Name: Largo Plazo intravital Multifotónica de imágenes de microscopía de células inmunitarias en sanos y enfermos de hígado utilizando ratones CXCR6.Gfp Reporter (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Aprende microscopía intravital multifotónica para estudiar la migración de leucocitos en hígado inflamado usando ratones CXCR6.Gfp. Este método permite imaginar células inmunitarias a largo plazo con alta resolución.

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Los autores agradecen al Centro de Animales del Hospital Universitario de Aquisgrán por su apoyo técnico. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Alemana de Investigación (DFG Ta434/2-1, DFG SFB/TRR 57) y por el Centro Interdisciplinario de Investigación Clínica (IZKF) de Aquisgrán. Este trabajo contó con el apoyo de la Instalación Central "Imágenes de dos fotones", una Instalación Central del Centro Interdisciplinario de Investigación Clínica (IZKF) de Aquisgrán dentro de la Facultad de Medicina de la Universidad RWTH de Aquisgrán.

NOTA: Los experimentos se realizaron de acuerdo con la legislación alemana sobre los estudios en animales después de la &#39;Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio &quot;(publicación del NIH, 8ª edición, 2011) y la Directiva 2010/63 / UE relativa a la protección de los animales utilizados para fines científicos (Diario Oficial de la Unión Europea, 2010). Permiso oficial fue concedida desde el cuidado de los animales y la oficina gubernamental (LANUV Nordrhein-Westfalen, Recklinghausen, Alemania). NOTA: Los pasos que pueden ser omitidos para la imagen a corto plazo (por ejemplo, tiros rápidos, pilas 3-D o también corta duración time-lapse microscopía) están marcados con asteriscos (*) para reducir el tiempo de preparación y simplificar el protocolo quirúrgico. Imaging también se puede realizar sin un amplio control de supervisión y la circulación si es necesario, sin embargo, el tiempo de supervivencia se redujo notablemente. 1. Configuración Microscopio y Pre-cirugía Preparación (5.10 millasn) <ol><li> Sistema Encienda (microscopio, Laboratorio de poder, láser, almohadilla eléctrica, cámara climática, web cam, dispositivo de bomba de jeringa, respirador). </li><li> Conecte oferta de O 2 a isoflurano Vapor y establecer el nivel de isoflurano al 1,5% en volumen (v / v), se conecta a un respirador de pequeños animales. <ol><li> Para imágenes corto plazo, mantener la anestesia utilizando isoflurano sólo después de la inducción de la anestesia inicial ip (véase el paso 2.2). A continuación, utilice 2 Vol% (v / v) isoflurano, y mantener el tiempo de formación de imágenes por debajo de 2 horas para garantizar la microcirculación hepática estable. </li></ol></li><li> Establecer la respiración a 120-140 ciclos respiratorios / min con un volumen de 150-200 l. </li><li> Configure etapa agarosa ratón. Preparar 100 ml de 3% (w / v) de agarosa, vertiéndola en un plato (aproximadamente 10 cm x 15 cm base) en un ángulo de 40 °. </li><li> Establecer área de trabajo quirúrgico recoger la instrumentación requerida. Para prevenir la infección microbiana, desinfectar instrumentos utilizando una solución al 1% de Sekusept Forte S (9,9% w / v), Glutaral 9,8% w / v, formaldehído durante 5 min antes del experimento (Figura 1A). </li><li> Obtener restantes componentes: desinfectante de la piel (por ejemplo, solución de povidona yodada al 10%), la etapa hepática (pilas y puente), solución de agarosa (3% (w / v) en PBS), bomba de jeringa con 5% (w / v) de solución de glucosa (G-5), la bomba de jeringa con solución anestésica I (ketamina 0,1 mg / ml, xilazina 0,5 mg / ml, Fentanilo 5 g / ml), hisopos de algodón, n-butil-2-Cyanoacrylat, y 1x PBS. Ponga plato etapa de agarosa en la cámara de incubación para el precalentamiento. </li></ol> 2. La traqueotomía (10-15 min) <ol><li> Utilice C57BL / 6 ratones de la casa en reproductoras de 25-28 g. La Casa de los ratones bajo condiciones específicas libres de patógenos, de conformidad con las directrices de FELASA, en un ambiente de temperatura y humedad controladas con 12 horas de luz / 12 h oscuridad ciclo. Permitir animales libre acceso a la dieta estándar de ratones (Sniff Dieta de roedores estándar) y agua ad libitum. </li><li> Anestesiar el ratón por initial intraperitoneal (ip) la inyección de 250 l de solución de anestésico ketamina II (0,1 mg / ml, xilazina 1 mg / ml, buprenorfina 10 g / ml). <ol><li> * Para el mantenimiento durante intravital de imágenes, administrar continuamente solución anestésica I por inyección ip continua (ketamina 0,1 mg / ml, xilazina 0,5 mg / ml, Fentanilo 5 g / ml) utilizando un dispositivo de bomba de jeringa con un caudal de 0,2 ml / hr en combinación con inhalación de isoflurano 0,5 Vol% (v / v). </li><li> Compruebe reflejos después de 5 minutos (por ejemplo, pata pellizco con fórceps), desinfectar la piel para traqueotomía, iniciar la preparación en caso ratón está en estado de anestesia quirúrgica tolerante. </li><li> Aplicar crema de protección para los ojos (por ejemplo, Dexpantenol 50 mg / g) para evitar que la córnea se seque (Figura 1B). </li></ol></li><li> Fijar ratón en la mesa de preparación exponer parte ventral con cinta adhesiva para las extremidades; estirar demasiado suavemente cuello, fijar en esta posición, por ejemplo., mediante el uso de una banda de goma enganchado to los incisivos. <ol><li> Desinfectar la piel y de la piel usando una solución de yodo povidona, mediante la aplicación de desinfectante con un hisopo de algodón. </li></ol></li><li> Realizar corte inicial en la piel (0,5-1 cm de longitud) directamente debajo de la barbilla (Figura 1C) <ol><li> Diseccionar cuidadosamente tejido conectivo entre las glándulas salivales (Figura 1D). </li><li> Corte con cuidado abierto musculoso tubo que rodea la tráquea (Figura 1 E, F). </li></ol></li><li> Coloque hilo quirúrgico debajo de la tráquea para más tarde fijación tubo de ventilación (Figura 1G). <ol><li> Tráquea abierta con micro-tijeras entre anillos cartilaginosos que realizan una incisión en forma de T (Figura 1H) </li></ol></li><li> Coloque el tubo de ventilación en la tráquea a través de la incisión (~ 0,5 cm). Para empujar el tubo hacia adelante, agarrar extremo caudal con pequeñas pinzas anatómicas y suavemente avanzar el tubo en la tráquea (Figura 1I) </li><li> Fijar tubo con hilo quirúrgico (por ejemplo, </em&gt;, 5-0) con hilo colocado en el paso 2.5 atar un nudo alrededor del tubo dentro de la tráquea; realizar segunda fijación craneal del tubo en la piel para evitar y retiro accidental (Figura 1J, K). </li><li> Seal corte con pegamento de tejido (por ejemplo, n-butil-2-Cyanoacrylat) (Figura 1L). </li><li> Fijar el tubo en la cabeza con cinta adhesiva. </li></ol> 3. laparotomía (15-20 min) <ol><li> Coloque el ratón en el cojín de calefacción para evitar la hipotermia. Afeitado abdomen, retire con cuidado el pelo de la piel. Desinfectar la piel afeitada y piel mediante el uso de una solución de yodo povidona. </li><li> Realizar una pequeña piel cortada debajo del esternón utilizando tijeras quirúrgicas (Figura 2A). Extienda el corte lateralmente debajo de las costillas a ambos lados, la cauterización de todos los vasos sanguíneos visibles para prevenir el sangrado. </li><li> Realizar con cuidado un pequeño corte en la línea alba debajo del esternón, abre el peritoneo (Figura 2B). Extienda el corte a ambos lados con cauterización para prevenir el sangrado (Figura 2 C, D). </li><li> Coloque el ratón en el plato etapa de agarosa (Figura 2E). Coloque pilas de altura adecuada en ambos lados del ratón (generalmente 12-14 cubreobjetos) (Figura 2F). </li><li> Coloque sensor de disparo respiratoria debajo espalda superior para sincronizar el microscopio con la respiración. Activar unidad de disparo (Figura 2G). </li><li> Coloque hilo quirúrgico (5-0) a través del esternón para retraer costillas (Figura 2I). </li><li> Cortar cuidadosamente ligamento que conecta el hígado y el diafragma (ligamento falciforme), así como el tracto gastrointestinal y el hígado utilizando tijeras quirúrgicas curvas. Cortar el ligamento falciforme hasta la aorta (Figura 2J). </li></ol> 4. Configuración de la muestra (10-15 min) <ol><li> Coloque ratón en el lado derecho con un ángulo de 45 ° para facilitar el acceso a lóbulo hepático grande. </li><li> Añadir puente puesta en escena debajo de las costillas, que cubre el abdomencavidad. Fabricación de un puente mediante el uso de una hoja de cubierta estándar con recubrimiento de cinta adhesiva para cubrir los bordes afilados (Figura 2K). </li><li> Coloque lóbulo hepático grande en el escenario. Deslizar con cuidado la sonda lápiz doble bola o una espátula acolchado debajo del hígado y mantenga la parte superior del órgano con un bastoncillo de algodón húmedo o toallitas húmedas. Levante lóbulo sobre el portaobjetos y aplique fricción suave. Lóbulo se puede doblar o plegar. Proporcionar un cuidado especial para sólo una manipulación suave del hígado (Figura 2 l). </li><li> Coloca estacas lateral de apoyo, por ejemplo, pilas de pequeñas cubreobjetos (20 mm x 20 mm), de aproximadamente la misma altura del lóbulo hepático junto a él para apoyar la hoja de la cubierta. </li><li> Coloque gran hoja de la cubierta (24 mm x 50 mm) en el lóbulo hepático. Asegúrese de que cubreobjetos se orienta más horizontal posible (Figura 2 M). NOTA: La hoja de la cubierta debe estar en contacto con el tejido sin apretar. Compruebe si hay signos visibles de deterioro del flujo sanguíneo (tejido blanco). Si microcirculación se interrumpe, agregar más el apoyo a las estacas. </li><li> * Coloque dos catéteres intraperitoneal independientes (Figura 2N) para la anestesia de largo plazo y el G-5 aplicación. Instale catéteres lateralmente en la parte inferior del abdomen junto a las patas traseras. NOTA: Los catéteres intraperitoneal puede ser hecho a sí mismo mediante la conexión de 27 agujas G con tubo de silicona flexible (Figura 3). </li><li> * Aguja Fixate con un bucle de hilo quirúrgico 5-0 a la piel para evitar el desplazamiento accidental. </li><li> * Adjuntar bomba de jeringa con solución anestesia I catéter 1, ajuste el caudal de 0,2 ml / h; adjuntar bomba de jeringa con G-5 a 2 de catéter, la tasa de flujo se establece en 0,1 ml / hr. </li></ol> 5. Monitoreo Ratón <ol><li> * Electrodos de ECG Place en la parte delantera y las extremidades traseras (Figura 4A). </li><li> * Fije el tubo de caducidad a CO 2 sensor de nivel. </li><li> Añadir sensor de temperatura externo conectado a la almohadilla de calor (Figura 4C). </li></ol> 6. Inclusión y fijación tisular (5-10 min) <ol><li> Preparar 100 ml de 3% (w / v) de agarosa en 1X PBS. Incrustar hígado cuando la temperatura es a 41 ° C usando una jeringa de 5 ml y una aguja de 18 G (Figura 5A). </li><li> Verter restante de agarosa en cubreobjetos y alrededor del ratón (Figura 5B, C). Espere hasta agarosa está totalmente gelatinizado. </li><li> Retire el exceso de agarosa utilizando la espátula Heidemann, preparar una lo suficientemente grande viewfield para escanear el lóbulo hepático preparado (Figura 5D, E). </li></ol> 7. Imaging <ol><li> Transferir el ratón en cámara climática microscopio. </li><li> Añadir 50-100 ml de PBS 1x (precalentado en 37 ° C). </li><li> Cubrir el plato de la muestra para evitar la evaporación (Figura 5F). </li><li> * Disminuir isoflurano por inhalación a 0,5 Vol% (v / v). </li><li> * Iniciar el software de control, registro ECG, frecuencia cardiaca y CO 2 espiratorio. </li><li> Comience imagen: abrir lapersianas SER, identificar campos de vista de su interés, definir límites superior e inferior para Z-pilas y comenzar la grabación de lapso de tiempo. Reajuste Z-pilas si es necesario para corregir la deriva de Z (por ejemplo., Debido a cambios en la presión arterial o fluctuación de la temperatura, la Figura (5G). NOTA: Después de la terminación del período de formación de imágenes o si la circulación o anestesia de los animales se vuelve inestable, sacrificar los ratones por dislocación cervical (sin el despertar de la anestesia). </li></ol>

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</ol>

Los autores no revelan ningún conflicto de intereses.

El objetivo de nuestro estudio fue desarrollar un método altamente estandarizada, estable y reproducible para la imagen TPLSM intravital del hígado. Intravital de imágenes en general ha dado información valiosa sobre el comportamiento celular en condiciones reales siguientes vivienda y la interacción de las diferentes poblaciones de leucocitos en el desarrollo, la homeostasis y la enfermedad. Sin embargo, la posición anatómica algo difícil del hígado, debido a que las vías respiratorias y el movimiento intestinal perist...

La visualización de las células y las funciones celulares en órganos enteros o incluso organismos enteros ha sido de gran interés durante más de 50 años, incluyendo prácticamente todas las partes del cuerpo 2. Por lo tanto, algunos de los primeros estudios que ya emplean intravital de imágenes del hígado 3,4. Sin embargo, existen varias limitaciones al día en cuanto a imágenes de alta resolución estable a largo plazo del tejido hepático. Debido a la posición anatómica del hígado en estrecho contacto con el diafragma y el tracto gastrointestinal 5, el problema más común para formación de imágenes intravital microscópico es el movimiento debido a la respiración y, en menor medida, peristáltica del tracto intestinal 6. En comparación con otros órganos sólidos, la cirugía del hígado es particularmente difícil. Debido a la estructura microvascular densa, la manipulación quirúrgica puede conducir a lesiones hemorrágicas masivas, alteración de la microcirculación 7 y también la activación de residente immune células tales como las células de Kupffer 8. Por lo tanto, la fijación mecánica del tejido que se publica en otra parte 6,9 es probable que interfiera con la formación de imágenes de microscopía intravital. En un hígado sano, el 10-15% del volumen total de sangre reside dentro de la vasculatura del hígado, y el órgano recibe alrededor de 25% del gasto cardíaco en general 10, haciendo que el órgano altamente susceptibles a cambios en la circulación (por ejemplo, fluctuaciones de la presión arterial ). Por lo tanto, las interrupciones en el flujo sanguíneo hepático debido a, por ejemplo, la tensión de cizallamiento, el desplazamiento, la lesión por la manipulación excesiva de los tejidos o la circulación centralizada dará lugar a alteraciones artificiales en el comportamiento migratorio de leucocitos, alteración de la oxigenación del hígado y, por tanto, un mayor daño del hígado, que afecta a la respuesta inmune del hígado, así como la preservación de órganos y el tiempo de vida general del animal. Los primeros estudios microscópicos se basaron en mi epifluorescencia intravitalesmicroscopia, pero varias limitaciones técnicas tales como blanqueo foto y poca profundidad de penetración limitan el uso de esta técnica para obtener imágenes del hígado a largo plazo 4,11,12. Con el desarrollo de la microscopía multifotónica en la década de 1990, las limitaciones de blanqueo foto o profundidad de penetración se resolvieron principalmente, ya que este nuevo método es técnicamente capaz de realizar estudios de imagen en prácticamente todos los órganos en virtud de situaciones de la vida real 13-15. Sin embargo, los principales desafíos pendientes con respecto a las imágenes del hígado fueron: los movimientos de la respiración, la autofluorescencia del tejido hepático, que aseguran el flujo de sangre sin alteraciones en los sinusoides hepáticos, y proyección de imagen especialmente estables durante periodos de varias horas 16 más. Aunque varios estudios abordaron la función y la migración de diversos leucocitos en el hígado 17, por ejemplo, la NKT-18-20 células, células T 21,22, los macrófagos del hígado 23,24 o neutrófilos 25, a largo plazo multifotónica mimágenes icroscopy aún no se había establecido con éxito, una tarea aún más difícil en los animales con enfermedad hepática aguda o crónica debido a los daños existentes y, por tanto, una mayor susceptibilidad a daños mayores 26. Sin embargo, el monitoreo del comportamiento migratorio y la función celular de los leucocitos en el hígado en tiempo real permite a los nuevos conocimientos en su papel particular en la homeostasis del hígado y la enfermedad 27. El CXCR6 receptor de quimioquinas se expresa en varios subgrupos de linfocitos, incluyendo las células asesinas naturales (NK), las células NKT y algunas poblaciones de células T 18,28. Estudios previos en ratones han indicado que CXCR6 y su CXCL16 ligando afín pueden controlar el patrullaje de las células NKT en sinusoides hepáticos durante la homeostasis. En consecuencia, el uso de ratones CXCR6.gfp (que lleva un knock-in de la proteína fluorescente verde [GFP] en el locus CXCR6) se ha descrito para investigar la migración de linfocitos en diversos órganos tales como el cerebro 29y también el hígado 18,20, mostrando aumento de la infiltración de células CXCR6.gfp sobre la inflamación. Con el método proporcionado en este estudio era posible seguir estos procesos durante un largo período de tiempo en condiciones estabilizadas. El procedimiento basado multifotónica intravital permitió imagen que era altamente reproducible con perturbación mínima del animal y el órgano; optimizado para la supervivencia de los animales a largo plazo por una extensa evaluación que sigue un estricto control de la respiración y la circulación; y altamente flexible y fácil de adoptar también a otros órganos parenquimatosos como el riñón o el bazo.

<table><tbody><tr><td>Anestésicos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Essex Pharma</td><td>997.00.00</td><td>Analgeticum, 0,1 mg/kg</td></tr><tr><td>Fentanilo</td><td>Rotex Medica</td><td>cargo: 30819</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de anestesia Fluovac</td><td>Harvard Apparatus</td><td>34-1030</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa 5%</td><td>Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ISOFLO (Vapor de isoflurano) vaporizador</td><td>Eickemeyer</td><td>4802885</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Forene Abbott</td><td>B 506</td><td></td></tr><tr><td>Solución isotónica (0,9%) NaCl</td><td>DeltaSelect GmbH</td><td>PZN 00765145</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin 10%</td><td>ceva</td><td>Cargo: 36217/09</td><td></td></tr><tr><td>Xilacina 2%</td><td>medistar</td><td>Cargo: 04-03-9338/23</td><td></td></tr><tr><td>Consumibles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 ml Jeringa</td><td>BD Plastipak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 ml Matraz Erlenmeyer</td><td>Schott Duran</td><td>21 226 36</td><td></td></tr><tr><td>25 ml Vaso de precipitados 2x</td><td>Schott Duran</td><td>50-1150</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 2 ml</td><td>BD Plastipak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-0 Sutura de Vicryl</td><td>Ethicon</td><td>V7980</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>disponible</td><td></td><td></td>comercialmente</tr><tr><td>Bepanthen Eye y Pomada nasal</td><td>Bayer Vital GmbH</td><td>6029009.00.00</td><td></td></tr><tr><td>Change-A-Tip Deluxe High-Temp Cauteriy Kit Fine</td><td>Science Tools Inc.</td><td>18010-00</td><td></td></tr><tr><td>Bastoncillos de gasa de algodón</td><td>Fuhrmann GmbH</td><td>32014</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos 24x50 mm</td><td>ROTH</td><td>1871</td><td></td></tr><tr><td>Cinta de seda Durapore</td><td>3M</td><td>1538-1</td><td></td></tr><tr><td>Bisturí desechable Feather</td><td></td><td>02.001.30.011</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de polietileno de diámetro fino 0,58 mm ID</td><td>Smiths medical</td><td>800/100/200</td><td></td></tr><tr><td>Histoacryl</td><td>Braun 1050052</td><td></td><td>5x 0.5 ml</td></tr><tr><td>Leucoplast</td><td>BSN Medical Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td><td>ROTH</td><td>1879</td><td></td></tr><tr><td>Poly-Alcohol Haut&hellip; farblos Antisepticum</td><td>Antiseptica GmbH</td><td>72PAH200</td><td></td></tr><tr><td>Aguja estéril 18 G x 1</td><td>B. Braun</td><td>304622</td><td></td></tr><tr><td>Aguja estéril 27 3/4 G x 1</td><td>B. Braun</td><td>4657705</td><td></td></tr><tr><td>Papel tisú</td><td>disponible</td><td></td><td></td>en el mercado</tr><tr><td>Instrumentos</td><td></td><td></td><td></td>quirúrgicos</tr><tr><td>Bruñidor de amalgama 3PL</td><td>Gatz</td><td>0110?</td><td></td></tr><tr><td>Retractores Blair (4 puntas (romas)) x2</td><td>Storz& Pinzas Klein</td><td>S-01134</td><td></td></tr><tr><td>Dumont No.7</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>91197-00</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Graefe curvadas x1</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>11151-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Graefe rectas x2</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>Espátula Heidemann HD2</td><td>Stoma</td><td>2030.00</td><td></td></tr><tr><td>Portaagujas Mathieu</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>12010-14</td><td></td></tr><tr><td>Tijera</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>14074-11</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Semken</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>11008-13</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas pequeñas curvadas</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>14029-10</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas pequeñas rectas</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de patrón estándar</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de resorte Vannas</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Equipo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unidad de disparo de ECG</td><td>Rapid Biomedical</td><td></td> 3000003686 <td></td></tr><tr><td>MICROCAPSTAR Analizador de dióxido de carbono al final de la espiración</td><td>AD Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minivent Typ 845</td><td>Harvard Apparatus</td><td>73-0043</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio multifotónico Trimscope I</td><td>LaVision</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perfusor Compact</td><td>B. Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PowerLab 8/30 Registrador de 8 canales</td><td>AD Instruments</td><td>PL3508</td><td></td></tr><tr><td>Almohadilla térmica con control de temperatura</td><td>Sygonix 26857617</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sensor de temperatura</td><td>disponible</td><td></td><td></td>en el mercado</tr><tr><td>Sistema de temperatura controlada para microscopios -Cube& </td><td>Servicios</td><td></td><td></td> de imágenes de Box Life</tr></tbody></table>

largo plazo intravital multifotónica de imágenes de microscopía de células inmunitarias en sanos y enfermos de hígado utilizando ratones cxcr6.gfp reporter

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

<html> Inflamación del hígado como respuesta a una lesión es un proceso altamente dinámico que implica la infiltración de distintos subtipos de leucocitos incluyendo monocitos, neutrófilos, subconjuntos de células T, células B, células asesinas naturales (NK) y las células NKT. Microscopía intravital del hígado para el seguimiento de la migración de células inmunes es particularmente difícil debido a los altos requisitos relativos a la preparación de muestras y fijación, la resolución óptica y la supervivencia de los animales a largo plazo. Sin embargo, la dinámica de los procesos inflamatorios, así como estudios de interacción celulares podrían proporcionar información crítica para comprender mejor la iniciación, progresión y regresión de la enfermedad inflamatoria del hígado. Por lo tanto, se estableció un método altamente sensible y fiable para estudiar la migración y célula-célula-interacciones de las diferentes células inmunes en el hígado del ratón durante períodos largos (alrededor de 6 hr) por intravital de dos fotones microscopía de escaneo láser (TPLSM) en combinación con cuidados intensivos monitoreo. ent &quot;&gt; El método proporcionado incluye una preparación suave y una fijación estable del hígado con perturbación mínima del órgano; intravital de imágenes a largo plazo usando microscopía multifotónica multicolor con prácticamente ninguna photobleaching o efectos fototóxicos durante un período de tiempo de hasta 6 horas, lo que permite el seguimiento de subconjuntos de leucocitos específicos, y las condiciones de imagen estable debido a un seguimiento exhaustivo de los parámetros vitales del ratón y la estabilización de la circulación, la temperatura y el intercambio de gases. Para investigar la migración de linfocitos en la inflamación del hígado CXCR6.gfp ronda en ratones fueron sometidos a formación de imágenes del hígado intravital en condiciones basales y después de daño hepático agudo y crónico inducida por la inyección intraperitoneal (s) de tetracloruro de carbono (CCl 4). CXCR6 es un receptor de quimioquinas expresado en los linfocitos, principalmente en células T asesinas naturales (NKT) -, asesinas naturales (NK) - y subconjuntos de linfocitos T, como las células T CD4, sino también associ mucosasATED invariante células (MAIT) T 1. Siguiendo el patrón migratorio y el posicionamiento de las células inmunes CXCR6.gfp + permitido una visión detallada de su comportamiento alterado en la lesión hepática y por lo tanto su potencial implicación en la progresión de la enfermedad.

Para validar nuestro enfoque TPLSM intravital, sometimos GFP / + ratones CXCR6 a imágenes TPLSM intravital. Los ratones se dejaron sin tratar como controles de línea de base o sometidos a una única inyección intraperitoneal de tetracloruro de carbono (CCl 4) para inducir daño hepático agudo 20. Las secuencias de vídeo fueron tomadas durante un período de tiempo de 2-5 horas, y las células fueron rastreadas con el tiempo debido a su fluorescencia verde. Para m...

La obtención de imágenes intravitales estables de alta resolución de las células inmunitarias en el hígado es un reto. Aquí proporcionamos un método altamente sensible y confiable para estudiar la migración y las interacciones célula-célula de las células inmunitarias en el hígado de ratón durante largos períodos (alrededor de 6 horas) mediante microscopía de escaneo láser multifotónico intravital en combinación con monitoreo de cuidados intensivos.

Largo Plazo intravital Multifotónica de imágenes de microscopía de células inmunitarias en sanos y enfermos de hígado utilizando ratones CXCR6.Gfp Reporter

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

El objetivo general del siguiente experimento es seguir la migración y la interacción de los leucocitos en una enfermedad inflamatoria hepática en desarrollo. Para comprender mejor la secuencia de eventos que subyacen a cómo estas células son reclutadas hacia el tejido hepático y su posible participación en la inmunopatología. Esto se logra realizando primero una traqueotomía para obtener control sobre la respiración del ratón, un paso crucial para asegurar la supervivencia a largo plazo del animal.Como segundo paso, se realiza una laparotomía en el ratón para exponer quirúrgicamente el hígado, permitiendo el acceso al órgano con el microscopio de múltiples fotones. A continuación, el hígado se fija y posiciona mediante su inclusión en agar para minimizar los artefactos por movimiento. La obtención de imágenes puede realizarse durante varias horas, generando secuencias de alta resolución con lapse de tiempo que siguen los cambios en el reclutamiento, posicionamiento e interacción de los leucocitos individuales.En el proceso de desarrollo de la inflamación hepática, este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inflamación hepática aguda y crónica, como el reclutamiento de leucocitos, las interacciones entre células o los mecanismos de inmunopatología. La principal ventaja de esta técnica en comparación con la microscopía convencional es que la microscopía multifocal permite imágenes a largo plazo con perturbación mínima de la muestra, baja fotobleca y fototoxicidad, así como cortes ópticos hasta 100 micrómetros de profundidad en el tejido, gracias a la física única del láser de luz en el rango del rojo lejano. Este método puede proporcionar información valiosa sobre las enfermedades hepáticas.Puede adoptarse fácilmente a otros sistemas. Dado que el método de estabilización y fijación de tejidos puede aplicarse a prácticamente todas las preguntas de microscopía intravital, es posible obtener imágenes de órganos como el bazo, el riñón o incluso tumores subcutáneos utilizando células relacionadas fluidas. Asimismo, es posible visualizar todos los subconjuntos de leucocitos y analizar sus interacciones y la inflamación hepática.Generalmente, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a la extrema complejidad de la cirugía en animales pequeños. Sin embargo, debido a nuestra propia experiencia, esto solo constituye un factor limitante durante un par de semanas y simplemente requiere algo de práctica rutinaria. Debido a la fragilidad del tejido hepático, los pasos de preparación son difíciles de aprender, y es esencial una demostración visual del método. Después de preparar los anestésicos, llene la etapa de ratón con 3% aros, vertiéndolo en un ángulo de 40 grados.Luego, asegúrese de que el área de trabajo quirúrgico esté completamente desinfectada, al igual que todos los instrumentos necesarios y demás. A continuación, anestesie al ratón mediante una inyección intraperitoneal de un cóctel anestésico. Cinco minutos después, verifique los reflejos del animal, desinfecte la piel y aplique una pomada oftálmica en los ojos.Ahora, sujete el ratón a la mesa de preparación. Utilice cinta adhesiva para colocarlo de manera que se exponga la cara ventral, estirando suavemente el cuello. Esto puede lograrse con una banda de goma enganchada a los incisivos.Ahora, realice un corte inicial debajo del mentón de aproximadamente 0,5 a un centímetro de longitud. Luego, disecte cuidadosamente el tejido conectivo entre las glándulas salivales y localice el tubo muscular que rodea la tráquea. Rompa suavemente el músculo para exponer la tráquea.Extraiga un hilo por debajo de la tráquea, luego abra la tráquea con tijeras microquirúrgicas mediante una incisión en forma de T. Introduzca el tubo de ventilación aproximadamente medio centímetro. Avance el tubo utilizando pinzas anatómicas pequeñas.Luego asegure el tubo con puntos de sutura. A continuación, para mayor seguridad, sutúre el tubo a la piel, cierre la incisión en la piel utilizando cianoacrilato y asegure el tubo a la cabeza del animal. Utilizando cinta adhesiva, mantenga la anestesia mediante un flujo continuo de 2%iso fluorina.Después de preparar al ratón para la cirugía, realice una pequeña incisión en la piel debajo del esternón y extienda el corte lateralmente por debajo de las costillas en ambos lados. Cauterice todos los vasos sanguíneos expuestos durante este procedimiento. Para minimizar el sangrado, realice un corte inicial pequeño en el codo lineal para acceder a la cavidad abdominal.Extienda el corte horizontalmente, sellando todos los vasos sanguíneos y obteniendo acceso al hígado. Ahora, transfiera el ratón a la plataforma de trabajo y coloque portaobjetos a ambos lados del animal para ayudar a mantenerlo en su lugar. Estas pilas deben coincidir con la altura del ratón para que la plataforma para el hígado, que se colocará más adelante, no ejerza presión excesiva sobre el abdomen.Ahora, utilizando suturas en el esternón, retire las costillas. Una sutura 4-0 será suficiente. Después de retirar las costillas, corte los ligamentos que conectan el hígado y el diafragma; corte hasta llegar a la aorta, pero trabaje con especial precaución para no romper ni cortar el vaso. También corte el ligamento que conecta el hígado con el tracto gastrointestinal.Gire el ratón 45 grados para mejorar el acceso al lóbulo hepático más grande. Tome un cubreobjetos estándar y coloque cinta adhesiva a lo largo de sus bordes para que no queden filosos. Colóquelo sobre la cavidad abdominal.Esto servirá como una plataforma para colocar el hígado sobre ella. Deslice cuidadosamente una sonda con doble punta esférica o una espátula acolchada debajo del hígado y sostenga la parte superior del órgano. El uso de una presión mecánica con un tejido húmedo lesionará inmediatamente el tejido hepático, por lo que es esencial manipular el órgano con cuidado.Luego, levante el lóbulo sobre el portaobjetos y tire suavemente de él para colocarlo en posición. Por lo general, el lóbulo quedará ligeramente doblado o plegado; intente desplegar los bordes levantando el tejido con una espátula delgada o con un tejido húmedo. A continuación, agregue soportes laterales en forma de cubreobjetos o portaobjetos.Apile los cubreobjetos para que tengan la misma altura que el lóbulo hepático. La colocación y fijación del hígado es el paso más crucial del protocolo. Cualquier estrés mecánico, torsión o presión provocará daño tisular inmediato o al menos un flujo sanguíneo comprometido en los vasos sinusoidales.Ahora, coloque un portaobjetos grande con los bordes cubiertos de cinta sobre el lóbulo hepático, sostenido por los soportes laterales. Coloque este portaobjetos lo más nivelado posible. No debe comprimir el hígado.El tejido blanco indica un flujo sanguíneo comprometido, a menos que la imagen se obtenga rápidamente. Ahora es necesario insertar dos catéteres intraperitoneales independientes para proporcionar anestesia prolongada y aplicar G cinco. Estos se ensamblan a partir de agujas de calibre 27 y tubos de silicona flexibles.Luego, inicie su flujo utilizando bombas de jeringa. Inserte los catéteres en la parte inferior del abdomen cerca de las extremidades traseras. Después de colocar los monitores vitales en el ratón, prepare 100 mililitros de aros al 3 % en un XPBS.Cuando el aros se haya enfriado a 41 grados Celsius, incruste el hígado utilizando una jeringa de cinco mililitros con una aguja de calibre 18. Una vez que el aros se haya enfriado, use una espátula heideman para eliminar el exceso y exponer un campo de visión lo suficientemente amplio para escanear el hígado. A continuación, continúe con el escaneo.Después de preparar el campo de visión, mueva el ratón bajo el microscopio para seleccionar áreas de escaneo adecuadas para la adquisición de imágenes por lapsos de tiempo. El tejido hepático se examina visualmente utilizando una fuente externa de luz blanca, identificando campos representativos con flujo sanguíneo suficiente y mínima perturbación de la muestra. A ratones CXCR six GFP heterocigotos se les sometió a imágenes intravital T-P-L-S-M como experimento. Algunos recibieron una inyección intraperitoneal de tetracloruro para inducir daño hepático agudo.Las células modales que expresaban GFP se rastrearon mediante video y sus trayectorias se superpusieron para obtener una instantánea de la movilidad celular. Luego, las trayectorias se normalizaron. Los hígados normales presentaban células con patrones de migración aleatorios.Hígados inyectados con CCI cuatro mostraron un deterioro en la migración celular. Al medir el desplazamiento total desde su origen, quedó claro que hubo un atrapamiento celular 36 horas después del tratamiento con CCI cuatro en el sitio del daño hepatocelular. La migración deteriorada debido al daño hepático también pudo demostrarse al graficar la velocidad de migración de células individuales a lo largo del tiempo, mostrando un arresto parcial después de 18 horas y un arresto migratorio completo después de 36 horas.Se pudo demostrar también que la reducción en la velocidad de las células migratorias era estadísticamente significativa cuando las células se compararon como poblaciones. Por lo tanto, este enfoque es adecuado para rastrear los cambios en la migración y la ubicación celular en la enfermedad hepática en desarrollo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar el hígado de un ratón para la microscopía multifotónica intravital.El método que proporcionamos aquí nos permite estabilizar al animal para una supervivencia a largo plazo, así como minimizar los artefactos de movimiento debido al método de fijación suave que ofrecemos. Una vez enmascarado, esta técnica puede realizarse en aproximadamente una hora si se realiza adecuadamente. Durante este procedimiento, es importante controlar los parámetros vitales de los animales, estabilizando la temperatura, la frecuencia cardíaca, los niveles de oxígeno y de CO₂. Esto puede lograrse adaptando la profundidad de la anestesia y la respiración siguiendo esta técnica.Otros procedimientos como el análisis por citometría de flujo o la microdisección por captura láser se pueden realizar para responder preguntas adicionales, como el fenotipo de las células inmunitarias infiltrantes o los mediadores secretados por las células del tejido o infiltrantes tras su desarrollo. Estas técnicas permitieron a los investigadores obtener información sobre la dinámica del tráfico de leucocitos y las interacciones celulares en el hígado, lo que posibilitó desentrañar la secuencia de eventos que conducen a enfermedades hepáticas inflamatorias. Siga las directrices de seguridad láser al realizar imágenes con un láser infrarrojo de pulso de alta energía utilizado en microscopía multifotónica.Asegúrese de que ningún reflejo de la radiación láser pueda representar un peligro para sus ojos y piel durante la realización de este experimento.

long-term-intravital-multiphoton-microscopy-imaging-immune-cells

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Investigación

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Immunology and Infection

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Detallamos un protocolo para monitorizar el comportamiento de neutrófilos y monocitos en venas mesentéricas en estado estacionario e inflamatorio utilizando microscopía confocal intravital en ratones anestesiados.

Imaging neutrófilos y monocitos en mesentérica venas por Microscopia intravital en ratones anestesiados en Tiempo Real

Establecimos un protocolo quirúrgico novedoso para la proyección de imagen de dos fotones de hígado en ratones con la invasión mínima. Con esta técnica identificamos la estructura detallada del hígado durante la endotoxemia inducida por lipopolisacáridos. Esperamos que este método puede utilizarse para determinar la efectividad del tratamiento de reactivos diferentes a la migración de leucocitos hepáticos.

Dos fotones Intravital proyección de imagen de leucocitos durante la respuesta inmunitaria en hígado de ratón tratados con lipopolisacárido

En este experimento, un ratón se inyecta en su vena trasera con isoticianato-dextrano Rhodamine B que puede manchar los vasos sanguíneos. Después de que el hígado está expuesto y fijo, una parte específica del hígado se puede seleccionar para observar el tejido profundo en el cuerpo vivo utilizando microscopía multifotónica.

Observación microscópica multifotópica de vasos en el tejido hepático del ratón

Este protocolo describe una técnica crónica de implantación de ventanas craneales que se puede utilizar para imágenes longitudinales de estructuras neuro-glio-vasculares, interacciones y función en condiciones saludables y enfermas. Sirve como una alternativa complementaria al enfoque de imagen transcraneal que, aunque a menudo se prefiere, posee algunas limitaciones críticas.

Mapeo cerebral preciso para realizar imágenes in vivo repetitivas de dinámica neuroinmunitaria en ratones

Aquí se presenta un enfoque para imágenes intravitales a largo plazo utilizando ventanas de silicona ópticamente transparentes que se pueden pegar directamente al tejido / órgano de interés y la piel. Estas ventanas son más baratas y versátiles que otras utilizadas actualmente en el campo, y la inserción quirúrgica causa inflamación y angustia limitadas a los animales.

Imágenes intravitales longitudinales a través de ventanas de silicona transparente

Aquí, describimos una plataforma que permite la obtención de imágenes in vivo no invasivas de esferoides hepáticos injertados en la cámara anterior del ojo del ratón. El flujo de trabajo abarca desde la generación de esferoides a partir de células hepáticas primarias hasta el trasplante en el ojo del ratón y la obtención de imágenes in vivo a resolución celular mediante microscopía confocal.

Obtención de imágenes in vivo de esferoides hepáticos injertados en la cámara anterior del ojo de ratón

Aquí, presentamos un protocolo para obtener imágenes intravitales del pulmón izquierdo del ratón trasplantado utilizando microscopía de dos fotones. Esto representa una herramienta valiosa para estudiar la dinámica celular y las interacciones en tiempo real después del trasplante de pulmón murino.

Microscopía intravital de dos fotones del pulmón de ratón trasplantado

Este protocolo presenta una cadena de imagen completa para visualizar y modelar la morfología de las células estrelladas hepáticas en tejido hepático intacto. Este enfoque combina marcaje fluorescente de fibroblastos usando genética de ratón, preparación tisular in situ basada en perfusión hepática y un método modificado de limpieza de tejidos iDISCO para lograr transparencia óptica.

Mapeo de la morfología de las células estrelladas hepáticas en modelos murinos de fibrosis hepática

Aprende microscopía intravital multifotónica para estudiar la migración de leucocitos en hígado inflamado usando ratones CXCR6.Gfp. Este método permite imaginar células inmunitarias a largo plazo con alta resolución.

Largo Plazo intravital Multifotónica de imágenes de microscopía de células inmunitarias en sanos y enfermos de hígado utilizando ratones CXCR6.Gfp Reporter (Video) | JoVE Journal

Largo Plazo intravital Multifotónica de imágenes de microscopía de células inmunitarias en sanos y enfermos de hígado utilizando ratones CXCR6.Gfp Reporter

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