Siguiente Generación de secuenciación para la detección de mutaciones procesable en tumores sólidos y líquidos

El objetivo general de este ensayo de amplicón dirigido de secuenciación de próxima generación es detectar mutaciones patógenas en los tumores de los pacientes para uso terapéutico, incluido el diagnóstico, el pronóstico y la respuesta a la terapia dirigida. Este método responde a preguntas clave, como si un paciente tiene una mutación en un gen que pueda beneficiarse de una terapia dirigida o alternativa. La principal ventaja de esta técnica es que las mutaciones accionables, tanto comunes como raras, en muchos genes se pueden detectar en cualquier tejido tumoral mediante un solo ensayo.

Debido a que las técnicas y la tecnología son tan complejas y los pasos son tan difíciles de aprender, es fundamental demostrar este método visualmente. Este es un momento decisivo en el avance de la Oncología Médica. Con la adopción de la secuenciación de próxima generación en la clínica, tendremos más y mejores tratamientos contra el cáncer para nuestros pacientes.

Nuestros tecnólogos de CPD, Barentt Li, Patrick Candrea, Karthik Ganapathy y Joe Grubb demostrarán este procedimiento. También ayudaré en este proceso para mostrar las partes más complejas del ensayo. Después de extraer el ADN genómico de acuerdo con el protocolo de texto, siguiendo el protocolo del fabricante, ejecute dos microlitros del ADN extraído en un fluorómetro para obtener la concentración de trabajo de la muestra.

Para crear una biblioteca de amplicones, en una placa semifaldón de 96 pocillos llamada placa Hyb, agregue el volumen necesario de TE con bajo EDTA, cinco mircoliteres del tubo oligonucleótido del panel, agregue de 100 a 250 nanogramos de ADN genómico a cada pocillo correspondiente. Este es el paso más vital, ya que cualquier confusión aquí tendrá graves consecuencias. Después de la adición del reactivo de hibridación de oligonucleótidos para secuenciación 1, y el centrifugado de acuerdo con el protocolo de texto, incube la placa Hyb en la incubadora de hibridación precalentada a 95 grados centígrados durante un minuto.

Después de enfriar lentamente la incubadora a 40 grados centígrados, retire la placa de la incubadora y transfiera el volumen total de cada muestra de la placa Hyb al centro de la unidad de placa de filtro prelavada o FPU correspondiente previamente preparada. Cubra la FPU y centrifugue a 2, 250 veces G y 20 grados Celsius de tres minutos. A continuación, añade 45 microlitros de SW1 y vuelve a centrifugar.

Después de un segundo lavado con SW1 y un lavado con UB1, agregue 45 microlitros de Extension Ligation Mix 3 a cada pocillo de muestra y crípolo hacia arriba y hacia abajo tres veces para mezclar. Use papel de aluminio adhesivo para sellar la placa e incube todo el conjunto de FPU en una incubadora precalentada a 37 grados Celsius durante 45 minutos. Para indexar la amplificación de PCR, coloque los cebadores en la placa de amplificación de índice, o accesorio IAP, y alícuota los índices que se utilizan en los pocillos correspondientes de la placa, luego agregue 22 microlitros de la mezcla maestra de PCR, 2E12, y crípela hacia arriba y hacia abajo tres veces.

A continuación, después de girar la reacción de ligadura de extensión de 45 minutos de acuerdo con el protocolo de texto, agregue 25 microlitros de hidróxido de sodio de 50 milimolares a cada pocillo de muestra de la FPU y cáselo hacia arriba y hacia abajo al menos seis veces, asegurándose de que la punta de la pipeta entre en contacto con la membrana. A continuación, con la placa ligeramente inclinada y una pipeta multicanal ajustada a 20 microlitros, pipetee el hidróxido de sodio en la placa FPU hacia arriba y hacia abajo al menos seis veces. Transfiera la elución de la FPU a la columna correspondiente del IAP.

Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para combinar completamente el ADN con la mezcla maestra de PCR antes de ejecutar el programa de PCR descrito en el protocolo de texto. Después de verificar el rendimiento de la biblioteca e incubar las muestras con perlas de purificación magnética de acuerdo con el protocolo de texto, agregue 30 microlitros de EBT a cada pocillo de perlas lavadas. Pipetea hacia arriba y hacia abajo varias veces para asegurarte de que las perlas se desprendan del costado del tubo.

Una vez que la placa se haya incubado y luego sin agitar, coloque la placa en el soporte magnético y transfiera 20 microlitros del sobrenadante a una placa completamente nueva llamada placa de normalización de biblioteca, o LNP. Después de la preparación de la mezcla de normalización, con inversión intermitente y vórtice de la solución, agregue 45 microlitros a cada muestra del LNP. Luego, use una película adhesiva transparente para sellar la placa y agite a 1, 800 RPM durante 30 minutos.

Después de lavar las perlas, retire el LNP del soporte magnético y, para eluir la muestra, agregue 30 microlitros de hidróxido de sodio normal 0.1 fresco a cada pocillo. A continuación, agite el LNP a 1.800 RMP durante cinco minutos. Vuelva a colocar el LNP en el soporte magnético y, una vez que el sobrenadante se haya aclarado, transfiera 30 microlitros de la elución al tampón de almacenamiento de normalización de biblioteca 1 previamente preparado en la placa de almacenamiento.

Doble la placa hacia abajo, luego agregue cinco microlitros de cada muestra para secuenciarla en un tubo de 1,5 mililitros etiquetado como Pooled Amplicon Library, o PAL. Dependiendo de la química de secuenciación que se esté utilizando, agregue de cuatro a 10 microlitros de PAL a 590 a 596 microlitros de tampón HT1. Limpie y cargue la celda de flujo.

Cargue los reactivos. Y siga las instrucciones en pantalla para iniciar la ejecución de secuenciación. Una vez completada la ejecución de la secuenciación, ejecute la canalización de Bioinfomatics.

Analice las estadísticas de ejecución para asegurarse de que la biblioteca secuenciada ha superado las métricas de control de calidad determinadas por el laboratorio. Por último, en un visor de datos genómicos, revise manualmente cada variante mediante la visualización de los archivos BAM. Este es un resumen de las estadísticas de ejecución más importantes, sin incluir la cobertura media, que se utilizan para determinar si una muestra de preparación de la biblioteca ha pasado QC.As se ve aquí para el Caso Uno, Bioinformatics detectó cuatro mutaciones asociadas a AML notificables.

Una mutación con cambio de sentido en FLT3, una mutación con cambio de sentido en IDH2 y una mutación con cambio de marco en NPM1. Se observan mutaciones en FLT3 en cerca del 25 % de los pacientes adultos con LMA. La importancia pronóstica de las mutaciones puntuales en el dominio cinasa FLT3, como se observa en este paciente con LMA, tiene un efecto poco claro en el pronóstico.

La isocitrato deshidrogenasa 2, o IDH2, codifica un modificador epigenético que suele mutar en la LMA. Las mutaciones en el gen de la nucleofosmina, o NPM1, son una de las mutaciones más comúnmente adquiridas en la LMA. Esta tabla enumera todas las variantes exónicas para el Caso Dos.

Se detectaron dos mutaciones asociadas a la enfermedad. Una inserción en el marco en el exón 20 de ERBB2 y una mutación sin sentido en TP53. HER2/neu, o ERBB2, codifica un receptor de tirosina quinasa.

Las inserciones activadoras del exón 20 de HER2/neu se observan en el 2 al 4% de los adenocarcinomas de pulmón y representan la mayoría de las mutaciones de HER2/neu observadas en el cáncer de pulmón. Los cambios en TP53 también son comunes en el cáncer. Es necesario prestar mucha atención a la calidad y la cantidad de ADN extraído.

Esto es especialmente importante para las muestras FFPE. A menudo tratamos de muy degradados con una variable, el rendimiento de ADN. Durante el proceso de validación del ensayo clínico, se deben establecer métricas para la calidad y cantidad de ADN en cada muestra antes de avanzar el ADN a la preparación de la biblioteca.

Además de la preparación de la biblioteca, es fundamental validar un plan de espionaje bioinfomático, determinando los valores de corte para la ejecución de la secuenciación, las estadísticas de control de calidad, las estadísticas de preparación de la biblioteca, la profundidad de coraje de un Amplicón y la frecuencia alélica mínima notificable. Una vez dominado, la preparación de la biblioteca se puede realizar en un día laborable. Sin embargo, el flujo de trabajo general de los ensayos requiere más tiempo para la extracción de ADN, la secuenciación, el procesamiento de datos y la revisión de variantes.

Este procedimiento está diseñado para observar solo las mutaciones genómicas del ADN en ciertos puntos calientes clave. Se pueden realizar otras masas que usan ARN para responder preguntas adicionales como una expresión diferencial de genes, asociar los tumores de riesgo y los reordenamientos estructurales. En el horizonte se vislumbran importantes avances.

La adopción de la automatización y la incorporación de un código de barras molecular único permitirá a los laboratorios reducir el tiempo de respuesta, utilizar menos entrada de muestras y detectar variantes a una frecuencia alélica muy baja. La detección de mutaciones asociadas a la enfermedad en muestras de cáncer ha sido el estándar de atención durante décadas. La NGS es un enfoque menos sesgado para secuenciar múltiples genes asociados con muchos cánceres en paralelo, lo que lleva a la identificación de múltiples mutaciones y mejores tratamientos para los pacientes.

Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.