Largo Plazo intravital Multifotónica de imágenes de microscopía de células inmunitarias en sanos y enfermos de hígado utilizando ratones CXCR6.Gfp Reporter

El objetivo general del siguiente experimento es seguir la migración e interacción de los leucocitos en la progresión de la enfermedad inflamatoria hepática. Comprender mejor la secuencia de eventos que subyacen a cómo se reclutan estas células en el tejido hepático y su posible implicación en la inmunopatología. Esto se logra realizando primero una traqueotomía para obtener control sobre la respiración del ratón, un paso crucial para garantizar la supervivencia a largo plazo del animal.

Como segundo paso, el ratón se laparotomía para exponer quirúrgicamente el hígado, dando acceso al órgano con el microscopio multifotónico. A continuación, se fija el hígado y se coloca incrustándolo en el hígado para minimizar los artefactos de movimiento. Las imágenes se pueden realizar durante varias horas y conducen a secuencias de lapso de tiempo de alta resolución que siguen los cambios en el reclutamiento, el posicionamiento y la interacción de los leucocitos individuales.

En el proceso de desarrollo de la inflamación hepática, este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inflamación hepática aguda y crónica, como el reclutamiento de leucocitos, las interacciones entre células o los mecanismos de inmunopatología. La principal ventaja de esta técnica en comparación con la microscopía convencional es que la microscopía multifocal permite obtener imágenes a largo plazo prácticamente sin perturbación de la muestra con bajo blanqueamiento o fototoxicidad del potro, así como cortes ópticos de hasta 100 micrómetros de profundidad en el tejido, y esto se debe a la física única del láser de la luz láser roja lejana. Bueno, este método puede proporcionar información sobre la enfermedad hepática.

Se puede adaptar fácilmente a otros sistemas. Desde el método de estabilización y fijación, el tejido se puede aplicar a prácticamente todas las cuestiones de microscopía intravital, por lo que puede obtener fácilmente imágenes de órganos como el bazo, el riñón o incluso tumores subcutáneos utilizando células fluidas relacionadas. También es posible visualizar todos los subconjuntos de leucocitos y enviar sus interacciones e inflamación hepática.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a la extrema complejidad de la cirugía de animales pequeños. Sin embargo, debido a nuestra propia experiencia, esto es solo un factor limitante durante un par de semanas y solo necesita una rutina práctica Debido a la fragilidad del tejido hepático, los pasos de preparación son difíciles de aprender y la demostración visual del método es esencial. Después de configurar los anestésicos, llene la etapa aro del ratón con 3%aros, vertiéndolo en un ángulo de 40 grados.

Luego, asegúrese de que el área de trabajo quirúrgico esté completamente desinfectada, al igual que todos los instrumentos necesarios, etc. A continuación, anestesiar al ratón con una inyección intraperitoneal de un cóctel anestésico. Cinco minutos después, verifique los reflejos del animal y luego desinfecte la piel y aplique ungüento oftálmico en los ojos.

Ahora, asegure el mouse a la mesa de preparación. Con cinta adhesiva, colóquelo para exponer el lado ventral estirando suavemente el cuello. Una banda elástica enganchada a los incisivos puede lograr esto.

Ahora, realice la incisión inicial debajo de la barbilla de aproximadamente 0,5 a un centímetro de largo. Luego, diseccione cuidadosamente el tejido conectivo entre las glándulas salivales y encuentre el tubo muscular que rodea la tráquea. Desgarre suavemente el músculo para exponer la tráquea.

Tire de un hilo debajo de la tráquea, luego abra la tráquea con microtijeras usando una incisión en forma de T en la incisión. Inserte el tubo de ventilación aproximadamente medio centímetro. Avance el tubo con pinzas anatómicas pequeñas.

A continuación, asegure el tubo con suturas. Luego, para mayor seguridad, sutura el tubo a la piel, sella la incisión en la piel con cianocrilato y asegura el tubo a la cabeza del animal. Con cinta adhesiva, mantenga la anestesia utilizando un flujo continuo de flúor al 2%.

Después de preparar al ratón para la cirugía, haga una pequeña incisión en la piel debajo del esternón y extienda el corte lateralmente por debajo de las costillas a ambos lados. Cauterizar todos los vasos sanguíneos expuestos en este proceso. Para minimizar el sangrado, realice una pequeña incisión inicial en el codo lineal para acceder a la cavidad abdominal.

Extienda el corte horizontalmente, sellando todos los vasos sanguíneos y dando acceso al hígado. Ahora, transfiera el mouse a la etapa agrícola y apile correderas a ambos lados del animal para ayudar a mantenerlo en su lugar. Estas pilas deben coincidir con la altura del ratón para que la platina para el hígado, que se colocará más adelante, no ejerza una presión excesiva sobre el abdomen.

Ahora, usando suturas en el esternón, retrae las costillas. Cuatro suturas cero serán suficientes Después de retraer las costillas, corte los ligamentos que conectan el hígado y el diafragma hasta la aorta, pero trabaje con mucho cuidado para no romper o cortar el vaso. También corte el ligamento que conecta el hígado y el tracto gastrointestinal.

Gire el ratón 45 grados para mejorar el acceso al lóbulo hepático más grande. Tome un cubreobjetos estándar y péguelo con cinta adhesiva a lo largo de sus bordes para que no quede afilado. Colócalo sobre la cavidad abdominal.

Esto servirá como un escenario para que el hígado posicione el hígado en el escenario. Deslice con cuidado una sonda de aguja de doble bola o una espátula acolchada debajo del hígado y sostenga la parte superior del órgano. El uso de un tejido húmedo, la presión mecánica lesionará instantáneamente el tejido hepático, por lo que es esencial manipular el órgano con cuidado.

A continuación, levante el lóbulo sobre la corredera y tire suavemente de él y colóquelo en su posición. Por lo general, el lóbulo terminará doblado o doblado, intente desplegar los bordes levantando el tejido con una espátula delgada o un pañuelo húmedo. A continuación, añade soportes laterales en forma de cubreobjetos o correderas.

Apile los cubreobjetos para que tengan la misma altura que el lóbulo del hígado. La estadificación y fijación del hígado es el paso más crucial del protocolo. Cualquier esfuerzo mecánico, torsión o presión provocará un daño tisular instantáneo o, al menos, un deterioro del flujo sanguíneo en los vasos sinusoidales.

Ahora, coloque un cubreobjetos grande con bordes pegados con cinta adhesiva sobre el lóbulo del hígado sostenido por los soportes laterales. Coloque este cubreobjetos lo más nivelado posible. No debe exprimir el hígado.

El tejido blanco indica un deterioro del flujo sanguíneo a menos que las imágenes sean rápidas. Ahora es necesario insertar dos catéteres intraperitoneales independientes para proporcionar anestesia a largo plazo y aplicar G cinco. Estos se ensamblan a partir de agujas de calibre 27 y tubos de silicona flexibles.

A continuación, inicie su flujo mediante bombas de jeringa. Inserte los catéteres en la parte inferior del abdomen cerca de las extremidades traseras. Después de conectar monitores vitales al mouse, prepare 100 mililitros de 3%aros en un XPBS.

Cuando el aros se haya enfriado a 41 grados centígrados, incruste el hígado en él con una jeringa de cinco mililitros con una aguja de calibre 18. Una vez que el aeros se haya enfriado, use una espátula heideman para eliminar el exceso y exponer un campo de visión lo suficientemente grande como para escanear el hígado. A continuación, proceda con el escaneo.

Una vez preparado el campo de visión, mueva el ratón bajo el microscopio para seleccionar las áreas de exploración adecuadas para las imágenes de lapso de tiempo. El tejido hepático se escanea a ojo utilizando una fuente de luz blanca externa, identificando campos representativos con suficiente flujo sanguíneo y mínima perturbación de la muestra. CXCR Seis ratones heterocigotos GFP fueron sometidos a imágenes intravitales T-P-L-S-M como experimento. A algunos se les administró una inyección intraperitoneal de tetracloruro para inducir daño hepático agudo.

Las células modales que expresaban GFP se rastrearon mediante vídeo y sus pistas se superpusieron para obtener una instantánea de la movilidad celular. A continuación, se normalizaron las pistas. Los hígados normales tenían células con patrones de migración aleatorios.

Los hígados inyectados con CCI cuatro mostraron un deterioro en la migración celular. Al medir el desplazamiento total desde su origen, quedó claro que había atrapamiento celular 36 horas después del tratamiento con CCI cuatro en el sitio de daño hepatocelular. El deterioro de la migración por el daño hepático también se pudo demostrar mediante el trazado de la velocidad de migración de las células individuales a lo largo del tiempo, mostrando un paro parcial después de 18 horas y un paro migratorio completo después de 36 horas.

La reducción en la velocidad de migración de las células también pudo demostrarse estadísticamente significativa cuando las células se compararon como poblaciones. Por lo tanto, este enfoque es adecuado para rastrear los cambios en la migración y el posicionamiento de las células en el desarrollo de la enfermedad hepática. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar el hígado de un ratón para la fotomicroscopía multivital intravital.

El método que proporcionamos aquí nos permite estabilizar al animal para su supervivencia a largo plazo, así como minimizar los artefactos de movimiento debido al método de fijación suave que proporcionamos. Una vez enmascarados, esta técnica se puede realizar en aproximadamente una hora si se realiza correctamente. Durante este procedimiento, es importante controlar los parámetros vitales de los animales estabilizando la temperatura, la frecuencia cardíaca, el oxígeno y los niveles de CO2. Esto se puede conseguir adaptando la profundidad de la necrosis y la respiración siguiendo esta técnica.

Se pueden realizar otros procedimientos, como el análisis por citometría de flujo o la microdisección por captura láser, con el fin de responder a preguntas adicionales como el fenotipo de las células inmunitarias infiltrantes o los mediadores secretados por el tejido o las células infiltrantes después de su desarrollo. Estas técnicas permitieron a los investigadores comprender la dinámica del tráfico de leucocitos y las interacciones celulares en el hígado, lo que permitió diseccionar la secuencia de eventos que conducen a las enfermedades inflamatorias del hígado. Siga las pautas de seguridad del láser al tomar imágenes con un láser infrarrojo de pulso de alta energía utilizado para microscopía fotográfica múltiple.

Asegúrese de que ningún reflejo de la radiación láser pueda causar peligro para sus ojos y piel mientras realiza este experimento.