Name: La visualización de las variaciones del ciclo celular y la determinación de la nucleación en cardiomiocitos postnatales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Aprenda a visualizar el ciclo celular y determinar la nucleación en cardiomiocitos postnatales de ratones transgénicos mediante microscopía de fluorescencia. Este método permite distinguir la división celular de las variaciones de ploidía.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a S. Grünberg (Bonn, Alemania) y P. Freitag (Bonn, Alemania) por su asistencia técnica.

<ol><li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+cardiomyocyte+renewal+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evidence for cardiomyocyte renewal in humans.</a> Science. 324 (5923), 98-102 (2009).</li>
<li>Raulf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+systems+for+unequivocal+identification+of+cardiac+myocyte+nuclei+and+analysis+of+cardiomyocyte+cell+cycle+status%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Res.Cardiol%22%5BJournal%5D)">Transgenic systems for unequivocal identification of cardiac myocyte nuclei and analysis of cardiomyocyte cell cycle status.</a> Basic Res.Cardiol. 110 (3), 33(2015).</li>
<li>Field, C. M., Alberts, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anillin%2C+a+contractile+ring+protein+that+cycles+from+the+nucleus+to+the+cell+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Anillin, a contractile ring protein that cycles from the nucleus to the cell cortex.</a> J.Cell Biol. 131 (1), 165-178 (1995).</li>
<li>Hesse, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+cell+division+using+high-resolution+imaging+of+M-phase+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Commun%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of cell division using high-resolution imaging of M-phase of the cell cycle.</a> Nat.Commun. 3, 1076(2012).</li>
<li>Eulalio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+screening+identifies+miRNAs+inducing+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional screening identifies miRNAs inducing cardiac regeneration.</a> Nature. 492 (7429), 376-381 (2012).</li>
<li>Di, S. V., Giacca, M., Capogrossi, M. C., Crescenzi, M., Martelli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+cyclin-dependent+kinase+inhibitors+induces+cardiomyocyte+re-entry+in+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biol.Chem%22%5BJournal%5D)">Knockdown of cyclin-dependent kinase inhibitors induces cardiomyocyte re-entry in the cell cycle.</a> J.Biol.Chem. 286 (10), 8644-8654 (2011).</li>
<li>Hosoda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonality+of+mouse+and+human+cardiomyogenesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A%22%5BJournal%5D)">Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo.</a> Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 106 (40), 17169-17174 (2009).</li>
<li>Soonpaa, M. H., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+cardiomyocyte+DNA+synthesis+in+normal+and+injured+adult+mouse+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Am.J.Physiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts.</a> Am.J.Physiol. 272 (1 Pt 2), H220-H226 (1997).</li>
<li>Ang, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+conventional+approaches+to+identify+myocyte+nuclei+in+histologic+sections+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Am.J.Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart.</a> Am.J.Physiol Cell Physiol. 298 (6), C1603-C1609 (2010).</li>
<li>Engel, F. B., Schebesta, M., Keating, M. T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16889791">Anillin localization defect in cardiomyocyte binucleation.</a> J Mol Cell Cardiol. 41 (4), 601-612 (2006).</li>
<li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+Cell+Generation+and+Turnover+in+the+Human+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamics of Cell Generation and Turnover in the Human Heart.</a> Cell. 161 (7), 1566-1575 (2015).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Existe una controversia sobre si los cardiomiocitos son capaces de volver a entrar en el ciclo celular y dividir después de la lesión y durante la homeostasis del tejido. Los valores para el volumen de negocio básico de cardiomiocitos se han dado en el rango entre 1% 1 y 80% 7. También después de una lesión cardíaca, la inducción de la actividad del ciclo celular y la generación de nuevos cardiomiocitos se ha informado en la zona fronteriza, con valores entre 0,0083% <sup ...

La correcta identificación de los núcleos de cardiomiocitos y el estado del ciclo celular es de crucial importancia para la determinación del volumen de negocios del músculo cardiaco y la regeneración. Esto es especialmente cierto para el uso de marcadores nucleares, tales como pHH3, Ki-67, o los análogos de timidina, para la identificación de la actividad del ciclo celular. Como la capacidad de proliferación de los cardiomiocitos de mamíferos adultos es muy pequeño 1, una falsa identificación de un núcleo positivo para un marcador de proliferación de un núcleo de cardiomiocitos podría hacer una diferencia crucial en el resultado de un ensayo de proliferación. Además, los cardiomiocitos son propensos a las variaciones en el ciclo celular, tales como la endorreduplicación y la mitosis acytokinetic, que resultan en células poliploides y multinucleadas en lugar de en la división celular. Con este fin, la interpretación de la tinción de anticuerpos contra marcadores del ciclo celular comunes no es concluyente en todos los casos. A continuación, presentamos los métodos para la recta forwa<html> reconocimiento rd de cardiomiocitos de ratón y su nuclearidad en células aisladas nativas y secciones de tejido de espesor en las etapas postnatales y adultos por la identificación inequívoca de sus núcleos. Para ello, se utilizó una línea de ratones transgénicos con la expresión de los cardiomiocitos-específica de una proteína de fusión que consta de la histona H2B humana y mCherry bajo el control del promotor MYH6 (MYH6-H2B-MCH) 2. Cruzamiento de esta línea de ratón con una línea de ratones indicador de proliferación transgénico, en el que la expresión de una proteína de fusión eGFP-anillin está bajo el control del promotor de actina de pollo ubicua con un promotor de CMV (CAG-eGFP-anillin), permite la determinación del estado del ciclo celular. El anillin andamio de proteínas se expresa específicamente en el ciclo celular de células activas 3, y su localización subcelular diferencial durante el ciclo celular permite la progresión del ciclo celular en vivo de seguimiento con una alta resolución de la fase Mef &quot;&gt; 4. Por lo tanto, los ratones dobles transgénicos pueden ser utilizados para discriminar entre la proliferación de los cardiomiocitos y los que se someten a variaciones del ciclo celular. Esto resulta especialmente útil en el cribado de sustancias que inducen la proliferación in vitro.

<table><tbody><tr><td>Placa de Petri de 10 cm</td><td>Sarstedt</td><td>821472</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; filtro de células m</td><td>Becton Dickinson GmbH/Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>2,3-butanediona monoxima (BDM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>G20x1 &frac12; cánula de inyección, Sterican</td><td>Braun, Melsungen</td><td>4657519</td><td></td></tr><tr><td>aguja de calibre 20</td><td>Becton Dickinson GmbH</td><td>301300</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 24 pocillos</td><td>Becton Dickinson GmbH/Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>2-metil-butano</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>3927.1</td><td></td></tr><tr><td>Solución de formaldehído al 37%</td><td>AppliChem GmbH&nbsp;</td><td>A0936,1000</td><td></td></tr><tr><td>Llave de paso de 3 vías</td><td>B. Braun Medical Inc.</td><td>16494C</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 50 ml B</td><td>. Braun Medical Inc.</td><td>8728810F</td><td></td></tr><tr><td>70% etanol</td><td>Otto Fischar GmbH</td><td>27669</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario conjugado con Alexa-fluor</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-605-205</td><td></td></tr><tr><td>Alfa-Aktinina EA-53, IgG de ratón</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim</td><td>A7811</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca de cultivo celular, 96 pocillos, </td><td>Microscopio</td> confocal <td>Greiner bio-one 675986</td><td></td></tr><tr><td>colagenasa B</td><td>Roche</td><td>11088815001</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti-E</td><td>Criostato Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CM 3050S</td><td>Suero</td> de burro Leica <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Jackson Immuno Research, Suffolk, GB</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>suero fetal para terneros</td><td>PromoCell, Heidelberg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución de formaldehído (4%)</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A3697</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina de piel porcina, Tipo A</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim</td><td>G2500</td><td></td></tr><tr><td>cubreobjetos de vidrio</td><td>VWR</td><td>631-0146</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Heidelberger tubo de extensión</td><td>IMPROMEDIFORM GmbH</td><td>MF 1833</td><td></td></tr><tr><td>Heparina-Natrio</td><td>Ratiopharm</td><td>5394.02.00</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio HistoBond</td><td>Marienfeld</td><td>0810000</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 (1&nbsp; mg/mL)</td><td>Sigma Aldrich, Taufkirchen</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de insulina</td><td>Becton Dickinson GmbH</td><td>300334</td><td></td></tr><tr><td>Iscove' s Dulbecco' modificado s Medium (IMDM)</td><td>Gibco/Life Technologies, Darmstadt</td><td>21980-032</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Corning</td><td>354221</td><td></td></tr><tr><td>Laser Scanning Mikroskop Eclipse Ti</td><td>Nikoninstruments, D&uuml; sseldorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina RNAiMAX</td><td>Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt</td><td>13778075</td><td></td></tr><tr><td>ratón IgG Cy5 (burro)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-175-151</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>tubo de microcentrífuga</td><td>Sarstedt</td><td>72690</td><td></td></tr><tr><td>Mini agitador</td><td>VWR</td><td>12620-940</td><td></td></tr><tr><td>mimímico de miARN mirVana, has-miR199a-3p</td> Molde de biopsia de <td>4464066</td><td></td><td>Ambion/Thermo Fischer Scientific</td></tr><tr><td></td><td>Sakura Finetek/ VWR</td><td>4565</td><td></td></tr><tr><td>M-slide de 8 pocillos ibiTreat ibidi</td><td></td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck Millipore</td><td>567530</td><td></td></tr><tr><td>negativo control (ARN codificado)</td><td>Ambion/Thermo Fischer Scientific</td><td>AM4611</td><td></td></tr><tr><td>Kit de disociación cardíaca neonatal</td><td>Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach</td><td>130-098-373</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements AR 4.12.01-4.30.02-64bit</td><td>Nikoninstruments, D&uuml; sseldorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos no esenciales, NEAA</td><td>Gibco/Life Technologies, Darmstad</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM, Medio sérico reducido</td><td>Gibco</td><td>51985-026</td><td></td></tr><tr><td>P21-siRNA</td><td>Ambion/Thermo Fischer Scientific</td><td>4390771</td><td></td></tr><tr><td>P27-siRNA</td><td>Ambion/Thermo Fischer Scientific</td><td>4390771</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Gibco/Life Technologies, Darmstadt</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje de alcohol polivinílico con DABCO&reg;, antidecoloración</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10981</td><td></td></tr><tr><td>RNasa A</td><td>Qiagen</td><td>1007885</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>recipientes de muestras</td><td>Vitlab</td><td>80731</td><td></td></tr><tr><td>pipeta serológica</td><td>Greiner</td><td>607180</td><td></td></tr><tr><td>software NIS Elements</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compuesto</td><td>Sakura Finetek/ VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>ToPro3 yoduro (642/661)</td><td>Molecular sondas/ThermoFisher Scientific</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton X</td><td>Fluka</td><td>93418</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka</td><td>93418</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td>Aglutinina de germen de trigo (WGA) Fluoresceína marcada con Vector</td><td>Laboratories</td><td>VEC-FL-1021-5</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;-anticuerpo de actinina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7811</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim</td><td>M3148</td><td></td></tr></tbody></table>

la visualización de las variaciones del ciclo celular y la determinación de la nucleación en cardiomiocitos postnatales

Visualization of Cell Cycle Variations and Determination of Nucleation in Postnatal Cardiomyocytes

Los cardiomiocitos son propensos a variaciones del ciclo celular, como la endorreduplicación (rondas continuas de síntesis de ADN sin cariocinesis y citocinesis) y la mitosis acitocinética (cariocinesis pero sin citocinesis). Estas variaciones atípicas del ciclo celular dan lugar a células poliploides y multinucleadas en lugar de a la división celular. Por lo tanto, para determinar el recambio y la regeneración cardíaca, es de vital importancia identificar correctamente los núcleos de los cardiomiocitos, el número de núcleos por célula y su estado del ciclo celular. Esto es especialmente cierto para el uso de marcadores nucleares para identificar la actividad del ciclo celular, como los análogos de timidina Ki-67, PCNA o pHH3. Aquí, presentamos métodos para reconocer cardiomiocitos y su nuclearidad y para determinar su actividad en el ciclo celular. Utilizamos dos sistemas transgénicos publicados: la línea de ratones transgénicos Myh6-H2B-mCh, para la identificación inequívoca de núcleos de cardiomiocitos, y la línea de ratones CAG-eGFP-anillina, para distinguir la división celular de las variaciones del ciclo celular. Combinados, estos dos sistemas facilitan el estudio de la regeneración cardíaca y la plasticidad.

Con el fin de analizar los efectos de siRNAs / miRNAs en la actividad del ciclo celular de cardiomiocitos postnatales in vitro, los cardiomiocitos de ratones MYH6-H2B-MCH / CAG-eGFP-anillin doble transgénicos fueron aislados en el día postnatal 3 (P3) y se transfectaron con actividad inductora de ciclo celular miR199 5, p27 siRNA, y siRNA Fzr1. En comparación con el control negativo (Figura 1A), las imágenes de miR199- (Figura 1B)...

Para distinguir la división celular de las variaciones del ciclo celular en los cardiomiocitos, presentamos protocolos utilizando dos líneas de ratones transgénicos: ratones transgénicos Myh6-H2B-mCh, para la identificación inequívoca de núcleos de cardiomiocitos, y ratones CAG-eGFP-aniillina, para distinguir la división celular de las variaciones del ciclo celular.

La visualización de las variaciones del ciclo celular y la determinación de la nucleación en cardiomiocitos postnatales

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and ...

El objetivo general de este procedimiento es visualizar la actividad del ciclo celular en cardiomiocitos posnatales y determinar su nuclearidad. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la regeneración cardíaca, como por ejemplo si un cardiomiocito realmente se divide o si simplemente aumenta su ploidía o se vuelve multinucleado. Las principales ventajas de esta técnica son que se puede visualizar la fase M del ciclo celular con alta resolución espacio-temporal y que los núcleos de los cardiomiocitos pueden identificarse mediante fluorescencia.La procedura será demostrada por Patricia Freitag, una técnica de nuestro laboratorio. Si se utilizan parejas de cría no homocigotas, primero identifique los corazones transgénicos mediante microscopía de fluorescencia para verificar la expresión de EGFP analina y H2B-mCherry. Las señales nucleares de analina EGFP pueden detectarse más fácilmente en los bordes de las aurículas enfocando a través de sus capas tisulares.Para aislar los cardiomiocitos, coloque el número adecuado de corazones en tubos de reacción de 1,5 mililitros que contengan un mililitro de la mezcla de enzimas de un kit de disociación de corazones neonatales y corte los corazones en trozos pequeños con tijeras. A continuación, transfiera la solución a tubos de reacción de 15 mililitros. Coloque el tubo en posición casi horizontal a 37 grados celsius durante 15 minutos, mezclando el tejido de cinco a 10 veces con una pipeta de cinco mililitros al final de la incubación.Al final de la tercera digestión, detenga la reacción con 7,5 mililitros de medio dos y filtre la suspensión celular a través de un filtro celular de 70 micrones. Enjuague el filtro celular con tres mililitros de medio dos, mezclando el enjuague con las células recolectadas, y recolecte las células mediante centrifugación. Re-suspenda el sedimento en 500 microlitros de medio uno para el conteo.Luego, siembre una vez diez a la cuarta células por pocillo en 120 microlitros de medio uno en una placa de 96 pocillos con fondo plano y centrifugue las células antes de su cultivo nocturno en una incubadora de cultivo celular. Al día siguiente, la mayoría de los cardiomiocitos deberían estar latiendo. Antes de comenzar la transfección, limpie la superficie del banco y todos los materiales de transfección con solución de descontaminación de ARNasa para eliminar cualquier ARNasa.Cuando todos los materiales estén listos, agregue 20 microlitros de la mezcla de siRNA recién preparada a cada pocillo y regrese las células al incubador durante 48 horas. Después de dos días, reemplace el sobrenadante de cada pocillo con 120 microlitros de medio uno y regrese las células al incubador durante al menos otras 24 horas. Al final de la incubación, lave las células una vez con PBS, seguido de fijación en solución al 4% de formaldehído durante 20 minutos.Para analizar las células mediante microscopía confocal de video, transfiera la placa a la platina del microscopio confocal e inicie el software de adquisición de imágenes. Abra la configuración de A1plus y active las casillas de los canales uno, dos, tres y cuatro. En el menú desplegable, configure el canal uno para DAPI, el canal dos para eGFP, el canal tres para RFP y el canal cuatro para Cy5.Haga clic en el voltaje del canal y use las barras deslizantes para ajustar el voltaje a 80 en cada canal. Utilice las barras deslizantes para ajustar la compensación a cero y haga clic en el botón de inicio para colocar el diafragma en la posición inicial. Establezca el tamaño de escaneo en 1024 por 1024 píxeles en el menú desplegable.Haga clic en optimizar para abrir la ventana de configuración del tamaño de XYZ y marque el cuadro de vóxel perfecto bajo el paso Z sugerido. Seleccione el objetivo de 20x y ajuste las intensidades del láser hasta que la imagen no esté ni subexpuesta ni sobreexpuesta. Cuando todos los parámetros hayan sido establecidos, abra el menú de adquisición. Seleccione escanear imagen grande y luego elija que la posición actual está en la esquina superior izquierda bajo área.Luego, configure el número de campos en X y Y a tres por tres y haga clic en escanear. Para definir el número de núcleos de cardiomiocitos, haga clic en medir, medición manual y recuentos. Seleccione los núcleos con señales de H2B-mCherry, marcándolos y contándolos.Luego, seleccione las células positivas para alfa-actinina para determinar el número de cardiomiocitos. Para contar los cardiomiocitos en fase G1, S y G2 con señales nucleares de EGFP-analina, seleccione medir, medición manual y recuentos. Marque los núcleos que expresan EGFP-analina y H2B-mCherry haciendo clic y cuente manualmente los cardiomiocitos con señales específicas de mitosis de EGFP-analina, como anillos contráctiles y cuerpos intermedios.A continuación, haga clic en medir, medición manual y recuentos, y marque los cardiomiocitos con señales de analina EGFP específicas de mitosis, señales citoplasmáticas, anillos contráctiles y cuerpos medios. En comparación con los controles negativos, los cardiomiocitos transfectados con miARN y siARN muestran una inducción de la actividad del ciclo celular. Los cardiomiocitos que realizan endoreduplicación exhiben una expresión exclusivamente nuclear de analina EGFP, mientras que los cardiomiocitos que están en división celular muestran expresión de analina EGFP en localizaciones típicas de la fase M.Después de la digestión enzimática del tejido cardíaco en el aparato de Langendorff, los atrios y los ventrículos pueden separarse mecánicamente y analizarse de forma independiente, lo que permite la visualización de cardiomiocitos ventriculares transgénicos H2B-mCherry con un alto número de cardiomiocitos bi-nucleados positivos para H2B-mCherry. En contraste, la mayoría de los cardiomiocitos atriales son mono-nucleados. La digestión enzimática no produce una población de células individuales al 100 %, revelando un patrón de estriación cruzada mediante la tinción de alfa-actinina, lo que facilita aún más la discriminación entre cardiomiocitos bi-nucleados, que muestran un patrón continuo de estriación cruzada, y dobletes celulares.Para analizar el índice de bi-nucleación de los cardiomiocitos en cortes gruesos, es necesario desplazarse manualmente a través de la pila, ya que los núcleos no necesariamente se encuentran dentro de un solo plano Z, con la tinción de aglutinina de germen de trigo permitiendo la detección de los bordes celulares. Las reconstrucciones 3D de cortes fijados de corazones transgénicos de ratón adulto permiten la detección y el conteo automatizado de ganchos, núcleos teñidos y núcleos positivos para H2B-mCherry para determinar la proporción de núcleos de cardiomiocitos en condiciones fisiológicas dentro del tejido. Una vez dominada, la disociación del corazón puede completarse en dos o tres horas si se realiza adecuadamente.Al realizar este procedimiento, es importante recordar trabajar de forma continua para mantener la viabilidad de las células durante todo el experimento. Tras seguir este procedimiento, es posible analizar microARNs u otras sustancias pequeñas en busca de sus efectos inductores de la proliferación en cardiomiocitos posnatales.

visualization-cell-cycle-variations-determination-nucleation

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Hemos establecido un protocolo para la inducción de cardioblastos directa de pluripotentes células madre embrionarias humanas mantenidas en condiciones definidas con pequeñas moléculas, lo que permite la derivación de una gran cantidad de células progenitoras cardiacas humanas y funcionales cardiovasculares cardiomiocitos para su reparación.

Derivación eficiente de los Derechos Humanos precursores cardiacos y cardiomiocitos de pluripotentes células madre embrionarias humanas mediante la inducción de moléculas pequeñas

Núcleos están aislados cardíaca a través de la sedimentación y la densidad de immunolabeled con anticuerpos contra el material pericentriolar 1 (PCM-1) para identificar y clasificar los núcleos de cardiomiocitos mediante citometría de flujo.

El aislamiento de núcleos de cardiomiocitos a partir de tejidos post-mortem

Las células madre pluripotentes, cualquiera de las células madre pluripotentes embrionarias o inducidas (iPS), constituyen una valiosa fuente de células diferenciadas humanas, incluyendo cardiomiocitos. Aquí, nos centraremos en la inducción cardiaca de las células iPS, que muestra cómo usarlos para obtener cardiomiocitos humanos funcionales a través de un protocolo de los organismos con sede en embrioide.

La generación de cardiomiocitos humanos: Protocolo de diferenciación de células madre pluripotentes inducidas humanas Feeder libres

El artículo describe la metodología detallada para diferenciar eficazmente células madre pluripotentes humanas en cardiomiocitos mediante la modulación de la vía Wnt selectivamente, seguido por citometría de flujo análisis de marcadores de referencia para evaluar la homogeneidad e identidad de la población.

Alta Eficiencia Diferenciación de células madre pluripotentes humanas a cardiomiocitos y Caracterización por citometría de flujo

Las mutaciones que conducen a defectos cardíacos congénitos se benefician de la investigación in vivo de la estructura cardíaca durante el desarrollo, pero los estudios estructurales de alta resolución en el corazón embrionario de ratón son técnicamente desafiantes. Aquí presentamos un método robusto de inmunofluorescencia y análisis de imágenes para evaluar las estructuras específicas de los cardiomiocitos en el corazón de ratón en desarrollo.

Análisis para el Desarrollo de los cardiomiocitos mediante inmunofluorescencia en el corazón de embriones de ratón

La cuantificación del recambio de cardiomiocitos es un reto. El protocolo descrito aquí hace una contribución importante a este desafío al permitir la cuantificación precisa y sensible de la generación de núcleos de neocardiomiocitos y la ploidía de los núcleos.

La evaluación simultánea de los cardiomiocitos de síntesis de ADN y la ploidía: Un Método de Ayuda a la cuantificación de los cardiomiocitos Regeneración y Facturación

Describimos un protocolo para obtener imágenes volumétricas de células marcadas con proteínas fluorescentes en el interior de corazones embrionarios y postnatales intactos. Utilizando métodos de limpieza de tejidos en combinación con la tinción de montaje completo, se pueden obtener imágenes claras y precisas de células marcadas con proteínas fluorescentes individuales dentro de un corazón embrionario o posnatal.

Borrado de imágenes embrionario y postnatal Corazones en la Resolución de celda única

Los métodos convencionales para iniciar la diferenciación cardiaca basada agregada suspensión de pluripotente humana se deriva células (hPSCs) están plagados de heterogeneidad de cultivo con respecto al tamaño y la forma agregada. A continuación, describimos un método robusto para la diferenciación cardiaca empleando pocillos para generar HPSC tamaño controlado agregados cultivan en condiciones cardíacas promotoras.

Agregada la optimización del tamaño de micropocillos para basada en suspensión cardiaca diferenciación de células madre pluripotentes

Este manuscrito describe un protocolo paso a paso para la generación y cuantificación de diversos subtipos cardíacos reprogramados utilizando una administración mediada por retrovirus de Gata4, Hand2, Mef2c y Tbx5.

La evaluación de cardiomiocitos subtipos A raíz de reprogramación mediada por el factor de transcripción de fibroblastos embrionarios de ratón

El objetivo de este trabajo es desarrollar un método para aislar reproduciblemente los cardiomiocitos del corazón adulto y medir el contenido de ADN y la nucleación.

Aislamiento de cardiomiocitos de corazones fijos para inmunocitoquímica y análisis de ploide

Los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos (hiPSC-CM) ofrecen una alternativa al uso de animales para la detección preclínica de cardiotoxicidad. Una limitación para la adopción generalizada de hiPSC-CM en la detección de toxicidad preclínica es el fenotipo inmaduro de las células. Aquí se presentan protocolos para la maduración robusta y rápida de hiPSC-CM.

Detección de cardiotoxicidad de alto rendimiento utilizando monocapas maduras de cardiomiocitos derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos

Aprenda a visualizar el ciclo celular y determinar la nucleación en cardiomiocitos postnatales de ratones transgénicos mediante microscopía de fluorescencia. Este método permite distinguir la división celular de las variaciones de ploidía.

La visualización de las variaciones del ciclo celular y la determinación de la nucleación en cardiomiocitos postnatales

Explorar más videos