Una base de sangre de prueba para la detección de ROS1 y RET transcripciones de la fusión de circulación de ácido ribonucleico con reacción en cadena de polimerasa Digital

El objetivo general de este procedimiento es el aislamiento y caracterización mediante PCR digital en gotas del ácido ribonucleico circulante derivado del tumor a partir de muestras de sangre total. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del diagnóstico oncológico. Por ejemplo, cómo detectar transcribidos de fusión de genes derivados de tumores a partir de muestras de ARN y sangre circulantes.

La principal ventaja de esta técnica es que utiliza métodos altamente optimizados para la estabilización, extracción y detección de variantes de ARN presentes en muestras de sangre y de baja frecuencia. Las pruebas basadas en sangre son un complemento a las biopsias de tejido tradicionales con el beneficio de utilizar una técnica mínimamente invasiva que puede proporcionar resultados rápidos. Aunque este método puede proporcionar información sobre las mutaciones clínicamente significativas y el CPNM, también se puede aplicar a otros sistemas en los que se necesita la identificación accesible y rápida de las moléculas de ARN circulantes en la sangre completa.

El ARN circulante para la reacción de transcripción inversa se aísla de muestras de sangre de donantes, como se describe en el protocolo de texto. Convierta la muestra concentrada de ARN circulante en ADNc utilizando un kit de reacción de transcripción inversa disponible en el mercado, que incluya cebadores aleatorios. Incluya una muestra de control sin transcitasa inversa y una muestra de control sin ARN.

Cuando se complete la reacción de transcripción inversa, aísle el ADNc de la mezcla de reacción, utilizando una columna de espín concentradora de ADN disponible en el mercado. Este paso facilita la eliminación de enzimas, cebadores y trifosfatos de desoxinucleótidos libres. Si el ADNc no se va a utilizar inmediatamente en las reacciones de PCR, almacene a menos 80 grados centígrados.

Use una bata de laboratorio de eliminación y guantes de nitrilo mientras realiza este procedimiento y un área dedicada a la preparación de reactivos. Cubra las sondas para protegerlas de la luz, ya que la luz sucesiva puede fotoblanquear el tinte fluorescente adherido a la sonda. Primero prepare las mezclas de PCR para un volumen de reacción final de 20 microlitros como se indica en esta tabla, pero sin agregar aún el ADNc.

A continuación, transporte las mezclas, cubiertas y protegidas de la luz a una campana de limpieza PCR, ubicada en un área de preamplificación separada. Distribuya las mezclas a una placa de PCR. Añada el ADNc que se va a analizar a la mezcla de PCR.

Cubra la placa con un sellador de placas extraíble. Centrifugar las placas brevemente para recoger las muestras en el fondo de los pocillos. Mezcle en una coctelera de platos, a fuego lento durante 10 segundos.

Vuelva a centrifugar las placas brevemente para recoger las muestras en el fondo del pozo. Retire el sellador de placas antes de realizar la generación manual de gotas. Es importante minimizar las burbujas en la punta de la pipeta al cargar las muestras y, posteriormente, transferir las gotas lentamente del cartucho a la placa para evitar daños por las gotas.

Transfiera con cuidado 20 microlitros de la mezcla de PCR a los pocillos de muestra en el cartucho de generación de gotas. Agrega 70 microlitros de aceite de generación de gotas. Cúbralo con una junta de goma y transfiera el cartucho a un generador manual de gotas para iniciar la generación de gotas.

Después de la generación de gotas, use las puntas recomendadas por el fabricante para transferir las gotas a una placa de PCR nueva. Aspire y dispense las gotas lentamente, durante 5 a 6 segundos cada una, sin tocar el extremo de la punta con el cartucho o la placa de gotas. Selle la placa con un sellador de placas de aluminio.

Realice la PCR en el termociclador utilizando los siguientes ajustes. Una vez completado el funcionamiento del termociclador, lea la placa con un lector de gotas. Cree un diseño de placa para el software del lector que identifique la ubicación de los controles y las muestras y cárguelo en el software para iniciar la lectura.

Los resultados de la lectura de la placa se analizan utilizando software disponible en el mercado. Comience navegando al menú de análisis para ver gráficos de amplitud 2 dimensionales o 2D. Evalúe la calidad general de los datos examinando los datos de gotas.

Mediante el menú de eventos, evalúe los datos para el número total de eventos aceptados. Debería haber más de 10.000 eventos por pozo. De lo contrario, los datos deben evaluarse cuidadosamente para detectar problemas adicionales.

A continuación, compruebe los datos para ver si hay amplitudes de fluorescencia abominables. Las diferencias significativas de amplitud y concentración entre las muestras replicadas indican una mala manipulación o mezcla de las muestras. Tome nota de los grupos de gotas con patrones de rociado en un eje de 45 grados, lo que es indicativo de gotas de mala calidad o muestras problemáticas.

Examine primero los datos para el control positivo, sin control de transcriptasa inversa y sin control de ARN. Seleccione todas las muestras de control y examine la calidad del clúster mediante un gráfico 2D para obtener un umbral adecuado, debe ser evidente una separación clara entre el grupo de gotas. Para cada variante de ensayo, establezca el umbral en función de los pocillos de control.

Establezca umbrales en gráficos 2D utilizando las herramientas de retícula para separar la población de gotas dobles negativas de la población de genes de control en el eje x y la población de genes variantes, si está presente, en el eje y. Algunas copias de cada pocillo de replicante para una sola muestra. Por último, exprese los resultados de la prueba como el número de copias de variantes detectadas.

Utilizando líneas celulares, que expresan la fusión SDC4-ROS1 y la fusión CCDC6-RET, diluidas en el fondo del ARN humano salvaje total, el límite de detección se establece en una frecuencia de variante del 0,2 por ciento con cada variante de fusión. No se detectó una preparación del 5 por ciento de ARN derivado de la línea celular objetivo, lo que demuestra la especificidad del ensayo. Los patrones analíticos de ARN múltiplex se midieron a concentraciones altas, medias y bajas durante tres corridas el mismo día.

Tres carreras en tres días consecutivos, y con dos operadores independientes. Los resultados demuestran la detección precisa tanto de la transcripción de fusión de interés como de un gen de control interno GUSB. Cada bach de muestras clínicas también se ejecutó con un control positivo, un control sin transcriptasa inversa y un control sin molde de ARN.

Las variantes de fusión se representan a lo largo del eje y, mientras que GUSB está en el eje x. Cuando se evaluaron los controles de lote en el transcurso de 21 días, se observaron gotas de fusión positiva y gotas de genes de control GUSB para ROS1 y RET en todas las corridas. Se muestran resultados representativos subóptimos donde hay contaminación dentro del control sin transcriptasa inversa, contaminación dentro del control sin ARN, intercambio y coalescencia de gotas, y condiciones de PCR mal optimizadas o inhibición de PCR.

Una vez dominado, todo este protocolo se puede hacer en aproximadamente 12 horas. Al intentar este procedimiento, es importante utilizar las mejores prácticas para manipular muestras de ARN y sangre humana. Tras el aislamiento del ARN, se podrían realizar otros métodos, como la secuenciación de nueva generación, para responder a preguntas adicionales, como la identificación de nuevas variantes de fusión.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo aislar el ARN circulante de la sangre total y el plasma y luego procesar el ARN recuperado para identificar variantes raras en circulación como RET y ROS1. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para la detección de mutaciones clínicamente accionables en sangre completa. Y hemos extendido estos métodos para examinar las transcripciones sobreexpresadas en circulación.