Las proteínas Análisis de inmunofluorescencia de endógenos y exógenos Centrómero-cinetocoro

El objetivo general de este ensayo inmunofluorescente indirecto es optimizar la localización y cuantificación de las proteínas centrómeras-cinetocoro endógenas y exógenas, incluida la proteína A del centrómero y las proteínas CENP-A exógenas marcadas con banderas en células humanas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre cómo identificar y cuantificar las proteínas centrómero-cinetocoro. La principal ventaja de esta técnica es que se puede utilizar para cuantificar diferentes niveles de expresión de centrómero-cinetocoro en función de la anafase de interés seleccionada.

18 horas después de la siembra, lavar las células cultivadas una vez con PBS y agregar 500 microlitros de medio sérico reducido a cada pocillo de la placa de cultivo de poliestireno de seis pocillos. A continuación, transfecte las células de cada pocillo con una solución de mezcla A y B recién preparada e incube los cultivos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Después de cuatro horas y media, cambie el DMEM de glucosa media a alta suplementado con FBS y antibióticos y devuelva la placa a la incubadora de cultivo celular.

De 48 a 72 horas después, aspire el medio de cultivo celular y enjuague las células una vez con PBS, agregando la solución salina por los lados de los pocillos de cultivo para evitar alterar las células. A continuación, fije las células con paraformaldehído al 4% durante 30 minutos a 4 grados centígrados. Al final del período de fijación, enjuague las células dos veces con tampón Kb2 y permeabilice las muestras en tampón Kb1 durante 30 minutos a temperatura ambiente.

A continuación, enjuague las células una vez con tampón Kb2 y bloquee cualquier unión no específica con la adición de tampón Kb2 nuevo. Después de cinco minutos a temperatura ambiente, use fórceps para quitar los cubreobjetos sembrados de cada uno de los pocillos y use un bolígrafo de barrera hidrofóbica para dibujar barreras hidrofóbicas alrededor de cada muestra de cubreobjetos. Transfiera los cubreobjetos a una nueva placa de poliestireno de seis pocillos y sumerja las muestras en el anticuerpo primario apropiado durante una hora a 37 grados centígrados.

A continuación, enjuague las células tres veces con tampón Kb2 y etiquételas con el anticuerpo secundario adecuado durante otra hora a 37 grados centígrados. Al final de la incubación, enjuague las muestras con cinco lavados de 6 minutos en tampón Kb2. A continuación, etiquete los núcleos celulares con tampón Kb3 que contenga DapE durante cinco minutos a temperatura ambiente, seguido de uno o dos lavados en tampón Kb2 y rellenando los pocillos con tampón Kb2.

Ahora coloque una gota de medio de montaje en el centro de un portaobjetos de microscopio para cada cubreobjetos de células y elimine cualquier líquido de las muestras de células. Finalmente, coloque con cuidado cada muestra en el centro de uno de los portaobjetos de microscopio preparados y retire cualquier exceso de medio de montaje con una toalla de papel. Como se observó en este experimento representativo, los niveles de expresión endógena de la proteína CENP-A en el total de lisados celulares de las células transfectadas con siRNA de CUL4A fueron similares a los niveles de expresión de CENP-A en las células transfectadas de siRNA de luciferasa.

Además, los niveles de proteínas de CENP-A endógeno en el total de lisados celulares de las células transfectadas con siRNA RBX1 fueron similares a los niveles endógenos de CENP-A de las células transfectadas con siRNA de luciferasa, lo que sugiere que la ligasa CUL4A RBX1 E3 es necesaria para la localización de CENP-A en los centrómeros. Los mutantes de lisina CENP-A pierden su capacidad de localizarse dentro de los centrómeros, lo que sugiere que la ubiquitilación de CENP-A K124 es esencial para la localización de CENP-A en los centrómeros. Es importante destacar que la fusión exógena de monoubiquitina de la proteína CENP-A rescató el mutante de deslocalización CENP-A K124R, devolviendo la proteína a su ubicación centromérica.

Una vez dominados, los procedimientos de fijación celular y tinción inmunofluorescente pueden completarse en cinco o seis horas si se realizan correctamente. Recuerde aplicar suavemente todas las soluciones en los lados de los pocillos para que las células no se desprendan de sus cubreobjetos al enjuagar o sumergir las muestras. No olvide que trabajar con paraformaldehído caliente fuera de una habitación ventilada o que los materiales inflamables cerca del fuego pueden ser extremadamente peligrosos y que siempre se deben tomar las precauciones adecuadas al realizar este procedimiento.