Name: Visualización de la motilidad bacteriana basada en una reacción de color (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 44 s
Description: Aprende a detectar la motilidad bacteriana mediante el método de agar semisólido con TTC, una técnica colorimétrica simple que utiliza dehidrogenasas intracelulares. Este protocolo accesible permite diferenciar cepas como Staphylococcus aureus y Escherichia coli sin equipamiento especializado.

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Este estudio fue apoyado por el Desarrollo del Programa Académico Prioritario de las Instituciones de Educación Superior de Jiangsu (PAPD) y el Proyecto de Investigación de Reforma Docente de la Universidad Farmacéutica de China (2019XJYB18).

1. Preparación del medio semisólido
<ol><li>Agar semisólido tradicional
	<ol><li>Prepare el agar semisólido tradicional de acuerdo con la receta del medio de prueba de motilidad bacteriana utilizando los ingredientes básicos11. Disuelva 10 g de triptosa, 15 g de NaCl, 4 g de agar en suficiente agua destilada, ajuste el pH a 7.2 ± 0.2 y enrasar el volumen final a 1,000 mL.</li>
		<li>Autoclave el agar a 121 °C durante 20 min, y dispense en tubos de ensayo de 10 ml como un medio semisólido de 3 cm de altura.</li>
	</ol></li>
	<li>Agar semisólido tradicional con TTC
	<ol><li>Después de esterilizar en autoclave el medio semisólido convencional, enfriarlo a 50 °C, agregar 5 ml de solución estéril de TTC al 100 ml de medio, mezclar y dispensar en tubos de ensayo de 10 ml para formar un medio semisólido de 3 cm de altura.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Cepas bacterianas
NOTA: Se aislaron ochenta cepas del medio acuático y se identificaron utilizando un instrumento automatizado de identificación de bacterias (ver la Tabla de materiales), incluyendo Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp., Vibrio spp., Klebsiella pneumoniae y Aeromonas hydrophila (Tabla 1). Staphylococcus aureus (ver la Tabla de materiales) se utilizó como un control negativo inmóvil; Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa y Salmonella typhimurium (ver la Tabla de materiales) se utilizaron como cepas de control positivo.
<ol><li>Identificar las cepas bacterianas de prueba que se utilizarán para el análisis de la motilidad.</li>
	<li>Incluye controles negativos inmóviles y tensiones móviles de control positivo.</li>
</ol>3. Observación de la motilidad bacteriana mejorada por TTC
<ol><li>Recoger colonias individuales de bacterias problema de las placas de agar e inocularlas en los dos medios semisólidos anteriores (pasos 1.1.2 y 1.2.1) mediante punción con agujas inoculantes.</li>
	<li>Cultivar los tubos a 37 °C en la incubadora durante 24-48 h para observar los resultados.</li>
	<li>Observe el estado de crecimiento: caracterice las bacterias como inmóviles (-) si solo la línea de punción es roja. Caracterizar las bacterias como móviles (+) si el color rojo se extiende ligeramente hacia afuera a lo largo de la línea de punción12.</li>
</ol>4. Efecto de diferentes concentraciones en agar sobre la motilidad bacteriana
<ol><li>Prepare medios semisólidos que contengan agar 0.3%, 0.5% y 0.8% e inoculos por punción, como se describió anteriormente. Observe los resultados después de 24-48 h de incubación.</li>
</ol>

<ol><li>Jordan, E. O., Caldwell, M. E., Reiter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Bacterial motility.</a> Journal of Bacteriology. 27 (2), 165(1934).</li>
<li>Lai, S. L., Hou, H., Jiang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+motility+and+its+role+during+initial+stage+of+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial motility and its role during initial stage of pathogenesis.</a> Journal of Microbiology. 26 (5), in Chinese 68-70 (2006).</li>
<li>Ding, S. S., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+flagella-dependent+motility+and+biofilm+in+bacteria+-+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Microbiologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Relationship between flagella-dependent motility and biofilm in bacteria - A review.</a> Acta Microbiologica Sinica. 49 (4), in Chinese 417-422 (2009).</li>
<li>Zeng, J., Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+mechanism+of+bacterial+resistance+and+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Journal+of+Antibiotics%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the mechanism of bacterial resistance and tolerance.</a> Chinese Journal of Antibiotics. 45 (2), 113-121 (2020).</li>
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<li>McLaughlin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+colorimetric+microplate+test+of+phage+lysis+in+Salmonella+enterica%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Simple colorimetric microplate test of phage lysis in Salmonella enterica.</a> Journal of Microbiological Methods. 69 (2), 394-398 (2007).</li>
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<li>Tittsler, R. P., Sandholzer, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+semi-solid+agar+for+the+detection+of+bacterial+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">The use of semi-solid agar for the detection of bacterial motility.</a> Journal of Bacteriology. 31 (6), 575(1936).</li>
<li>Qian, Y., Tian, X. Y., Zhang, S. Y., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explore+the+influencing+factors+of+bacterial+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Health+Care+Today%22%5BJournal%5D)">Explore the influencing factors of bacterial motility.</a> Health Care Today. 6, 50-51 (2018).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filamentous+Phytophthora+pathogens+deploy+effectors+to+interfere+with+bacterial+growth+and+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Filamentous Phytophthora pathogens deploy effectors to interfere with bacterial growth and motility.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 581511(2020).</li>
<li>Kühn, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+arrangement+of+several+flagellins+within+bacterial+flagella+improves+motility+in+different+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Spatial arrangement of several flagellins within bacterial flagella improves motility in different environments.</a> Nature Communication. 9 (1), 5369(2018).</li>
<li>Mitchell, A. J., Wimpenny, J. W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+agar+concentration+on+the+growth+and+morphology+of+submerged+colonies+of+motile+and+non-motile+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The effects of agar concentration on the growth and morphology of submerged colonies of motile and non-motile bacteria.</a> Journal of Applied Microbiology. 83 (1), 76-84 (2010).</li>
<li>Xu, A., Zhang, M., Du, W., Wang, D., Ma, L. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+mechanism+for+how+sigma+factor+AlgT+and+transcriptional+regulator+AmrZ+inhibit+twitching+motility+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A molecular mechanism for how sigma factor AlgT and transcriptional regulator AmrZ inhibit twitching motility in Pseudomonas aeruginosa.</a> Environmental Microbiology. 23 (2), 572-587 (2021).</li>
<li>Bartley, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attachment+and+invasion+of+Neisseria+meningitidis+to+host+cells+is+related+to+surface+hydrophobicity%2C+bacterial+cell+size+and+capsule%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Attachment and invasion of Neisseria meningitidis to host cells is related to surface hydrophobicity, bacterial cell size and capsule.</a> PLoS One. 8, 55798(2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

La detección de la motilidad bacteriana por el método del medio semisólido se ve afectada por muchos factores13,14. Las condiciones de crecimiento bacteriano, como el oxígeno (aeróbico en la superficie del agar, no aeróbico en la parte inferior del tubo con el medio semisólido), el pH y la temperatura, pueden afectar la viabilidad de los flagelos bacterianos, lo que puede conducir a una motilidad reducida o incluso a la pérdida de la motilidad15...

La motilidad bacteriana juega un papel crítico en la patogenicidad bacteriana, la formación de biopelículas y la resistencia a los medicamentos1. La motilidad bacteriana está estrechamente asociada con la patogenicidad y es necesaria para la colonización bacteriana durante la infección temprana de las células huésped2. La formación de biopelículas está estrechamente relacionada con la motilidad bacteriana, donde las bacterias se adhieren a la superficie de los medios sólidos a través de la motilidad. Durante mucho tiempo se ha considerado que la motilidad bacteriana se correlaciona positivamente con la formación de biopelículas. Un alto grado de resistencia bacteriana a los medicamentos debido al biofilm puede conducir a infecciones persistentes que son una amenaza para la salud humana 3,4,5. Por lo tanto, es importante detectar la motilidad bacteriana. La prueba de motilidad bacteriana se utiliza principalmente para examinar la motilidad de diferentes formas de bacterias en el estado vivo, lo que puede determinar indirectamente la presencia o ausencia de flagelos y, por lo tanto, tiene un papel importante en la identificación de bacterias.
Existen métodos directos e indirectos para detectar la motilidad bacteriana6. Como las bacterias con flagelos muestran motilidad, es posible detectar si las bacterias son móviles indirectamente detectando la presencia o ausencia de flagelos. Por ejemplo, es posible detectar la motilidad indirectamente mediante microscopía electrónica y tinción flagelar para indicar que las bacterias son móviles. También es posible detectar por métodos directos, como la caída de suspensión y los métodos de punción semisólida. 
El método de punción semisólida comúnmente utilizado en los laboratorios de microbiología de pregrado para detectar la motilidad bacteriana inocula a las bacterias en la punción en el medio de agar semisólido que contiene 0.4-0.8% de agar, de acuerdo con la dirección del crecimiento bacteriano. Si las bacterias crecen a lo largo de la línea de punción para extenderse, aparecen rastros de crecimiento en forma de nube (en forma de cepillo), lo que indica la presencia de flagelos y, por lo tanto, motilidad. Si no hay rastros de crecimiento de la línea de perforación, la bacteria no es flagelada ni móvil. 
Sin embargo, este método tiene sus inconvenientes: las bacterias son incoloras y transparentes, la actividad flagelar se ve afectada por las características fisiológicas de las bacterias vivas y otros factores, y la concentración de agar y el pequeño diámetro del tubo de ensayo. Además, las bacterias aeróbicas solo son adecuadas para el crecimiento en la superficie del agar, lo que afecta la observación de la motilidad bacteriana. Por lo tanto, para mejorar este experimento, se agregó cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) (incoloro) al medio para establecer un método más confiable e intuitivo para determinar la motilidad bacteriana que el método actual de punción directa utilizando deshidrogenasas intracelulares para catalizar la formación de un producto rojo de TTC 7,8,9,10.

<table><tbody><tr><td>Bacto Agar</td><td>Difco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli</td><td>ATCC</td><td>ATCC25922</td><td>Control positivo</td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa</td><td>ATCC</td><td>ATCC27853</td><td>Control positivo</td></tr><tr><td>Salmonella typhimurium</td><td>ATCC</td><td>ATCC14028</td><td>Control positivo</td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus</td><td>ATCC</td><td>ATCC25923</td><td>Control inmóvil negativo</td></tr><tr><td>Triptosa</td><td>&nbsp; OXOID</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TTC</td><td>Sigma</td><td>298-96-4</td><td></td></tr><tr><td>VITEK 2 sistema automatizado de identificación microbiana</td><td>Bio M&eacute; Rieux</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualización de la motilidad bacteriana basada en una reacción de color

Visualizing Bacterial Motility Based on a Color Reaction

La motilidad bacteriana es crucial para la patogenicidad bacteriana, la formación de biopelículas y la resistencia a los medicamentos. La motilidad bacteriana es crucial para la invasión y/o diseminación de muchas especies patógenas. Por lo tanto, es importante detectar la motilidad bacteriana. Las condiciones de crecimiento bacteriano, como el oxígeno, el pH y la temperatura, pueden afectar el crecimiento bacteriano y la expresión de flagelos bacterianos. Esto puede conducir a una motilidad reducida o incluso a la pérdida de motilidad, lo que resulta en la evaluación inexacta de la motilidad bacteriana. Basado en la reacción de color del cloruro de 2,3,5-trifenil tetrazolio (TTC) por deshidrogenasas intracelulares de bacterias vivas, TTC se agregó al agar semisólido tradicional para la detección de la motilidad bacteriana. Los resultados mostraron que este método de agar semisólido TTC para la detección de la motilidad bacteriana es simple, fácil de operar y no involucra instrumentos grandes y costosos. Los resultados también mostraron que la mayor motilidad se observó en medio semisólido preparado con agar 0,3%. En comparación con el medio semisólido tradicional, los resultados son más fáciles de evaluar y más precisos.

Tanto las cepas estándar como las cepas aisladas se compararon para la detección de la motilidad, y los resultados se muestran en la Tabla 1. Debido a la ausencia de flagelos, Staphylococcus aureus y Klebsiella pneumoniae solo crecieron a lo largo de la línea inoculada en medios semisólidos tradicionales y TTC. En contraste, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli y Salmonella typhimurium mostraron crecimiento en todas las direcciones alrededor de la línea in...

Aquí, presentamos un protocolo para detectar la motilidad bacteriana basada en una reacción de color. Las ventajas clave de este método son que es fácil de evaluar y más preciso, y no requiere equipo especializado.

Visualización de la motilidad bacteriana basada en una reacción de color

Bacterial motility is crucial for bacterial pathogenicity, biofilm formation, and drug resistance. Bacterial motility is crucial for the invasion and/or ...

La detección de la motilidad bacteriana es importante porque la motilidad es crucial para la patogenicidad. El protocolo aquí descrito es un método fiable para la detección de la motilidad bacteriana, ya que se basa en la reacción de color de la TTC con las deshidrogenasas intracelulares de las bacterias vivas. El método de agar semisólido TTC para detectar la motilidad bacteriana es simple, fácil de operar y no involucra instrumentos grandes y costosos.El método puede ser utilizado por microbiólogos clínicos o investigadores para investigar bacterias patógenas. La demostración del procedimiento estará a cargo de Xiyi Zhuang, un experimentador senior de mi laboratorio. Para comenzar, prepare el medio semisólido tradicional agregando 10 gramos de Triptosa, 15 gramos de cloruro de sodio y cuatro gramos de agar en un volumen adecuado de agua destilada.Ajuste el pH a 7,2 y componga el volumen final a 1.000 mililitros. Esterilizar el medio en autoclave a 121 grados centígrados durante 20 minutos y dispensar el medio en tubos de ensayo de 10 mililitros a una altura de tres centímetros. Para preparar el medio TTC, enfríe el medio tradicional esterilizado en autoclave a 50 grados centígrados y luego agregue cinco mililitros de solución estéril de TTC al 1% a 100 mililitros de medio.Mezcle y dispense el medio en tubos de ensayo de 10 mililitros a una altura de tres centímetros. Recoger colonias individuales de bacterias de placas de agar e inocularlas en ambos medios semisólidos mediante punción con agujas de inoculación. Recuerde incluir las deformaciones no modales como controles negativos y las deformaciones modales como controles positivos.Para observar el efecto de la concentración de agar sobre la motilidad bacteriana, prepare medios semisólidos que contengan diferentes concentraciones de agar e inoculelos por punción. Incubar los tubos a 37 grados centígrados y observar los resultados después de 24 a 48 horas de incubación. Si solo la línea de punción es roja, caracterice las bacterias como no modales.Si el color rojo se extiende hacia afuera a lo largo de la línea de punción, caracterice las bacterias como modales. La motilidad bacteriana se comparó para varias cepas en medios semisólidos tradicionales y TTC y se resumió en esta tabla. Después de un cultivo de 24 horas en medio semisólido TTC, Staphylococcus aureus mostró crecimiento a lo largo de la línea inoculada.Mientras que, Escherichia coli mostró crecimiento en todas las direcciones alrededor de la línea inoculada. La mayor motilidad para Escherichia coli se observó en el medio semisólido TTC preparado con agar al 0,3% en el que el medio se volvió casi completamente rojo. En contraste, el área de difusión de rojo disminuyó en agar 0.5% y la difusión se prolongó con aumento de la concentración de agar a 0.8%Es importante ajustar el pH a 7.2 y enfriar el medio esterilizado en autoclave a 50 grados centígrados antes de la inoculación usando las agujas.Las bacterias deben inocularse por punción en el medio semisólido que contiene TTC. Es un método directo para detectar la motilidad bacteriana. También es posible detectar la motilidad indirectamente mediante microscopio electrónico y

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Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

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