Introducción de mutaciones puntuales en células madre pluripotentes humanas mediante la edición perfecta del genoma

La edición de genes en células madre pluripotentes humanas es un desafío. Este protocolo proporciona el procedimiento detallado para la edición del genoma en estas células utilizando un caso Cas-90 emparejado combinado con el vector objetivo. Es fiable y fácil de seguir.

La principal ventaja de este protocolo es que la edición genómica es perfecta. La selección en dos pasos ayuda a aumentar las células objetivo y ha hecho que el cribado de genotipado sea más eficiente. Mantener células madre pluripotentes humanas en superficies codificadas con laminina 21 recombinante en medio mTeSR1.

Las células deben alcanzar un 70 a 85% de confluencia, 72 horas después de una relación de división de uno a tres. El día de la transfección, cubra suficientes pocillos de una placa de 24 pocillos con 300 microlitros de la solución de laminina 521 e incube la placa a 37 grados centígrados durante al menos dos horas. Después de la incubación, retire suavemente la solución de recubrimiento e inmediatamente agregue 300 microlitros de medio mTeSR1 fresco, complementado con 10 inhibidores de ROCK micromolares a cada pocillo.

A continuación, vuelva a colocar la placa en la incubadora. Saque las células madre pluripotentes humanas de la incubadora. Retire el medio gastado y lave las células una vez con un mililitro de DPBS estéril.

A continuación, añada un mililitro de reactivo de disociación celular suave a cada pocillo e incube a 37 grados centígrados durante seis a ocho minutos para disociar las células. Golpee suavemente la placa para asegurarse de que las células puedan desprenderse fácilmente. A continuación, utilice una punta P1000 para levantar las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo.

Agregue dos mililitros de medio mTeSR1 con inhibidor de ROCK para terminar la disociación. Mezcle bien la suspensión y transfiérala a un tubo de 50 mililitros. Centrifugar las células a 200 G durante tres minutos.

A continuación, retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en dos mililitros de medio mTeSR1 con inhibidor de ROCK. Cuente las células con un hemocitómetro y azul de tripano. Transfiera de 800.000 a 1 millón de células a un tubo de 1,5 mililitros para cada reacción de nucleofección y centrifuérrelas a 200 g durante tres minutos.

A continuación, aspire cuidadosamente el sobrenadante. Mezcle tres microgramos de los plásmidos de expresión de ARN guía única Cas-9n emparejados y cinco microgramos de plásmido vectorial objetivo en 100 microlitros de solución de nucleofección mixta del kit de nucleofección de células madre humanas. Prepare también una mezcla de plásmidos de control GFP.

Vuelva a suspender las células con la mezcla de ADN y transfiéralas a una cubeta de electroporación, asegurándose de evitar las burbujas de aire. Electroporar las células con el dispositivo de nucleofección utilizando la condición optimizada para células madre pluripotentes humanas. Agregue inmediatamente 500 microlitros de medio mTeSR1 fresco y tibio suplementado con 10 inhibidores micromolares de ROCK a las celdas electroporadas.

Luego transfiera la mezcla a dos pocillos de la placa de 24 pocillos previamente preparada. Coloque la placa en una incubadora a 37 grados centígrados suministrada con un 5% de dióxido de carbono para permitir que las células se recuperen. Reemplace el medio de mantenimiento celular después de 12 a 16 horas, retirando el inhibidor de ROCK si las células establecen contacto célula a célula.

Después de 24 a 48 horas, verifique la eficiencia de la nucleofección examinando la expresión de GFP en las células de control. Comience a seleccionar células complementando el medio mTeSR1 con un microgramo por mililitro de puromicina, 48 horas después de la nucleofección. Después de 72 horas, suplementar el medio con 0,5 microgramos por mililitro de puromicina.

Si la confluencia celular es inferior al 30%, también complemente el medio con un inhibidor de ROCK de 10 micromolares. De cuatro a seis días después del paso de la nucleofección, las células resistentes a la puromicina a 10 a 15 placas de 96 pocillos a una concentración de 0,8 células por pocillo. Asegurándose de complementar el medio con inhibidor de ROCK y puromicina.

Mantenga las celdas a 37 grados centígrados y 10% de dióxido de carbono durante 10 a 12 días para formar colonias derivadas de células individuales. Completar el medio siete días después de la siembra. Marque los pocillos que contengan una sola colonia y reemplace el medio con medio mTeSR1 fresco, que contiene 0,5 microgramos por mililitro de puromicina, pero sin inhibidor de ROCK.

Cultive las células durante dos días más a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Luego cambie el medio por pozos que contengan colonias indiferenciadas. Raspe suavemente las colonias y transfiera la suspensión celular de una colonia a dos pocillos nuevos en placas separadas de 96 pocillos.

Uno para el genotipado y otro para el mantenimiento. Una vez que la confluencia de las células genotipificadas alcance el 50% o más, deseche el medio gastado y lave las células una vez con DPBS. Lisar las células con tampón de lisis Bradley y aislar el ADN genómico de cada pocillo.

Después de realizar la PCR de tres uniones de cebadores y secuenciar los productos, mantenga las colonias con el genotipo correcto y deseche el resto. Expanda las colonias correctas bajo selección continua de puromicina y congélelas lo antes posible. Este protocolo se utilizó para introducir dos mutaciones puntuales en el Exon8 del gen del factor nuclear cuatro alfa de los hepatocitos.

Se utilizó un método de PCR basado en tres cebadores para detectar células correctamente dirigidas, y se realizó una secuenciación Sanger para confirmar los resultados de la PCR. Después de la extracción del casete de selección, la región modificada se secuenció nuevamente para confirmar la introducción correcta de las mutaciones puntuales deseadas. Se seleccionaron las colonias con el genotipo correcto y se caracterizaron las células antes de su posterior análisis.

Las células editadas poseen la misma morfología que las células parentales y expresan marcadores representativos de células madre pluripotentes humanas, incluidos los factores de transcripción Nanog y Oct4, así como marcadores de superficie celular, SSEA-4 y TRA-160. Al intentar este procedimiento, es importante recordar verificar la confluencia celular después de la selección de puromicina durante las primeras 24 horas. Es esencial complementar la mediana con un inhibidor de ROCK.

Si la confluencia de células es inferior al 30% para mantener las células en funcionamiento. Una vez que se han establecido las líneas de células madre pluripotentes editadas en el genoma, se pueden utilizar para estudiar la función de los genes o la diferenciación dirigida. Esta técnica allana el camino para que los investigadores estudien diferentes cuestiones, como la función específica de los genes o la corrección génica dirigida a enfermedades genéticas.