Preparación, Imaging, y cuantificación de la superficie bacteriana Motilidad ensayos

El objetivo general de este procedimiento es visualizar y cuantificar la motilidad de la superficie bacteriana llamada enjambre de una manera estándar y reproducible. Esto se logra preparando y curando primero las placas de motilidad de la superficie. El segundo paso es inocular las placas de ensayo de motilidad superficial con bacterias e incubar estas placas en un entorno controlado.

A continuación, se obtienen imágenes en tiempo real de los patrones de crecimiento bacteriano en los ensayos en placa. El paso final del procedimiento es procesar las imágenes para su cuantificación. En última instancia, este procedimiento proporciona un protocolo estandarizado para la preparación del ensayo de placa de motilidad superficial para generar información dinámica cuantitativa, como la tasa de expansión del enjambre o la distribución de la densidad del bioproducto para las bacterias modales de superficie.

Muchos grupos realizan ensayos de motilidad superficial. La principal ventaja de esta técnica es que proporcionamos un protocolo sistemático que minimiza las múltiples variables que pueden llevar a la inconsistencia. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la motilidad de la superficie bacteriana, como la forma en que las bacterias colonizan diferentes tipos de superficies.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la motilidad del enjambre de pseudomonas con algunas modificaciones, también se puede aplicar para estudiar otras bacterias modales de superficie. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque pequeños cambios en el protocolo o el entorno del laboratorio pueden influir en gran medida en los resultados de los ensayos de enjambre. La demostración del procedimiento estará a cargo de Morgan, un estudiante graduado de mi laboratorio.

Para comenzar el protocolo, prepare una mezcla agrícola combinando 200 mililitros de FAB menos medio de enjambre de sulfato de amonio, 0,9 gramos de agar noble y 0,2 gramos de ácidos de caino en una botella de medio de 500 mililitros. Use una placa para remover para mezclar bien los medios. A continuación, esterilice el medio en un autoclave configurado a 121,1 grados Celsius durante 22 minutos con una opción de ventilación rápida.

Inmediatamente después de la esterilización, apriete la tapa de la botella de medios para evitar la evaporación del agua. Coloque el medio en una placa de agitación magnética y enfríe el DEA a 50 grados centígrados en un entorno a temperatura ambiente con agitación activa. Si el agar se va a utilizar en un punto de tiempo experimental posterior, se puede mantener caliente en un baño de agua a 60 grados Celsius o en una incubadora durante 15 horas sin agitación activa.

Cuando el medio alcance aproximadamente 50 grados Celsius a dos mililitros de glucosa esterilizada con filtro, utilizando técnicas estériles estándar, mezcle bien con la barra de agitación magnética para evitar la formación de burbujas en el medio. En una campana, utilice una pipeta serológica estéril para alícuota 7,5 mililitros de edia en placas de Petri individuales de 60 milímetros. Si se desea una mayor superficie de enjambre, alícuota 25 litros de edia en placas de Petri de 100 milímetros.

Deje todos los platos sin apilar y revise la campana con un nivel de diana para garantizar una superficie horizontal uniforme para que el agar se solidifique. Para platos de 60 milímetros, deje a un lado las tapas de los platos y cure el agar destapado en la campana durante 30 minutos. Las placas más grandes de 100 milímetros requerirán un tiempo de curado más largo.

La humedad, el flujo de aire y la temperatura de un laboratorio determinado pueden requerir pruebas del tiempo de curado para un enjambre óptimo de su bacteria. Después del secado, los APLs deben inocularse inmediatamente con células que se hayan precultivado por separado para la fase de crecimiento deseada. Para comenzar, elija una colonia de bacterias aisladas de una placa LB fresca e inocule en seis mililitros de cultivo. Medio.

Incubar el cultivo durante la noche a 37 grados centígrados con agitación horizontal. Al día siguiente, inocule de uno a cinco microlitros del cultivo durante la noche sobre las placas de agar de enjambre secas pinchando la superficie del agar con un palillo de dientes estéril o una aguja de inoculación de alambre, dependiendo de la cepa de bacterias, transfiera las placas de ensayo del enjambre a una incubadora con una temperatura establecida en 30 grados Celsius, 37 grados Celsius, o 42 grados centígrados. Invierta las placas de modo que el exceso de humedad se condense en la tapa de la placa y no en el agar, equilibre las bacterias a temperaturas específicas de la tensión durante dos o cuatro horas justo antes de la obtención de imágenes de lapso de tiempo.

A continuación, transfiera las placas a la unidad de imagen in vivo de modo que las bacterias de la superficie agrícola queden hacia abajo, hacia la cámara invertida de la unidad. Llene todas las tapas de las placas de Petri con una pequeña cantidad de agua. A continuación, coloque cada tapa con el lado del agua hacia arriba encima de las placas AER invertidas.

Dentro de la unidad de imágenes, selle el recinto de imágenes para mantener un nivel de humedad constante, ajuste la configuración de imágenes de la unidad de imágenes y comience a obtener imágenes de lapso de tiempo de la actividad de enjambre. Después de obtener imágenes en tiempo real, la dinámica de enjambre de las bacterias se puede analizar utilizando un análisis de imagen estándar, como la Imagen J, en un experimento de motilidad de superficie. El análisis del contenido de humedad del agar justo antes de la inoculación es crucial para lograr resultados exitosos de enjambre.

De manera óptima, las placas AER facilitarán un punto de inoculación estrecho y mejorarán la actividad de enjambre bacteriano, mientras que las placas sobresecadas suprimirán la motilidad de la superficie además del contenido de humedad, la presencia o ausencia de aditivos de medios también puede afectar la actividad de enjambre de bacterias en función de la temperatura de incubación mediante la utilización de cepas de bacterias, que expresan luminiscencia o proteínas fluorescentes. La dinámica de la competencia entre dos especies de bacterias diferentes se puede capturar en un video de lapso de tiempo. Además, los cambios en la densidad celular local y la tasa de biosíntesis de lípidos promotores de la movilidad dentro del enjambre de bacterias también se pueden determinar y cuantificar con microscopía fluorescente de lapso de tiempo.

Siguiendo este procedimiento. Se pueden emplear otros métodos, como la microscopía confocal, para responder a preguntas sobre el comportamiento de las células individuales y generar un análisis detallado, microscópico y microscópico de la motilidad de la superficie bacteriana. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar un ensayo de enjambre estándar y reproducible y obtener un análisis completo de la motilidad de la superficie bacteriana mediante la preparación, el curado y la inoculación de ensayos de motilidad de la superficie y el procesamiento y análisis del resultado en patrones de crecimiento bacteriano.