voltios centímetros de ancho de gel con un tampón de funcionamiento XTBE a temperatura ambiente. Una vez transcurridos los 30 minutos, enjuague los pozos con un tampón corriente.Los oligonucleótidos de ADN para este procedimiento están diseñados para tres reacciones de ligadura de primos y deben tener un grupo fosfato de cinco primos, un dinucleótido aleatorio en el extremo de cinco primos y una oxitocina de tres primos. Diluir los oligonucleótidos de ADN a 100 micromolares en agua libre de nucleasas. Ejecute el gel a 24 voltios por centímetro hasta que el azul de fenol bromo esté a tres cuartas partes del camino hasta la parte inferior del poste de gel.Tiñe el gel con una solución de oro cibernético en un XTBE y visualízalo en una caja de transluminador UV. Debería haber un cambio de un solo nucleótido en el tamaño del oligonucleótido de ADN que se sometió a una ventilación por la ligasa M-T-H-R-N-A para la reacción de ligadura de tres primos. Ensamble los siguientes componentes en hielo en este orden.Un microlitro de 50%PEG 8, 000 0,5 microlitros de tampón 10 XRNA ligasa. Un microlitro de un enlazador ventilado de tres célabres, 0,5 microlitros de inhibidor de ARN, 0,5 a ocho microgramos de ARN total, 0,5 microlitros de T, cuatro ARN ligasa, dos y agua libre de nucleasas hasta un volumen final de cinco microlitros. Mezcle la reacción pipeteando una vez que esté bien mezclada.Coloque la reacción en un termociclador con una tapa calentada. Ponga el bloque a 16 grados centígrados e incube durante cuatro horas. Tenga en cuenta que la reacción puede ampliarse hasta un volumen final de 20 microlitros sin pérdida de la eficiencia de la ligadura.Después de la ligadura de tres primos, mezcle la reacción con un volumen igual de dos tampones de carga XRNA a 70 grados centígrados durante cinco minutos y enfríe en hielo. Siguiente gel. Purificar la muestra en un gel de poliacrilamida al 15%.Deje correr previamente el gel a 24 voltios centímetros de ancho de gel durante al menos 30 minutos. Apague la fuente de alimentación y enjuague los pozos con tampón de funcionamiento. Cargue la muestra y haga funcionar el gel al mismo voltaje que la preejecución hasta que el bromo fenol soplado acabe de salir del gel.El producto deseado migrará cerca del xileno cian cuando se complete la electroforesis en gel de poliacrilamida. Coloque el gel en una bandeja limpia con un x tampón de funcionamiento y un x cyber gold y rock durante 15 minutos. Retire el gel de la placa de tinción y visualícelo en una caja de transluminador UV cubierta con una envoltura de plástico limpia.El producto de ligadura debe tener alrededor de 45 nucleótidos de longitud. Dado que este producto de ligadura generalmente no es visible, es importante incluir una muestra de ARN sintético de control positivo en el carril adyacente utilizando una cuchilla de afeitar limpia exci, la región que contiene el producto de ligadura. Guiado por las posiciones de la muestra de ARN sintético y los estándares de tamaño.Coloque el fragmento de gel para impuestos especiales en un tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitros. Perfore la parte inferior del tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitros con una aguja de calibre 30 y coloque el tubo perforador en una segunda centrífuga de tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros, limpia y de baja retención, durante cinco minutos aproximadamente 15,000 veces. G.Confirme visualmente que toda la rebanada de gel se ha movido a través del orificio en el tubo interior.Si es necesario, utilice una punta de pipeta limpia para acercar algunos fragmentos de gel al orificio. Deseche el tubo vacío de 0,5 mililitros y agregue 400 microlitros de tampón de columna con alto contenido de sal a la suspensión de acrilamida. Balancee el tubo a cuatro grados centígrados durante la noche del día siguiente.Transfiera la suspensión a una columna de centrifugación de acetato de celulosa de 0,22 micras utilizando una centrífuga de punta de pipeta de diámetro ancho durante tres minutos a temperatura ambiente unas 15.000 veces. G para recoger todo el líquido de la matriz de gel de acrilamida. Transfiera el líquido a un tubo limpio de 1,5 mililitros de baja retención que contenga un microlitro de una solución de glucógeno de 20 miligramos por mililitro.Agregue un volumen igual de isopropanol y una décima parte del volumen de acetato de sodio y mezcle la solución invirtiendo el tubo varias veces. Precipite en un congelador a menos 80 grados centígrados durante 20 minutos. Centrifugar a toda velocidad a cuatro grados centígrados durante 20 minutos.Para peletizar el ácido nucleico, retire el snat y lave con aire de etanol al 70%. Seque el pellet durante 10 minutos a temperatura ambiente y proceda directamente al paso de ligadura de cinco cebadores. Para comenzar este procedimiento, agregue los siguientes componentes al ácido nucleico granulado anteriormente, dos microlitros de PEG 8, 000, 0,5 microlitros de tampón de ARN ligasa, 0,5 microlitros de un TP, 0,5 microlitros de enlace, oligonucleótido de ARN y agua hasta un volumen final de cuatro microlitros.Mezcle esta muestra pipeteando hacia arriba y hacia abajo repetidamente durante un máximo de cinco minutos para asegurarse de que el pellet se haya resolubilizado por completo. Una vez que el gránulo esté en solución, transfiera el contenido a un tubo de PCR limpio que contenga un microlitro de una mezcla uno a uno de ARN inhibidor y T cuatro ARN ligasa uno mezclado mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo. Incubar la reacción en un termociclador a 37 grados centígrados durante cuatro horas.Cuando se complete la reacción, proceda inmediatamente a la síntesis de CD NA como se describe en el texto del protocolo después de la ligadura del enlazador a los tres extremos principales del ARN y el análisis de página de las reacciones. Las bandas afiladas de alto peso molecular son evidentes en la región de 100 a 300 nucleótidos del gel, lo que indica que la muestra total de ARN que se utiliza es de alta calidad. La señal muy brillante en la región de 25 nucleótidos del gel es un exceso de ARN sintético de tres enlaces principales no ligados indica una ligadura realizada con cinco picomoles de micro ARN sintético y un enlace de tres primos, que fue purificado en gel.Aquí se muestra un auto-radiograma de tres reacciones de ligadura de primos realizadas con P 32 5 primos y micro ARN sintético marcado. El número de horas que se permitió que la reacción continuara se indica en la parte superior, y los números en la parte inferior indican las cantidades ligadas como un porcentaje de la suma de los no ligados y ligados. Este auto-radiograma consta de cinco reacciones de ligadura de primarios realizadas con P 32 5 híbridos de micro ARN sintético con tres enlaces primarios marcados con el extremo principal.Los números en la parte inferior indican las cantidades ligadas como un porcentaje de la suma de no ligados y ligados, y revelan la importancia de usar una alta concentración de PEG 8, 000 pequeños R-N-A-D-N-A. Las bibliotecas compatibles para la secuenciación de alto rendimiento se generan posteriormente mediante PCR. El número adecuado de ciclos de PCR se determina empíricamente.En este ejemplo, el tamaño del producto de ADN esperado es de 146 pares de bases. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar correctamente en solo dos días. Al realizar esta técnica, es importante recordar que debe mantener todas las puntas y tubos libres de ARN.

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A continuación se describe un reverso transcriptasa optimizado multiplex PCR cuantitativa (QRT-PCR) en combinación con el protocolo de una plataforma de microfluidos como un costo y el tiempo efectivo instrumento de cribado de alto rendimiento para los microRNA (miRNA) los niveles de expresión, especialmente cuando se trabaja con cantidades limitadas de muestras.

Perfiles de microARN de alto rendimiento: Multiplex Optimizado QRT-PCR en la escala de nanolitros de la IFC Fluidigm dinámica ArrayTM

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MicroRNAs circulantes han surgido recientemente como biomarcadores prometedores y novedosos para varios tipos de cáncer y otras enfermedades. El objetivo de este artículo es discutir tres plataformas basados ​​en sondas diferentes en tiempo real PCR y métodos que están disponibles para cuantificar y determinar la abundancia de microRNAs en circulación.

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Aquí, describimos una estrategia paso a paso para aislar pequeños ARN, enriquecer para microARN y preparar muestras para la secuenciación de alto rendimiento. A continuación, describimos cómo procesar lecturas de secuencia y alinearlas con microRNAs, utilizando herramientas de código abierto.

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Ligadura Altamente Eficiente de los Pequeños ARN moléculas de microARN cuantificación mediante secuenciación de alto rendimiento

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