La visualización de las variaciones del ciclo celular y la determinación de la nucleación en cardiomiocitos postnatales

El objetivo general de este procedimiento es visualizar la actividad del ciclo celular en los cardiomiocitos postnatales y determinar su nuclearidad. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la regeneración cardíaca, como ¿un cardiomiocitos realmente se divide o simplemente aumenta su ploidía o se vuelve multinucleado? Las principales ventajas de esta técnica son que la fase M del ciclo celular se puede visualizar en alta resolución espacio-temporal y que los núcleos de los cardiomiocitos se pueden identificar por fluorescencia.

La demostración del procedimiento estará a cargo de Patricia Freitag, técnica de nuestro laboratorio. Si se utilizan parejas reproductoras no homocigóticas, primero identifique los corazones transgénicos mediante microscopía fluorescente para verificar su expresión de analina EGFP y H2B-mCherry. Las señales nucleares de la analiina EGFP se pueden detectar más fácilmente en los bordes de las aurículas enfocándose a través de sus capas de tejido.

Para aislar los cardiomiocitos, coloque el número adecuado de corazones en tubos de reacción de 1,5 mililitros que contengan un mililitro de mezcla de enzimas de un kit de disociación cardíaca neonatal y corte los corazones en trozos pequeños con unas tijeras. Luego, transfiera la solución a tubos de reacción de 15 mililitros. Coloque el tubo en posición casi horizontal a 37 grados centígrados durante 15 minutos, mezclando el tejido de cinco a 10 veces con una pipeta de cinco mililitros al final de la incubación.

Al final de la tercera digestión, detenga la reacción con 7,5 mililitros de medio dos y filtre la suspensión celular a través de un filtro celular de 70 micras. Enjuague el colador de células con tres mililitros de medio dos, agrupando el lavado con las células recolectadas y recoja las células por centrifugación. Vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros de uno medio para contar.

Luego, siembre una vez diez a la cuarta celda por pocillo en 120 microlitros de medio, una en una placa de fondo plano de 96 pocillos y centrifugue las células antes de su cultivo nocturno en una incubadora de cultivo celular. Al día siguiente, la mayoría de los cardiomiocitos deberían estar latiendo. Antes de comenzar la transfección, limpie el banco y todos los materiales de transfección con una solución de descontaminación de ARNasa para eliminar cualquier ARNasa.

Cuando todos los materiales estén listos, agregue 20 microlitros de mezcla de siRNA recién preparada a cada pocillo y devuelva las células a la incubadora durante 48 horas. Después de dos días, reemplace el sobrenadante en cada pocillo con 120 microlitros de medio uno y devuelva las células a la incubadora durante al menos otras 24 horas. Al final de la incubación, lavar las células una vez con PBS, seguido de la fijación en una solución de formaldehído al 4% durante 20 minutos.

Para analizar las células mediante videomicroscopía confocal, transfiera la placa a la platina del microscopio confocal e inicie el software de imágenes. Abra la configuración de A1plus y marque las casillas de canal uno, dos, tres y cuatro. En el menú desplegable, establezca el canal uno en DAPI, el canal dos en eGFP, el canal tres en RFP y el canal cuatro en Cy5.

Haga clic en el voltaje del canal y use las barras deslizantes para establecer el voltaje en 80 para cada canal. Utilice las barras deslizantes para establecer el desplazamiento en cero y haga clic en el botón de inicio para establecer el agujero de alfiler en la posición de inicio. Establezca el tamaño de escaneo en 1024 por 1024 píxeles en el menú desplegable.

Haga clic en optimizar para abrir la ventana de configuración del tamaño XYZ y marque la casilla de vóxel perfecto en el paso sugerido Z.Seleccione el objetivo 20x y ajuste las intensidades del láser hasta que la imagen no esté ni subexpuesta ni sobreexpuesta. Cuando se hayan establecido todos los parámetros, abra el menú de adquisición. Seleccione escanear imagen grande, luego elija la posición actual en la esquina superior izquierda debajo del área.

A continuación, establezca el número de campos en X e Y en tres por tres y haga clic en escanear. Para definir el número de núcleos de cardiomiocitos, haga clic en medir, medición manual y recuentos. Seleccione los núcleos con señales H2B-mCherry, marcándolos y contándolos.

A continuación, seleccione las células alfa-actinina positivas para determinar el número de cardiomiocitos. Para contar los cardiomiocitos de fase G1, S, G2 con señales analinas nucleares EGFP, seleccione la medida, la medición manual y los recuentos. Marque los núcleos de expresión de EGFP analin y H2B-mCherry con un clic y cuente manualmente los cardiomiocitos con las señales de analina EGFP específicas de la mitosis, como los anillos contráctiles y los cuerpos medios.

A continuación, haga clic en medir, medición manual y recuentos y haga clic en los cardiomiocitos con señales analinas EGFP específicas de la mitosis, señales citoplasmáticas, anillos contráctiles y cuerpos medios. En comparación con los controles negativos, los cardiomiocitos transfectados con miRNA y siRNA demuestran una inducción de la actividad del ciclo celular. Los cardiomiocitos que realizan endorreduplicación exhiben una expresión de analina EGFP exclusivamente nuclear, mientras que los cardiomiocitos sometidos a división celular muestran expresión de analina EGFP en localizaciones típicas de la fase M.

Después de la digestión enzimática del tejido cardíaco en el aparato de Langendorff, las aurículas y los ventrículos se pueden separar mecánicamente y analizar de forma independiente, lo que permite la visualización de cardiomiocitos ventriculares transgénicos H2B-mCherry con un alto número de cardiomiocitos binucleados H2B-mCherry positivos. Por el contrario, la mayoría de los cardiomiocitos auriculares son mononucleados. La digestión enzimática no da como resultado una población 100% de una sola célula que revele un patrón de estrías cruzadas por tinción de alfa-actinina, lo que facilita aún más la discriminación entre cardiomiocitos binucleados como un patrón continuo de estrías cruzadas y dobletes celulares.

Para analizar el índice de binucleación de los cardiomiocitos en rodajas gruesas, es necesario desplazarse manualmente por la pila, ya que los núcleos no se encuentran necesariamente dentro de un plano Z, con tinción de aglutinina de germen de trigo que permite la detección de la célula borders. 3D reconstrucciones de cortes fijos de corazones de ratones transgénicos adultos permiten la detección y el recuento automatizado de ganchos. y núcleos positivos para H2B-mCherry para determinar la proporción de núcleos de cardiomiocitos en condiciones fisiológicas dentro del tejido. Una vez dominada, la disociación del corazón puede completarse en dos o tres horas si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe trabajar continuamente para mantener la viabilidad de las células durante todo el experimento. Siguiendo este procedimiento, es posible examinar los microARN u otras sustancias pequeñas para determinar sus efectos inductores de la proliferación en los cardiomiocitos postnatales.