Name: Las proteínas Análisis de inmunofluorescencia de endógenos y exógenos Centrómero-cinetocoro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 35 s
Description: Aprende a optimizar la localización y cuantificación de proteínas centroméricas-cinetocoro endógenas y exógenas en células humanas mediante inmunofluorescencia indirecta. Este protocolo permite estudiar la dinámica de CENP-A durante la división celular.

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Este trabajo fue apoyado por el NIH GM68418 subvención.

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

En los últimos años muchos estudios han desarrollado diferentes ensayos de microscopía cuantitativa de células fijadas. 42 El progreso en la biología centrómero-kinetochore a menudo requiere una comprensión de la función específica del centrómero o-kinetochore específico de proteínas de las cuales subcelular regulación espacial-temporal refleja las cambiantes funciones de estas proteínas durante el ciclo celular. Por lo tanto, aquí hemos desarrollado métodos de tinción de IIF y un ensayo cuantitativo IIF para...

&quot;Los centrómeros&quot; se define clásicamente como regiones de recombinación meiótica suprimida en genética y más tarde reconocidos como la constricción principal de cromosomas mitóticos, que desempeña un papel esencial en la segregación cromosómica precisa durante la mitosis. &quot;Kinetochores&quot; se describieron como las estructuras de capas múltiples que se unen a los microtúbulos en la superficie de centrómeros, como se revela por microscopía electrónica; &quot;cinetocoros&quot; se definen como más tarde el complejo macromolecular que se localiza en el centrómero de los cromosomas mitóticos. A pesar de una divergencia dramática de secuencias de ADN centroméricas entre los vertebrados, la estructura y composición kinetochore están muy conservadas. Se requiere una interacción dinámica entre los microtúbulos del huso y el cinetocoro fieles a la segregación de los cromosomas durante la mitosis, y defectos en la función del centrómero-cinetocoro plomo a aneuploidía y por lo tanto el cáncer. El centrómero en la mayoría de los eucariotasno tiene ninguna secuencia de ADN definida, pero se compone de grandes matrices (0,3-5 Mb) de ADN repetitivo alfoide consiste en ADN α-satélite de 171 pb. Excepto en la levadura en ciernes, la identidad centrómero se logra no por la secuencia de ADN, pero por la presencia de un nucleosoma especial que contiene la variante de la histona H3 CenH3 (centrómero Proteína A [CENP-A] en los seres humanos). 5 nucleosomas CENP-A localizar a la placa interior de los cinetocoros de mamíferos y 7 se unen al ADN α-satélite de 171 pb. centrómeros activos requieren que contiene CENP-A-nucleosomas para dirigir el reclutamiento de una red constitutiva centrómero-asociado (CCAN) y las proteínas del cinetocoro, que junto a regular la unión de los cromosomas al huso mitótico y la progresión del ciclo posterior a través del eje de control. A la luz de la evidencia anterior, se ha propuesto CENP-A sea de la marca epigenética del centrómero 8; sin embargo, el proceso por el cual CENP-A se incorporó into ADN centromérica y los factores responsables de esta incorporación aún no han sido bien caracterizados. Un dominio corto centrómero de segmentación (CATD) reside en la histona región de CENP-A veces, y la sustitución de la región correspondiente de H3 con la CATD es suficiente para H3 directa al centrómero. 9 Varios estudios sugieren papeles funcionales para después de la traducción modificación (PTM) de CENP-A 12-16; sin embargo, aún no se han elucidado los mecanismos moleculares de estos PTMs de CENP-A en la contratación a centrómeros. Hemos informado anteriormente de que se requiere la actividad ligasa Cul4A-RBX1-COPS8 E3 de CENP-A K124 ubiquitinación y localización de CENP-A a los centrómeros. 17 El descubrimiento y caracterización de proteínas kinetochore han dado lugar a una nueva comprensión en cuanto a la segregación cromosómica. 18 Más de 100 componentes del cinetocoro se han identificado en células de vertebrados por varios enfoques. 19,20 Un bajoDe pie de cómo cinetocoros ensamblan y función también viene de la caracterización de las funciones celulares de cada red centrómero-kinetochore proteínas y proteína-proteína dentro de las células. 19 visualización directa y formación de imágenes avanzado métodos en microscopía de fluorescencia proporcionan notable resolución de los componentes centrómero-cinetocoro y permiten la observación directa de los componentes moleculares específicos de los centrómeros y cinetocoros. Además, los métodos de inmunofluorescencia indirecta (IIF) tinción utilizando anticuerpos específicos son cruciales para estas observaciones. Sin embargo, a pesar de numerosos informes acerca de los protocolos IIF, pocos problemas discutidos en detalle de proteínas específicas centrómero-cinetocoro. 1-4 Por lo tanto, el desarrollo y la presentación de informes métodos de tinción IIF y un ensayo cuantitativo IIF un análisis específico de cada proteína centrómero-cinetocoro es extremadamente importante. En la tinción de IIF, se debe proceder con el protocolo de tinción para evitar la pérdida de la proteína de interés oel resto de la célula. Sin embargo, la fijación destruye sitios antigénicos de vez en cuando, y diferentes combinaciones de anticuerpo-antígeno funciona mal con un solo fijador, pero muy bien con otra, 21 y la elección de fijador depende en gran medida de la proteína (s) de interés. Por lo tanto, los diferentes métodos de fijadores son cruciales en la tinción de las proteínas del centrómero IIF-cinetocoro. Se han desarrollado métodos Aquí optimizadas de inmunofluorescencia indirecta (IIF) tinción y un ensayo para abordar localización de las proteínas del centrómero-kinetochore endógenos, incluyendo CENP-A y las proteínas de CENP-A exógenos bandera de etiquetado, y la cuantificación de estas proteínas en las células humanas. Estos métodos se pueden aplicar al análisis de proteínas centrómero-kinetochore en otras especies.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamin 2000</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>11668</td><td>reactivo de transfección I</td></tr><tr><td>Lipofectamin RNAiMAX</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>13778</td><td>reactivo de transfección II</td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>31985</td><td>Medios de suero reducidos, calientes en 37 grados; C baño de agua antes</td></tr><tr><td>de usar DMEM con alto contenido de glucosa (Dulbecco' Águila modificada' s medio)</td><td>Life Technologies/BioWhittaker</td><td>12-604</td><td>DMEM de alta glucosa, caliente en 37 &deg; C baño de agua antes de usar</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino, certificado, inactivado por calor, origen de EE. UU.</td><td>Life Technologies/Gibco</td><td>10082</td><td>FBS (suero fetal bovino)</td></tr><tr><td>Poly-L-Lisina SOLUCIÓN</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>P 8920</td><td>Poly-L-Lisina, 0,1% p/v, en agua</td></tr><tr><td>Agua destilada ultrapura</td><td>Life Technologies/Invitrogen/Gibco</td><td>10977</td><td>Agua estéril de grado de cultivo de tejidos&nbsp;</td></tr><tr><td>Micro Cover glass (22 mm x 22 mm)&nbsp;</td><td>Surgipath</td><td>105</td><td>Cubertor de vidrio (22 mm x 22 mm)&nbsp;</td></tr><tr><td>Clúster de cultivo celular de 6 pocillos</td><td>Fisher/Corning Incorporated</td><td>07-200-83</td><td>placa de poliestireno de 6 pocillos&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicilina, Estreptomicina; Líquido</td><td>Fisher/Gibco</td><td>15-140</td><td>Penicilina-estreptomicina</td></tr><tr><td>PAP PEN&nbsp;</td><td>Sitio de unión</td><td>AD100.1</td><td>Pluma de barrera hidrofóbica (para una barrera repelente al agua en la tinción inmunofluorescente)</td></tr><tr><td>Paclitaxel (Taxol)</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>T7402</td><td>Taxol para el análisis de células mitóticas</td></tr><tr><td>TN-16, inhibidor de microtúbulos (TN16)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-T120</td><td>TN16 para el análisis de células mitóticas</td></tr><tr><td>BSA (albúmina sérica bovina)</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>A7906</td><td>Reactivo bloqueante</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>T8787</td><td>Detergente para permeabilización</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>P6148</td><td>Fijador</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>D9542</td><td>Para tinción nuclear</td></tr><tr><td>p-fenilendiamina</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>P6001</td><td>Para medio de montaje</td></tr><tr><td>VWR Micro Slides, esmerilados</td><td>VWR International</td><td>48312-013</td><td>Micro portaobjetos&nbsp;</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-CENP-A</td><td>Stressgen/Enzo Life Sciences</td><td>KAM-CC006</td><td>Anticuerpo monoclonal de ratón; relación de dilución de 1:100 (IIF), 1:5000 (WB)</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-CENP-B</td><td>Novus Biologicals</td><td>H00001059-B01P</td><td>Anticuerpo monoclonal de ratón; relación de dilución de 1:200 (IIF, fijación de metanol/acetona)-1:400 (IIF, fijación de paraformaldehído)Anticuerpo</td></tr> <tr><td>anti-CENP-B&nbsp;</td><td>abcam</td><td>ab25734</td><td>Anticuerpo policlonal de conejo; relación de dilución de 1:200 (IIF, fijación de metanol/acetona)-1:400 (IIF, fijación de paraformaldehído)</td></tr><tr><td>Anticuerpo anticentrómero (ACA)</td><td>Fitzgerald Industries International, Inc.</td><td>90C-CS1058</td><td>Antisuero de centrómero humano; relación de dilución de 1:2000 (IIF)</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-CENP-H</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>BL1112 (A400-007A)</td><td>Anticuerpo policlonal de conejo; relación de dilución de 1:200 (IIF)</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-CENP-H</td><td>BD</td><td>612142</td><td>Anticuerpo monoclonal de ratón; relación de dilución de 1:200 (IIF)</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-CENP-I</td><td>N/A, Dr. Katusmi Kitagawa</td><td>N/A, Dr. Katusmi Kitagawa</td><td>Anticuerpo policlonal de conejo; relación de dilución de 1:1000 (IIF); Niikura et al., Oncogene, 4133-4146 (2006)</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-KNL1</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-89223</td><td>Anticuerpo policlonal de conejo; relación de dilución de 1:100 (IIF)</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-Hec1</td><td>Novus Biologicals / GeneTex</td><td>NB 100-338 / GTX70268</td><td>Anticuerpo monoclonal de ratón; relación de dilución de 1:100 (IIF)</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-Hec1</td><td>GeneTex</td><td>GTX110735</td><td>anticuerpo policlonal de conejo; relación de dilución de 1:100 (IIF)</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-Ska1</td><td>abcam</td><td>ab46826</td><td>Anticuerpo policlonal de conejo; relación de dilución de 1:100 (IIF)</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-Flag</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>F3165</td><td>Anticuerpo monoclonal de ratón; relación de dilución de 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB)</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-Flag</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>F7425</td><td>Anticuerpo policlonal de conejo; relación de dilución de 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB)</td></tr><tr><td>Anti-CUL4A anticuerpo</td><td>N/A, Dr. Pradip Raychaudhuri</td><td>N/A, Dr. Pradip Raychaudhuri</td><td>Anticuerpo policlonal de conejo; relación de dilución de 1:3000 (WB); Shiyanov et al., The Journal of biological chemistry, 35309-35312 (1999)</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-RBX1</td><td>Cell Signaling</td><td>4397</td><td>Anticuerpo policlonal de conejo; relación de dilución de 1:2000 (WB)</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-GAPDH</td><td>Chemicon</td><td>MAB374</td><td>Anticuerpo monoclonal de ratón; relación de dilución de 1:5000 (WB)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>A11001</td><td>anticuerpo secundario conjugado con fluoróforos (anticuerpo secundario purificado por afinidad)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>A11005</td><td>anticuerpo secundario conjugado con fluoróforos (anticuerpo secundario purificado por afinidad)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>A11008</td><td>anticuerpo secundario conjugado con fluoróforos (anticuerpo secundario purificado por afinidad)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>A11012</td><td>anticuerpo secundario conjugado con fluoróforos (anticuerpo secundario purificado por afinidad)</td></tr><tr><td>Leche en polvo descremada (sustituto aprobado de la leche en polvo de clavel)</td><td>Fisher Scientific NC9255871</td><td>(Reorden n.º 190915; Lote # 90629)</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia motorizado Leica DM IRE2 de leche descremada&nbsp;</td><td>Microscopio de fluorescencia motorizado</td> <td>Leica</td><td></td>&nbsp;</tr><tr><td>Lente de inmersión en aceite HCX PL APO 63x</td><td>Leica LEICA</td><td>HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS</td><td>63X lente de inmersión</td></tr> en <tr><td>aceite HCX PL APO 100x Lente de inmersión en aceite</td><td>Leica LEICA</td><td>HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE</td><td>100X Lente de inmersión en aceite</td></tr><tr><td>Leica EL6000 Fuente de luz compacta</td><td>Leica</td><td></td><td>Fuente de luz compacta externa para excitación fluorescente</td></tr><tr><td>ORCA-R2 Cámara CCD digital&nbsp;</td>Cámara CCD digital <td>Hamamatsu</td><td>C10600-10B</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Openlab versión 5.5.2 Software de imágenes científicas&nbsp;</td><td>Perkin Elmer/Improvision</td><td></td><td>Para la observación, adquisición, cuantificación y análisis de imágenes</td></tr><tr><td>Velocity versión 6.1.1 Software de análisis de imágenes 3D&nbsp;</td><td>Perkin Elmer/Improvision</td><td></td><td>Para la observación, adquisición, cuantificación y análisis</td></tr><tr><td>de imágenes Cóctel completo de inhibidores de proteasa sin EDTA</td><td>Roche</td><td>11873580001/11836170001</td><td>Comprimidos de cóctel de inhibidores de proteasa</td></tr><tr><td>PlusOne 2-D Quant Kit</td><td>Amersham Biosciences</td><td>80-6483-56</td><td>Reactivo de ensayo de proteínas comercial I para la medición de la concentración de proteínas (compatible con SDS</td></tr> <tr><td>al 2%)Bio-Rad Protein Assay</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td>Reactivo de ensayo de proteínas comercial II para la medición de la concentración de proteínas (compatible con SDS al 0,1%)</td></tr><tr><td>Immobilon-FL</td><td>EMD Millipore IPFL00010</td><td></td><td>membrana de PVDF para la transferencia</td></tr><tr><td>IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgG</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-32210</td><td>IR anticuerpo secundario conjugado con colorante fluorescente (anticuerpo secundario purificado por afinidad); relación de dilución de 1:20000 (IIF)</td></tr><tr><td>IRDye 680 IgG anti-conejo de cabra Li-Cor</td><td>Biosciences</td><td>926-32221</td><td>Anticuerpo secundario conjugado con colorante fluorescente IR (anticuerpo secundario purificado por afinidad); relación de dilución de 1:20000 (IIF)</td></tr><tr>Anticuerpo secundario conjugado <td>DyLight 549</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI35507</td><td>DyLightAnticuerpo secundario conjugado con colorante fluorescente IR (anticuerpo secundario purificado por afinidad); relación de dilución de 1:20000 (IIF)</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario conjugado con DyLight 649</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI35565</td><td>DyLightAnticuerpo secundario conjugado con colorante fluorescente IR (anticuerpo secundario purificado por afinidad); relación de dilución de 1:20000 (IIF)</td></tr><tr><td>Anticuerpo</td> secundario conjugado con HRP Santa <td>Cruz</td><td>SC-2005</td><td>anticuerpo secundario conjugado con HRPanticuerpo secundario conjugado con dyLightAnticuerpo secundario conjugado con colorante fluorescente IR (secundario purificado por afinidad anticuerpo); relación de dilución de 1:10000 (IIF)</td></tr><tr><td>IgG-HRP anti-conejo</td><td>de cabra Santa Cruz</td><td>SC-2004</td><td>Anticuerpo secundario conjugado con HRPanticuerpo secundario conjugado con dyLightAnticuerpo secundario conjugado con colorante fluorescente IR (anticuerpo secundario purificado por afinidad); relación de dilución de 1:10000 (IIF)</td></tr><tr><td>Openlab versión 5.5.2. Software de Imágenes Científicas&nbsp;</td><td>Improvision/PerkinElmer</td><td></td><td>Software A</td></tr><tr><td>Volocity versión 6.3 Software de análisis de imágenes 3D (Volocity Acquisition)</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Software B1</td></tr><tr><td>Volocity versión 6.3 Software de análisis de imágenes 3D (Cuantificación de volocity)</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Software B2</td></tr><tr><td>Branson SONIFIER 450</td><td></td><td></td><td>Sonicator</td></tr><tr><td>Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Sólido, Rosca de 9,5 mm</td><td>VWR Scientific Products Inc.</td><td>&nbsp; 33995-325</td><td>Bocina disruptora para sonicación</td></tr><tr><td>Branson Ultrasonics sonicador Microtip Tapered 6,5 mm</td><td>VWR Scientific Products Inc.</td><td>&nbsp; 33996-185</td><td>Microtip para sonicación</td></tr><tr><td>Odyssey CLx Sistema de imágenes infrarrojas&nbsp;</td><td>LI-COR Biosciences Sistema de</td><td>imágenes infrarrojas para la detección de</td><td></td> inmunoblot</tr><tr><td>Software de análisis de estudio de imágenes Ver 4.0&nbsp;</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>Software C</td>Generador de imágenes moleculares <td></td></tr><tr><td>Sistema Versadoc MP4000&nbsp;</td><td>Generador de imágenes de quimioluminiscencia</td> <td>Bio-Rad</td><td></td> para la detección de inmunoblot</tr><tr><td>Cantidad Un software de análisis 1-D&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Software D</td></tr><tr><td>SuperSignal West Femto Sustrato de máxima sensibilidad</td><td>Thermo</td><td>34095</td><td>Sustrato quimioluminiscente mejorado (ECL) ultrasensible</td></tr></tbody></table>

las proteínas análisis de inmunofluorescencia de endógenos y exógenos centrómero-cinetocoro

 Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

"Centrómeros" y "cinetocoros" se refieren al sitio donde los cromosomas se asocian con el huso durante la división celular. La visualización directa de las proteínas centrómero-cinetocoro durante el ciclo celular sigue siendo una herramienta fundamental en la investigación de los mecanismos de estas proteínas. Los métodos avanzados de obtención de imágenes en microscopía de fluorescencia proporcionan una resolución notable de los componentes del centrómero-cinetocoro y permiten la observación directa de componentes moleculares específicos de los centrómeros y cinetocoros. Además, los métodos de tinción inmunofluorescente indirecta (IIF) con anticuerpos específicos son cruciales para estas observaciones. Sin embargo, a pesar de los numerosos informes sobre los protocolos IIF, pocos discutieron en detalle los problemas de las proteínas específicas del centrómero-cinetocoro. 1-4 Aquí reportamos protocolos optimizados para teñir proteínas endógenas de centrómero-cinetocoro en células humanas mediante el uso de fijación de paraformaldehído y tinción de IIF. Además, reportamos protocolos para la detección de proteínas CENP-A exógenas marcadas con Flag en células humanas sometidas a fijación de acetona o metanol. Estos métodos son útiles para detectar y cuantificar proteínas endógenas centrómero-cinetocoro y proteínas CENP-A marcadas con Flag, incluidas las de las células humanas.

El análisis de inmunofluorescencia de endógena CENP-A es compatible con la hipótesis de que se requiere Cul4A-E3 ligasa para la localización de CENP-A a centrómeros Nuestros estudios recientes demostraron que se requiere la actividad ligasa Cul4A-RBX1-COPS8 E3 para la ubiquitinación de la lisina 124 (K124) en el CENP-A y localización de CENP-A a los centrómeros. 17 Inicialmente, el complejo de interfase-centrómero (ICEN) fue aislado por anti-CENP-a: inm...

Aquí reportamos protocolos para detectar proteínas endógenas y exógenas de centrómero-cinetocoro en células humanas y cuantificar estos niveles de proteínas en centrómeros-cinetocoros mediante tinción inmunofluorescente indirecta mediante el uso de fijación (fijación de paraformaldehído, acetona o metanol).

Las proteínas Análisis de inmunofluorescencia de endógenos y exógenos Centrómero-cinetocoro

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

El objetivo general de este ensayo inmunofluorescente indirecto es optimizar la localización y cuantificación de proteínas endógenas y exógenas del cinetocoro-centrómero, incluyendo la proteína A del centrómero y proteínas CENP-A exógenas marcadas con etiqueta flag en células humanas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre cómo identificar y cuantificar las proteínas del cinetocoro-centrómero. La principal ventaja de esta técnica es que puede utilizarse para cuantificar diferentes niveles de expresión del cinetocoro-centrómero dependiendo de la anafase de interés seleccionada.18 horas después de sembrar, lave las células cultivadas una vez con PBS y agregue 500 microlitros de medio con suero reducido a cada pocillo de la placa de cultivo de poliestireno de seis pocillos. A continuación, transfecte las células en cada pocillo con una solución recién preparada de la mezcla A y B e incube los cultivos a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Después de cuatro horas y media, cambie el medio por DMEM con alta glucosa suplementado con FBS y antibióticos, y regrese la placa al incubador de cultivo celular.48 a 72 horas después, aspire el medio de cultivo celular y enjuague las células una vez con PBS, agregando la solución salina por los lados de los pocillos de cultivo para evitar perturbar las células. Luego, fije las células con paraformaldehído al 4 % durante 30 minutos a 4 grados Celsius. Al final del período de fijación, enjuague las células dos veces con tampón Kb2 y permeabilice las muestras en tampón Kb1 durante 30 minutos a temperatura ambiente.Luego, lave las células una vez con tampón Kb2 y bloquee cualquier unión no específica mediante la adición de tampón Kb2 fresco. Después de cinco minutos a temperatura ambiente, use pinzas para retirar las cubreobjetos sembradas de cada uno de los pocillos, y utilice un bolígrafo de barrera hidrofóbica para trazar barreras hidrofóbicas alrededor de cada muestra de cubreobjeto. Transfiera las cubreobjetos a una nueva placa de poliestireno de seis pocillos e introduzca las muestras en el anticuerpo primario adecuado durante una hora a 37 grados Celsius.Luego, lave las células tres veces con tampón Kb2 y márquelas con el anticuerpo secundario adecuado durante otra hora a 37 grados Celsius. Al final de la incubación, lave las muestras con cinco lavados de 6 minutos en tampón Kb2. A continuación, marque los núcleos celulares con tampón Kb3 que contiene DapE durante cinco minutos a temperatura ambiente, seguido de uno o dos lavados en tampón Kb2 y rellene nuevamente los pocillos con tampón Kb2.Ahora coloque una gota de medio de montaje en el centro de un portaobjetos para cada cubreobjetos con células, y elimine cualquier líquido de las muestras celulares. Finalmente, coloque cuidadosamente cada muestra en el centro de uno de los portaobjetos preparados y retire el exceso de medio de montaje con una toalla de papel. Como se observó en este experimento representativo, los niveles de expresión proteica endógena de CENP-A en los lisados totales de células transfectadas con siRNA contra CUL4A fueron similares a los niveles de expresión de CENP-A en células transfectadas con siRNA contra luciferasa.Además, los niveles proteicos de CENP-A endógena en los lisados totales de células transfectadas con siRNA contra RBX1 fueron similares a los niveles de CENP-A endógena en células transfectadas con siRNA contra Luciferasa, lo que sugiere que la ligasa E3 CUL4A RBX1 es necesaria para la localización de CENP-A en los centrómeros. Las mutaciones en las lisinas de CENP-A pierden su capacidad de localizarse dentro de los centrómeros, lo que indica que la ubiquitinación de CENP-A en K124 es esencial para su localización en los centrómeros. Importante, la fusión exógena de monoubiquitina a la proteína CENP-A rescató la deslocalización del mutante CENP-A K124R, restableciendo la proteína en su ubicación centrómerica.Una vez dominados, los procedimientos de fijación celular y tinción inmunofluorescente pueden completarse en cinco o seis horas si se realizan adecuadamente. Recuerde aplicar suavemente todas las soluciones sobre los lados de los pocillos para que las células no se desprendan de sus cubreobjetos durante el lavado o la inmersión de las muestras. No olvide que trabajar con paraformaldehído caliente fuera de un cuarto ventilado o con materiales inflamables cerca del fuego puede ser extremadamente peligroso, y que siempre se deben tomar las precauciones adecuadas al realizar este procedimiento.

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Investigación

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Biology

Biología

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Aprende a optimizar la localización y cuantificación de proteínas centroméricas-cinetocoro endógenas y exógenas en células humanas mediante inmunofluorescencia indirecta. Este protocolo permite estudiar la dinámica de CENP-A durante la división celular.

Las proteínas Análisis de inmunofluorescencia de endógenos y exógenos Centrómero-cinetocoro

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