Name: La visualización de las variaciones del ciclo celular y la determinación de la nucleación en cardiomiocitos postnatales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Aprenda a visualizar el ciclo celular y determinar la nucleación en cardiomiocitos postnatales de ratones transgénicos mediante microscopía de fluorescencia. Este método permite distinguir la división celular de las variaciones de ploidía.

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Agradecemos a S. Grünberg (Bonn, Alemania) y P. Freitag (Bonn, Alemania) por su asistencia técnica.

<ol><li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+cardiomyocyte+renewal+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evidence for cardiomyocyte renewal in humans.</a> Science. 324 (5923), 98-102 (2009).</li>
<li>Raulf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+systems+for+unequivocal+identification+of+cardiac+myocyte+nuclei+and+analysis+of+cardiomyocyte+cell+cycle+status%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Res.Cardiol%22%5BJournal%5D)">Transgenic systems for unequivocal identification of cardiac myocyte nuclei and analysis of cardiomyocyte cell cycle status.</a> Basic Res.Cardiol. 110 (3), 33(2015).</li>
<li>Field, C. M., Alberts, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anillin%2C+a+contractile+ring+protein+that+cycles+from+the+nucleus+to+the+cell+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Anillin, a contractile ring protein that cycles from the nucleus to the cell cortex.</a> J.Cell Biol. 131 (1), 165-178 (1995).</li>
<li>Hesse, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+cell+division+using+high-resolution+imaging+of+M-phase+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Commun%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of cell division using high-resolution imaging of M-phase of the cell cycle.</a> Nat.Commun. 3, 1076(2012).</li>
<li>Eulalio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+screening+identifies+miRNAs+inducing+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional screening identifies miRNAs inducing cardiac regeneration.</a> Nature. 492 (7429), 376-381 (2012).</li>
<li>Di, S. V., Giacca, M., Capogrossi, M. C., Crescenzi, M., Martelli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+cyclin-dependent+kinase+inhibitors+induces+cardiomyocyte+re-entry+in+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biol.Chem%22%5BJournal%5D)">Knockdown of cyclin-dependent kinase inhibitors induces cardiomyocyte re-entry in the cell cycle.</a> J.Biol.Chem. 286 (10), 8644-8654 (2011).</li>
<li>Hosoda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonality+of+mouse+and+human+cardiomyogenesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A%22%5BJournal%5D)">Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo.</a> Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 106 (40), 17169-17174 (2009).</li>
<li>Soonpaa, M. H., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+cardiomyocyte+DNA+synthesis+in+normal+and+injured+adult+mouse+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Am.J.Physiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts.</a> Am.J.Physiol. 272 (1 Pt 2), H220-H226 (1997).</li>
<li>Ang, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+conventional+approaches+to+identify+myocyte+nuclei+in+histologic+sections+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Am.J.Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart.</a> Am.J.Physiol Cell Physiol. 298 (6), C1603-C1609 (2010).</li>
<li>Engel, F. B., Schebesta, M., Keating, M. T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16889791">Anillin localization defect in cardiomyocyte binucleation.</a> J Mol Cell Cardiol. 41 (4), 601-612 (2006).</li>
<li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+Cell+Generation+and+Turnover+in+the+Human+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamics of Cell Generation and Turnover in the Human Heart.</a> Cell. 161 (7), 1566-1575 (2015).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Existe una controversia sobre si los cardiomiocitos son capaces de volver a entrar en el ciclo celular y dividir después de la lesión y durante la homeostasis del tejido. Los valores para el volumen de negocio básico de cardiomiocitos se han dado en el rango entre 1% 1 y 80% 7. También después de una lesión cardíaca, la inducción de la actividad del ciclo celular y la generación de nuevos cardiomiocitos se ha informado en la zona fronteriza, con valores entre 0,0083% <sup ...

La correcta identificación de los núcleos de cardiomiocitos y el estado del ciclo celular es de crucial importancia para la determinación del volumen de negocios del músculo cardiaco y la regeneración. Esto es especialmente cierto para el uso de marcadores nucleares, tales como pHH3, Ki-67, o los análogos de timidina, para la identificación de la actividad del ciclo celular. Como la capacidad de proliferación de los cardiomiocitos de mamíferos adultos es muy pequeño 1, una falsa identificación de un núcleo positivo para un marcador de proliferación de un núcleo de cardiomiocitos podría hacer una diferencia crucial en el resultado de un ensayo de proliferación. Además, los cardiomiocitos son propensos a las variaciones en el ciclo celular, tales como la endorreduplicación y la mitosis acytokinetic, que resultan en células poliploides y multinucleadas en lugar de en la división celular. Con este fin, la interpretación de la tinción de anticuerpos contra marcadores del ciclo celular comunes no es concluyente en todos los casos. A continuación, presentamos los métodos para la recta forwa<html> reconocimiento rd de cardiomiocitos de ratón y su nuclearidad en células aisladas nativas y secciones de tejido de espesor en las etapas postnatales y adultos por la identificación inequívoca de sus núcleos. Para ello, se utilizó una línea de ratones transgénicos con la expresión de los cardiomiocitos-específica de una proteína de fusión que consta de la histona H2B humana y mCherry bajo el control del promotor MYH6 (MYH6-H2B-MCH) 2. Cruzamiento de esta línea de ratón con una línea de ratones indicador de proliferación transgénico, en el que la expresión de una proteína de fusión eGFP-anillin está bajo el control del promotor de actina de pollo ubicua con un promotor de CMV (CAG-eGFP-anillin), permite la determinación del estado del ciclo celular. El anillin andamio de proteínas se expresa específicamente en el ciclo celular de células activas 3, y su localización subcelular diferencial durante el ciclo celular permite la progresión del ciclo celular en vivo de seguimiento con una alta resolución de la fase Mef &quot;&gt; 4. Por lo tanto, los ratones dobles transgénicos pueden ser utilizados para discriminar entre la proliferación de los cardiomiocitos y los que se someten a variaciones del ciclo celular. Esto resulta especialmente útil en el cribado de sustancias que inducen la proliferación in vitro.

<table><tbody><tr><td>Placa de Petri de 10 cm</td><td>Sarstedt</td><td>821472</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; filtro de células m</td><td>Becton Dickinson GmbH/Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>2,3-butanediona monoxima (BDM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>G20x1 &frac12; cánula de inyección, Sterican</td><td>Braun, Melsungen</td><td>4657519</td><td></td></tr><tr><td>aguja de calibre 20</td><td>Becton Dickinson GmbH</td><td>301300</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 24 pocillos</td><td>Becton Dickinson GmbH/Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>2-metil-butano</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>3927.1</td><td></td></tr><tr><td>Solución de formaldehído al 37%</td><td>AppliChem GmbH&nbsp;</td><td>A0936,1000</td><td></td></tr><tr><td>Llave de paso de 3 vías</td><td>B. Braun Medical Inc.</td><td>16494C</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 50 ml B</td><td>. Braun Medical Inc.</td><td>8728810F</td><td></td></tr><tr><td>70% etanol</td><td>Otto Fischar GmbH</td><td>27669</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario conjugado con Alexa-fluor</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-605-205</td><td></td></tr><tr><td>Alfa-Aktinina EA-53, IgG de ratón</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim</td><td>A7811</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca de cultivo celular, 96 pocillos, </td><td>Microscopio</td> confocal <td>Greiner bio-one 675986</td><td></td></tr><tr><td>colagenasa B</td><td>Roche</td><td>11088815001</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti-E</td><td>Criostato Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CM 3050S</td><td>Suero</td> de burro Leica <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Jackson Immuno Research, Suffolk, GB</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>suero fetal para terneros</td><td>PromoCell, Heidelberg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución de formaldehído (4%)</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A3697</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina de piel porcina, Tipo A</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim</td><td>G2500</td><td></td></tr><tr><td>cubreobjetos de vidrio</td><td>VWR</td><td>631-0146</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Heidelberger tubo de extensión</td><td>IMPROMEDIFORM GmbH</td><td>MF 1833</td><td></td></tr><tr><td>Heparina-Natrio</td><td>Ratiopharm</td><td>5394.02.00</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio HistoBond</td><td>Marienfeld</td><td>0810000</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 (1&nbsp; mg/mL)</td><td>Sigma Aldrich, Taufkirchen</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de insulina</td><td>Becton Dickinson GmbH</td><td>300334</td><td></td></tr><tr><td>Iscove' s Dulbecco' modificado s Medium (IMDM)</td><td>Gibco/Life Technologies, Darmstadt</td><td>21980-032</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Corning</td><td>354221</td><td></td></tr><tr><td>Laser Scanning Mikroskop Eclipse Ti</td><td>Nikoninstruments, D&uuml; sseldorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina RNAiMAX</td><td>Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt</td><td>13778075</td><td></td></tr><tr><td>ratón IgG Cy5 (burro)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-175-151</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>tubo de microcentrífuga</td><td>Sarstedt</td><td>72690</td><td></td></tr><tr><td>Mini agitador</td><td>VWR</td><td>12620-940</td><td></td></tr><tr><td>mimímico de miARN mirVana, has-miR199a-3p</td> Molde de biopsia de <td>4464066</td><td></td><td>Ambion/Thermo Fischer Scientific</td></tr><tr><td></td><td>Sakura Finetek/ VWR</td><td>4565</td><td></td></tr><tr><td>M-slide de 8 pocillos ibiTreat ibidi</td><td></td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck Millipore</td><td>567530</td><td></td></tr><tr><td>negativo control (ARN codificado)</td><td>Ambion/Thermo Fischer Scientific</td><td>AM4611</td><td></td></tr><tr><td>Kit de disociación cardíaca neonatal</td><td>Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach</td><td>130-098-373</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements AR 4.12.01-4.30.02-64bit</td><td>Nikoninstruments, D&uuml; sseldorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos no esenciales, NEAA</td><td>Gibco/Life Technologies, Darmstad</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM, Medio sérico reducido</td><td>Gibco</td><td>51985-026</td><td></td></tr><tr><td>P21-siRNA</td><td>Ambion/Thermo Fischer Scientific</td><td>4390771</td><td></td></tr><tr><td>P27-siRNA</td><td>Ambion/Thermo Fischer Scientific</td><td>4390771</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Gibco/Life Technologies, Darmstadt</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje de alcohol polivinílico con DABCO&reg;, antidecoloración</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10981</td><td></td></tr><tr><td>RNasa A</td><td>Qiagen</td><td>1007885</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>recipientes de muestras</td><td>Vitlab</td><td>80731</td><td></td></tr><tr><td>pipeta serológica</td><td>Greiner</td><td>607180</td><td></td></tr><tr><td>software NIS Elements</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compuesto</td><td>Sakura Finetek/ VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>ToPro3 yoduro (642/661)</td><td>Molecular sondas/ThermoFisher Scientific</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton X</td><td>Fluka</td><td>93418</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka</td><td>93418</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td>Aglutinina de germen de trigo (WGA) Fluoresceína marcada con Vector</td><td>Laboratories</td><td>VEC-FL-1021-5</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;-anticuerpo de actinina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7811</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim</td><td>M3148</td><td></td></tr></tbody></table>

la visualización de las variaciones del ciclo celular y la determinación de la nucleación en cardiomiocitos postnatales

Visualization of Cell Cycle Variations and Determination of Nucleation in Postnatal Cardiomyocytes

Los cardiomiocitos son propensos a variaciones del ciclo celular, como la endorreduplicación (rondas continuas de síntesis de ADN sin cariocinesis y citocinesis) y la mitosis acitocinética (cariocinesis pero sin citocinesis). Estas variaciones atípicas del ciclo celular dan lugar a células poliploides y multinucleadas en lugar de a la división celular. Por lo tanto, para determinar el recambio y la regeneración cardíaca, es de vital importancia identificar correctamente los núcleos de los cardiomiocitos, el número de núcleos por célula y su estado del ciclo celular. Esto es especialmente cierto para el uso de marcadores nucleares para identificar la actividad del ciclo celular, como los análogos de timidina Ki-67, PCNA o pHH3. Aquí, presentamos métodos para reconocer cardiomiocitos y su nuclearidad y para determinar su actividad en el ciclo celular. Utilizamos dos sistemas transgénicos publicados: la línea de ratones transgénicos Myh6-H2B-mCh, para la identificación inequívoca de núcleos de cardiomiocitos, y la línea de ratones CAG-eGFP-anillina, para distinguir la división celular de las variaciones del ciclo celular. Combinados, estos dos sistemas facilitan el estudio de la regeneración cardíaca y la plasticidad.

Con el fin de analizar los efectos de siRNAs / miRNAs en la actividad del ciclo celular de cardiomiocitos postnatales in vitro, los cardiomiocitos de ratones MYH6-H2B-MCH / CAG-eGFP-anillin doble transgénicos fueron aislados en el día postnatal 3 (P3) y se transfectaron con actividad inductora de ciclo celular miR199 5, p27 siRNA, y siRNA Fzr1. En comparación con el control negativo (Figura 1A), las imágenes de miR199- (Figura 1B)...

Para distinguir la división celular de las variaciones del ciclo celular en los cardiomiocitos, presentamos protocolos utilizando dos líneas de ratones transgénicos: ratones transgénicos Myh6-H2B-mCh, para la identificación inequívoca de núcleos de cardiomiocitos, y ratones CAG-eGFP-aniillina, para distinguir la división celular de las variaciones del ciclo celular.

La visualización de las variaciones del ciclo celular y la determinación de la nucleación en cardiomiocitos postnatales

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and ...

El objetivo general de este procedimiento es visualizar la actividad del ciclo celular en cardiomiocitos posnatales y determinar su nuclearidad. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la regeneración cardíaca, como por ejemplo si un cardiomiocito realmente se divide o si simplemente aumenta su ploidía o se vuelve multinucleado. Las principales ventajas de esta técnica son que se puede visualizar la fase M del ciclo celular con alta resolución espacio-temporal y que los núcleos de los cardiomiocitos pueden identificarse mediante fluorescencia.La procedura será demostrada por Patricia Freitag, una técnica de nuestro laboratorio. Si se utilizan parejas de cría no homocigotas, primero identifique los corazones transgénicos mediante microscopía de fluorescencia para verificar la expresión de EGFP analina y H2B-mCherry. Las señales nucleares de analina EGFP pueden detectarse más fácilmente en los bordes de las aurículas enfocando a través de sus capas tisulares.Para aislar los cardiomiocitos, coloque el número adecuado de corazones en tubos de reacción de 1,5 mililitros que contengan un mililitro de la mezcla de enzimas de un kit de disociación de corazones n

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Investigación

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Developmental Biology

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