La visualización de las variaciones del ciclo celular y la determinación de la nucleación en cardiomiocitos postnatales

El objetivo general de este procedimiento es visualizar la actividad del ciclo celular en cardiomiocitos posnatales y determinar su nuclearidad. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la regeneración cardíaca, como por ejemplo si un cardiomiocito realmente se divide o si simplemente aumenta su ploidía o se vuelve multinucleado. Las principales ventajas de esta técnica son que se puede visualizar la fase M del ciclo celular con alta resolución espacio-temporal y que los núcleos de los cardiomiocitos pueden identificarse mediante fluorescencia.

La procedura será demostrada por Patricia Freitag, una técnica de nuestro laboratorio. Si se utilizan parejas de cría no homocigotas, primero identifique los corazones transgénicos mediante microscopía de fluorescencia para verificar la expresión de EGFP analina y H2B-mCherry. Las señales nucleares de analina EGFP pueden detectarse más fácilmente en los bordes de las aurículas enfocando a través de sus capas tisulares.

Para aislar los cardiomiocitos, coloque el número adecuado de corazones en tubos de reacción de 1,5 mililitros que contengan un mililitro de la mezcla de enzimas de un kit de disociación de corazones neonatales y corte los corazones en trozos pequeños con tijeras. A continuación, transfiera la solución a tubos de reacción de 15 mililitros. Coloque el tubo en posición casi horizontal a 37 grados celsius durante 15 minutos, mezclando el tejido de cinco a 10 veces con una pipeta de cinco mililitros al final de la incubación.

Al final de la tercera digestión, detenga la reacción con 7,5 mililitros de medio dos y filtre la suspensión celular a través de un filtro celular de 70 micrones. Enjuague el filtro celular con tres mililitros de medio dos, mezclando el enjuague con las células recolectadas, y recolecte las células mediante centrifugación. Re-suspenda el sedimento en 500 microlitros de medio uno para el conteo.

Luego, siembre una vez diez a la cuarta células por pocillo en 120 microlitros de medio uno en una placa de 96 pocillos con fondo plano y centrifugue las células antes de su cultivo nocturno en una incubadora de cultivo celular. Al día siguiente, la mayoría de los cardiomiocitos deberían estar latiendo. Antes de comenzar la transfección, limpie la superficie del banco y todos los materiales de transfección con solución de descontaminación de ARNasa para eliminar cualquier ARNasa.

Cuando todos los materiales estén listos, agregue 20 microlitros de la mezcla de siRNA recién preparada a cada pocillo y regrese las células al incubador durante 48 horas. Después de dos días, reemplace el sobrenadante de cada pocillo con 120 microlitros de medio uno y regrese las células al incubador durante al menos otras 24 horas. Al final de la incubación, lave las células una vez con PBS, seguido de fijación en solución al 4% de formaldehído durante 20 minutos.

Para analizar las células mediante microscopía confocal de video, transfiera la placa a la platina del microscopio confocal e inicie el software de adquisición de imágenes. Abra la configuración de A1plus y active las casillas de los canales uno, dos, tres y cuatro. En el menú desplegable, configure el canal uno para DAPI, el canal dos para eGFP, el canal tres para RFP y el canal cuatro para Cy5.

Haga clic en el voltaje del canal y use las barras deslizantes para ajustar el voltaje a 80 en cada canal. Utilice las barras deslizantes para ajustar la compensación a cero y haga clic en el botón de inicio para colocar el diafragma en la posición inicial. Establezca el tamaño de escaneo en 1024 por 1024 píxeles en el menú desplegable.

Haga clic en optimizar para abrir la ventana de configuración del tamaño de XYZ y marque el cuadro de vóxel perfecto bajo el paso Z sugerido. Seleccione el objetivo de 20x y ajuste las intensidades del láser hasta que la imagen no esté ni subexpuesta ni sobreexpuesta. Cuando todos los parámetros hayan sido establecidos, abra el menú de adquisición. Seleccione escanear imagen grande y luego elija que la posición actual está en la esquina superior izquierda bajo área.

Luego, configure el número de campos en X y Y a tres por tres y haga clic en escanear. Para definir el número de núcleos de cardiomiocitos, haga clic en medir, medición manual y recuentos. Seleccione los núcleos con señales de H2B-mCherry, marcándolos y contándolos.

Luego, seleccione las células positivas para alfa-actinina para determinar el número de cardiomiocitos. Para contar los cardiomiocitos en fase G1, S y G2 con señales nucleares de EGFP-analina, seleccione medir, medición manual y recuentos. Marque los núcleos que expresan EGFP-analina y H2B-mCherry haciendo clic y cuente manualmente los cardiomiocitos con señales específicas de mitosis de EGFP-analina, como anillos contráctiles y cuerpos intermedios.

A continuación, haga clic en medir, medición manual y recuentos, y marque los cardiomiocitos con señales de analina EGFP específicas de mitosis, señales citoplasmáticas, anillos contráctiles y cuerpos medios. En comparación con los controles negativos, los cardiomiocitos transfectados con miARN y siARN muestran una inducción de la actividad del ciclo celular. Los cardiomiocitos que realizan endoreduplicación exhiben una expresión exclusivamente nuclear de analina EGFP, mientras que los cardiomiocitos que están en división celular muestran expresión de analina EGFP en localizaciones típicas de la fase M.

Después de la digestión enzimática del tejido cardíaco en el aparato de Langendorff, los atrios y los ventrículos pueden separarse mecánicamente y analizarse de forma independiente, lo que permite la visualización de cardiomiocitos ventriculares transgénicos H2B-mCherry con un alto número de cardiomiocitos bi-nucleados positivos para H2B-mCherry. En contraste, la mayoría de los cardiomiocitos atriales son mono-nucleados. La digestión enzimática no produce una población de células individuales al 100 %, revelando un patrón de estriación cruzada mediante la tinción de alfa-actinina, lo que facilita aún más la discriminación entre cardiomiocitos bi-nucleados, que muestran un patrón continuo de estriación cruzada, y dobletes celulares.

Para analizar el índice de bi-nucleación de los cardiomiocitos en cortes gruesos, es necesario desplazarse manualmente a través de la pila, ya que los núcleos no necesariamente se encuentran dentro de un solo plano Z, con la tinción de aglutinina de germen de trigo permitiendo la detección de los bordes celulares. Las reconstrucciones 3D de cortes fijados de corazones transgénicos de ratón adulto permiten la detección y el conteo automatizado de ganchos, núcleos teñidos y núcleos positivos para H2B-mCherry para determinar la proporción de núcleos de cardiomiocitos en condiciones fisiológicas dentro del tejido. Una vez dominada, la disociación del corazón puede completarse en dos o tres horas si se realiza adecuadamente.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar trabajar de forma continua para mantener la viabilidad de las células durante todo el experimento. Tras seguir este procedimiento, es posible analizar microARNs u otras sustancias pequeñas en busca de sus efectos inductores de la proliferación en cardiomiocitos posnatales.