Ligadura Altamente Eficiente de los Pequeños ARN moléculas de microARN cuantificación mediante secuenciación de alto rendimiento

El objetivo general de este procedimiento es preparar de forma imparcial los microARN para la secuenciación de alto rendimiento. Esto se logra preparando o comprando primero oligonucleótidos de ADN que son competentes para la ligadura a los tres extremos principales del micro ARN. El segundo paso es ligar los tres oligonucleótidos principales del ADN a los tres extremos principales del micro ARN.

A continuación, el producto de ligadura se purifica en gel y el enlazador de oligonucleótidos de ARN de cinco primos se liga al extremo de cinco primos del micro ARN. El paso final es convertir las moléculas híbridas en CDNA y luego amplificar el CDNA mediante la reacción en cadena de la polimerasa. En última instancia, la clonación de microARN y la secuenciación de alto rendimiento se utilizan para mostrar el perfil amplio del transcriptoma de los microARN de forma cuantitativa con una resolución de nucleótidos individuales.

La principal ventaja de nuestra técnica sobre las técnicas existentes, como la microsecuenciación de microrrayos, es que nuestra técnica refleja mejor el nivel real de microrayos en una escala de laboratorio de transcripción amplia con una resolución de un solo nucleótido. Si bien este método puede proporcionar información sobre la biología de los microARN, también se puede aplicar a otras tecnologías de secuenciación de alto rendimiento como HC clip y RNA-Seq. Los oligonucleótidos de ADN para este procedimiento están diseñados para tres reacciones de ligadura de primos y deben tener un grupo fosfato de cinco primos, un dinucleótido aleatorio en el extremo de cinco primos y una citosina de tres primos que diluye los oligonucleótidos de ADN a 100 micromolares en agua libre de nucleasas.

Ensamble la reacción de ventilación mediante la combinación de estos agentes reactivos: 200 picomoles del oligonucleótido enlazador principal, cuatro microlitros de tampón de ventilación de cinco ADN primario, cuatro microlitros de un TP, cuatro microlitros de M-T-H-R-N-A, ligasa y agua libre de nucleasas hasta un volumen final de 40 microlitros. Incubar la reacción a 65 grados centígrados durante una hora. Termine la reacción calentando a 85 grados centígrados durante cinco minutos.

Precipite el enlazador TED añadiendo 2,5 volúmenes de etanol al 100% y un tercio de volumen de acetato de amonio 10 molar. Para eliminar un TP residual y evitar ligaduras imprevistas en futuras reacciones, mezcle la solución de alcohol, sal y oligonucleótidos hasta obtener homogeneidad girando a toda velocidad en una microcentrífuga a cuatro grados centígrados durante 20 minutos. Lave el pellet con etanol al 70% y seque al aire y vuelva a suspender el pellet en el volumen adecuado de agua libre de nucleasas para producir de 50 a 100 micromolares de un oligonucleótido ventilado.

Confirmar una ventilación del oligonucleótido por electroforesis en un gel de poliacrilamida al 18%. Deje correr previamente el gel durante 30 minutos a 24 voltios centímetros de ancho de gel con un tampón de funcionamiento XTBE a temperatura ambiente. Una vez transcurridos los 30 minutos, enjuague los pozos con un tampón corriente.

Los oligonucleótidos de ADN para este procedimiento están diseñados para tres reacciones de ligadura de primos y deben tener un grupo fosfato de cinco primos, un dinucleótido aleatorio en el extremo de cinco primos y una oxitocina de tres primos. Diluir los oligonucleótidos de ADN a 100 micromolares en agua libre de nucleasas. Ejecute el gel a 24 voltios por centímetro hasta que el azul de fenol bromo esté a tres cuartas partes del camino hasta la parte inferior del poste de gel.

Tiñe el gel con una solución de oro cibernético en un XTBE y visualízalo en una caja de transluminador UV. Debería haber un cambio de un solo nucleótido en el tamaño del oligonucleótido de ADN que se sometió a una ventilación por la ligasa M-T-H-R-N-A para la reacción de ligadura de tres primos. Ensamble los siguientes componentes en hielo en este orden.

Un microlitro de 50%PEG 8, 000 0,5 microlitros de tampón 10 XRNA ligasa. Un microlitro de un enlazador ventilado de tres célabres, 0,5 microlitros de inhibidor de ARN, 0,5 a ocho microgramos de ARN total, 0,5 microlitros de T, cuatro ARN ligasa, dos y agua libre de nucleasas hasta un volumen final de cinco microlitros. Mezcle la reacción pipeteando una vez que esté bien mezclada.

Coloque la reacción en un termociclador con una tapa calentada. Ponga el bloque a 16 grados centígrados e incube durante cuatro horas. Tenga en cuenta que la reacción puede ampliarse hasta un volumen final de 20 microlitros sin pérdida de la eficiencia de la ligadura.

Después de la ligadura de tres primos, mezcle la reacción con un volumen igual de dos tampones de carga XRNA a 70 grados centígrados durante cinco minutos y enfríe en hielo. Siguiente gel. Purificar la muestra en un gel de poliacrilamida al 15%.

Deje correr previamente el gel a 24 voltios centímetros de ancho de gel durante al menos 30 minutos. Apague la fuente de alimentación y enjuague los pozos con tampón de funcionamiento. Cargue la muestra y haga funcionar el gel al mismo voltaje que la preejecución hasta que el bromo fenol soplado acabe de salir del gel.

El producto deseado migrará cerca del xileno cian cuando se complete la electroforesis en gel de poliacrilamida. Coloque el gel en una bandeja limpia con un x tampón de funcionamiento y un x cyber gold y rock durante 15 minutos. Retire el gel de la placa de tinción y visualícelo en una caja de transluminador UV cubierta con una envoltura de plástico limpia.

El producto de ligadura debe tener alrededor de 45 nucleótidos de longitud. Dado que este producto de ligadura generalmente no es visible, es importante incluir una muestra de ARN sintético de control positivo en el carril adyacente utilizando una cuchilla de afeitar limpia exci, la región que contiene el producto de ligadura. Guiado por las posiciones de la muestra de ARN sintético y los estándares de tamaño.

Coloque el fragmento de gel para impuestos especiales en un tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitros. Perfore la parte inferior del tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitros con una aguja de calibre 30 y coloque el tubo perforador en una segunda centrífuga de tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros, limpia y de baja retención, durante cinco minutos aproximadamente 15,000 veces. G.Confirme visualmente que toda la rebanada de gel se ha movido a través del orificio en el tubo interior.

Si es necesario, utilice una punta de pipeta limpia para acercar algunos fragmentos de gel al orificio. Deseche el tubo vacío de 0,5 mililitros y agregue 400 microlitros de tampón de columna con alto contenido de sal a la suspensión de acrilamida. Balancee el tubo a cuatro grados centígrados durante la noche del día siguiente.

Transfiera la suspensión a una columna de centrifugación de acetato de celulosa de 0,22 micras utilizando una centrífuga de punta de pipeta de diámetro ancho durante tres minutos a temperatura ambiente unas 15.000 veces. G para recoger todo el líquido de la matriz de gel de acrilamida. Transfiera el líquido a un tubo limpio de 1,5 mililitros de baja retención que contenga un microlitro de una solución de glucógeno de 20 miligramos por mililitro.

Agregue un volumen igual de isopropanol y una décima parte del volumen de acetato de sodio y mezcle la solución invirtiendo el tubo varias veces. Precipite en un congelador a menos 80 grados centígrados durante 20 minutos. Centrifugar a toda velocidad a cuatro grados centígrados durante 20 minutos.

Para peletizar el ácido nucleico, retire el snat y lave con aire de etanol al 70%. Seque el pellet durante 10 minutos a temperatura ambiente y proceda directamente al paso de ligadura de cinco cebadores. Para comenzar este procedimiento, agregue los siguientes componentes al ácido nucleico granulado anteriormente, dos microlitros de PEG 8, 000, 0,5 microlitros de tampón de ARN ligasa, 0,5 microlitros de un TP, 0,5 microlitros de enlace, oligonucleótido de ARN y agua hasta un volumen final de cuatro microlitros.

Mezcle esta muestra pipeteando hacia arriba y hacia abajo repetidamente durante un máximo de cinco minutos para asegurarse de que el pellet se haya resolubilizado por completo. Una vez que el gránulo esté en solución, transfiera el contenido a un tubo de PCR limpio que contenga un microlitro de una mezcla uno a uno de ARN inhibidor y T cuatro ARN ligasa uno mezclado mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo. Incubar la reacción en un termociclador a 37 grados centígrados durante cuatro horas.

Cuando se complete la reacción, proceda inmediatamente a la síntesis de CD NA como se describe en el texto del protocolo después de la ligadura del enlazador a los tres extremos principales del ARN y el análisis de página de las reacciones. Las bandas afiladas de alto peso molecular son evidentes en la región de 100 a 300 nucleótidos del gel, lo que indica que la muestra total de ARN que se utiliza es de alta calidad. La señal muy brillante en la región de 25 nucleótidos del gel es un exceso de ARN sintético de tres enlaces principales no ligados indica una ligadura realizada con cinco picomoles de micro ARN sintético y un enlace de tres primos, que fue purificado en gel.

Aquí se muestra un auto-radiograma de tres reacciones de ligadura de primos realizadas con P 32 5 primos y micro ARN sintético marcado. El número de horas que se permitió que la reacción continuara se indica en la parte superior, y los números en la parte inferior indican las cantidades ligadas como un porcentaje de la suma de los no ligados y ligados. Este auto-radiograma consta de cinco reacciones de ligadura de primarios realizadas con P 32 5 híbridos de micro ARN sintético con tres enlaces primarios marcados con el extremo principal.

Los números en la parte inferior indican las cantidades ligadas como un porcentaje de la suma de no ligados y ligados, y revelan la importancia de usar una alta concentración de PEG 8, 000 pequeños R-N-A-D-N-A. Las bibliotecas compatibles para la secuenciación de alto rendimiento se generan posteriormente mediante PCR. El número adecuado de ciclos de PCR se determina empíricamente.

En este ejemplo, el tamaño del producto de ADN esperado es de 146 pares de bases. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar correctamente en solo dos días. Al realizar esta técnica, es importante recordar que debe mantener todas las puntas y tubos libres de ARN.