Largo Plazo intravital Multifotónica de imágenes de microscopía de células inmunitarias en sanos y enfermos de hígado utilizando ratones CXCR6.Gfp Reporter

El objetivo general del siguiente experimento es seguir la migración y la interacción de los leucocitos en una enfermedad inflamatoria hepática en desarrollo. Para comprender mejor la secuencia de eventos que subyacen a cómo estas células son reclutadas hacia el tejido hepático y su posible participación en la inmunopatología. Esto se logra realizando primero una traqueotomía para obtener control sobre la respiración del ratón, un paso crucial para asegurar la supervivencia a largo plazo del animal.

Como segundo paso, se realiza una laparotomía en el ratón para exponer quirúrgicamente el hígado, permitiendo el acceso al órgano con el microscopio de múltiples fotones. A continuación, el hígado se fija y posiciona mediante su inclusión en agar para minimizar los artefactos por movimiento. La obtención de imágenes puede realizarse durante varias horas, generando secuencias de alta resolución con lapse de tiempo que siguen los cambios en el reclutamiento, posicionamiento e interacción de los leucocitos individuales.

En el proceso de desarrollo de la inflamación hepática, este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inflamación hepática aguda y crónica, como el reclutamiento de leucocitos, las interacciones entre células o los mecanismos de inmunopatología. La principal ventaja de esta técnica en comparación con la microscopía convencional es que la microscopía multifocal permite imágenes a largo plazo con perturbación mínima de la muestra, baja fotobleca y fototoxicidad, así como cortes ópticos hasta 100 micrómetros de profundidad en el tejido, gracias a la física única del láser de luz en el rango del rojo lejano. Este método puede proporcionar información valiosa sobre las enfermedades hepáticas.

Puede adoptarse fácilmente a otros sistemas. Dado que el método de estabilización y fijación de tejidos puede aplicarse a prácticamente todas las preguntas de microscopía intravital, es posible obtener imágenes de órganos como el bazo, el riñón o incluso tumores subcutáneos utilizando células relacionadas fluidas. Asimismo, es posible visualizar todos los subconjuntos de leucocitos y analizar sus interacciones y la inflamación hepática.

Generalmente, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a la extrema complejidad de la cirugía en animales pequeños. Sin embargo, debido a nuestra propia experiencia, esto solo constituye un factor limitante durante un par de semanas y simplemente requiere algo de práctica rutinaria. Debido a la fragilidad del tejido hepático, los pasos de preparación son difíciles de aprender, y es esencial una demostración visual del método. Después de preparar los anestésicos, llene la etapa de ratón con 3% aros, vertiéndolo en un ángulo de 40 grados.

Luego, asegúrese de que el área de trabajo quirúrgico esté completamente desinfectada, al igual que todos los instrumentos necesarios y demás. A continuación, anestesie al ratón mediante una inyección intraperitoneal de un cóctel anestésico. Cinco minutos después, verifique los reflejos del animal, desinfecte la piel y aplique una pomada oftálmica en los ojos.

Ahora, sujete el ratón a la mesa de preparación. Utilice cinta adhesiva para colocarlo de manera que se exponga la cara ventral, estirando suavemente el cuello. Esto puede lograrse con una banda de goma enganchada a los incisivos.

Ahora, realice un corte inicial debajo del mentón de aproximadamente 0,5 a un centímetro de longitud. Luego, disecte cuidadosamente el tejido conectivo entre las glándulas salivales y localice el tubo muscular que rodea la tráquea. Rompa suavemente el músculo para exponer la tráquea.

Extraiga un hilo por debajo de la tráquea, luego abra la tráquea con tijeras microquirúrgicas mediante una incisión en forma de T. Introduzca el tubo de ventilación aproximadamente medio centímetro. Avance el tubo utilizando pinzas anatómicas pequeñas.

Luego asegure el tubo con puntos de sutura. A continuación, para mayor seguridad, sutúre el tubo a la piel, cierre la incisión en la piel utilizando cianoacrilato y asegure el tubo a la cabeza del animal. Utilizando cinta adhesiva, mantenga la anestesia mediante un flujo continuo de 2%iso fluorina.

Después de preparar al ratón para la cirugía, realice una pequeña incisión en la piel debajo del esternón y extienda el corte lateralmente por debajo de las costillas en ambos lados. Cauterice todos los vasos sanguíneos expuestos durante este procedimiento. Para minimizar el sangrado, realice un corte inicial pequeño en el codo lineal para acceder a la cavidad abdominal.

Extienda el corte horizontalmente, sellando todos los vasos sanguíneos y obteniendo acceso al hígado. Ahora, transfiera el ratón a la plataforma de trabajo y coloque portaobjetos a ambos lados del animal para ayudar a mantenerlo en su lugar. Estas pilas deben coincidir con la altura del ratón para que la plataforma para el hígado, que se colocará más adelante, no ejerza presión excesiva sobre el abdomen.

Ahora, utilizando suturas en el esternón, retire las costillas. Una sutura 4-0 será suficiente. Después de retirar las costillas, corte los ligamentos que conectan el hígado y el diafragma; corte hasta llegar a la aorta, pero trabaje con especial precaución para no romper ni cortar el vaso. También corte el ligamento que conecta el hígado con el tracto gastrointestinal.

Gire el ratón 45 grados para mejorar el acceso al lóbulo hepático más grande. Tome un cubreobjetos estándar y coloque cinta adhesiva a lo largo de sus bordes para que no queden filosos. Colóquelo sobre la cavidad abdominal.

Esto servirá como una plataforma para colocar el hígado sobre ella. Deslice cuidadosamente una sonda con doble punta esférica o una espátula acolchada debajo del hígado y sostenga la parte superior del órgano. El uso de una presión mecánica con un tejido húmedo lesionará inmediatamente el tejido hepático, por lo que es esencial manipular el órgano con cuidado.

Luego, levante el lóbulo sobre el portaobjetos y tire suavemente de él para colocarlo en posición. Por lo general, el lóbulo quedará ligeramente doblado o plegado; intente desplegar los bordes levantando el tejido con una espátula delgada o con un tejido húmedo. A continuación, agregue soportes laterales en forma de cubreobjetos o portaobjetos.

Apile los cubreobjetos para que tengan la misma altura que el lóbulo hepático. La colocación y fijación del hígado es el paso más crucial del protocolo. Cualquier estrés mecánico, torsión o presión provocará daño tisular inmediato o al menos un flujo sanguíneo comprometido en los vasos sinusoidales.

Ahora, coloque un portaobjetos grande con los bordes cubiertos de cinta sobre el lóbulo hepático, sostenido por los soportes laterales. Coloque este portaobjetos lo más nivelado posible. No debe comprimir el hígado.

El tejido blanco indica un flujo sanguíneo comprometido, a menos que la imagen se obtenga rápidamente. Ahora es necesario insertar dos catéteres intraperitoneales independientes para proporcionar anestesia prolongada y aplicar G cinco. Estos se ensamblan a partir de agujas de calibre 27 y tubos de silicona flexibles.

Luego, inicie su flujo utilizando bombas de jeringa. Inserte los catéteres en la parte inferior del abdomen cerca de las extremidades traseras. Después de colocar los monitores vitales en el ratón, prepare 100 mililitros de aros al 3 % en un XPBS.

Cuando el aros se haya enfriado a 41 grados Celsius, incruste el hígado utilizando una jeringa de cinco mililitros con una aguja de calibre 18. Una vez que el aros se haya enfriado, use una espátula heideman para eliminar el exceso y exponer un campo de visión lo suficientemente amplio para escanear el hígado. A continuación, continúe con el escaneo.

Después de preparar el campo de visión, mueva el ratón bajo el microscopio para seleccionar áreas de escaneo adecuadas para la adquisición de imágenes por lapsos de tiempo. El tejido hepático se examina visualmente utilizando una fuente externa de luz blanca, identificando campos representativos con flujo sanguíneo suficiente y mínima perturbación de la muestra. A ratones CXCR six GFP heterocigotos se les sometió a imágenes intravital T-P-L-S-M como experimento. Algunos recibieron una inyección intraperitoneal de tetracloruro para inducir daño hepático agudo.

Las células modales que expresaban GFP se rastrearon mediante video y sus trayectorias se superpusieron para obtener una instantánea de la movilidad celular. Luego, las trayectorias se normalizaron. Los hígados normales presentaban células con patrones de migración aleatorios.

Hígados inyectados con CCI cuatro mostraron un deterioro en la migración celular. Al medir el desplazamiento total desde su origen, quedó claro que hubo un atrapamiento celular 36 horas después del tratamiento con CCI cuatro en el sitio del daño hepatocelular. La migración deteriorada debido al daño hepático también pudo demostrarse al graficar la velocidad de migración de células individuales a lo largo del tiempo, mostrando un arresto parcial después de 18 horas y un arresto migratorio completo después de 36 horas.

Se pudo demostrar también que la reducción en la velocidad de las células migratorias era estadísticamente significativa cuando las células se compararon como poblaciones. Por lo tanto, este enfoque es adecuado para rastrear los cambios en la migración y la ubicación celular en la enfermedad hepática en desarrollo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar el hígado de un ratón para la microscopía multifotónica intravital.

El método que proporcionamos aquí nos permite estabilizar al animal para una supervivencia a largo plazo, así como minimizar los artefactos de movimiento debido al método de fijación suave que ofrecemos. Una vez enmascarado, esta técnica puede realizarse en aproximadamente una hora si se realiza adecuadamente. Durante este procedimiento, es importante controlar los parámetros vitales de los animales, estabilizando la temperatura, la frecuencia cardíaca, los niveles de oxígeno y de CO₂. Esto puede lograrse adaptando la profundidad de la anestesia y la respiración siguiendo esta técnica.

Otros procedimientos como el análisis por citometría de flujo o la microdisección por captura láser se pueden realizar para responder preguntas adicionales, como el fenotipo de las células inmunitarias infiltrantes o los mediadores secretados por las células del tejido o infiltrantes tras su desarrollo. Estas técnicas permitieron a los investigadores obtener información sobre la dinámica del tráfico de leucocitos y las interacciones celulares en el hígado, lo que posibilitó desentrañar la secuencia de eventos que conducen a enfermedades hepáticas inflamatorias. Siga las directrices de seguridad láser al realizar imágenes con un láser infrarrojo de pulso de alta energía utilizado en microscopía multifotónica.

Asegúrese de que ningún reflejo de la radiación láser pueda representar un peligro para sus ojos y piel durante la realización de este experimento.