Una base de sangre de prueba para la detección de ROS1 y RET transcripciones de la fusión de circulación de ácido ribonucleico con reacción en cadena de polimerasa Digital
5 de abril de 2018
Detección de ácido ribonucleico (cRNA) de la sangre que circula es una necesidad en el diagnóstico clínico. Aquí describimos los métodos que caracterizan a cRNA de pacientes con cáncer pulmonar de células no pequeñas mediante reacción en cadena de polimerasa digital sensible y específico. Las pruebas de cumplen requisitos de diseño para detectar variantes de fusión dentro de las 72 horas.
El objetivo general de este procedimiento es el aislamiento y caracterización mediante PCR digital en gotas del ácido ribonucleico circulante derivado del tumor a partir de muestras de sangre total. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del diagnóstico oncológico. Por ejemplo, cómo detectar transcribidos de fusión de genes derivados de tumores a partir de muestras de ARN y sangre circulantes.
La principal ventaja de esta técnica es que utiliza métodos altamente optimizados para la estabilización, extracción y detección de variantes de ARN presentes en muestras de sangre y de baja frecuencia. Las pruebas basadas en sangre son un complemento a las biopsias de tejido tradicionales con el beneficio de utilizar una técnica mínimamente invasiva que puede proporcionar resultados rápidos. Aunque este método puede proporcionar información sobre las mutaciones clínicamente significativas y el CPNM, también se puede aplicar a otros sistemas en los que se necesita la identificación accesible y rápida de las moléculas de ARN circulantes en la sangre completa.
El ARN circulante para la reacción de transcripción inversa se aísla de muestras de sangre de donantes, como se describe en el protocolo de texto. Convierta la muestra concentrada de ARN circulante en ADNc utilizando un kit de reacción de transcripción inversa disponible en el mercado, que incluya cebadores aleatorios. Incluya una muestra de control sin transcitasa inversa y una muestra de control sin ARN.
Cuando se complete la reacción de transcripción inversa, aísle el ADNc de la mezcla de reacción, utilizando una columna de espín concentradora de ADN disponible en el mercado. Este paso facilita la eliminación de enzimas, cebadores y trifosfatos de desoxinucleótidos libres. Si el ADNc no se va a utilizar inmediatamente en las reacciones de PCR, almacene a menos 80 grados centígrados.
Use una bata de laboratorio de eliminación y guantes de nitrilo mientras realiza este procedimiento y un área dedicada a la preparación de reactivos. Cubra las sondas para protegerlas de la luz, ya que la luz sucesiva puede fotoblanquear el tinte fluorescente adherido a la sonda. Primero prepare las mezclas de PCR para un volumen de reacción final de 20 microlitros como se indica en esta tabla, pero sin agregar aún el ADNc.
A continuación, transporte las mezclas, cubiertas y protegidas de la luz a una campana de limpieza PCR, ubicada en un área de preamplificación separada. Distribuya las mezclas a una placa de PCR. Añada el ADNc que se va a analizar a la mezcla de PCR.
Cubra la placa con un sellador de placas extraíble. Centrifugar las placas brevemente para recoger las muestras en el fondo de los pocillos. Mezcle en una coctelera de platos, a fuego lento durante 10 segundos.
Vuelva a centrifugar las placas brevemente para recoger las muestras en el fondo del pozo. Retire el sellador de placas antes de realizar la generación manual de gotas. Es importante minimizar las burbujas en la punta de la pipeta al cargar las muestras y, posteriormente, transferir las gotas lentamente del cartucho a la placa para evitar daños por las gotas.
Transfiera con cuidado 20 microlitros de la mezcla de PCR a los pocillos de muestra en el cartucho de generación de gotas. Agrega 70 microlitros de aceite de generación de gotas. Cúbralo con una junta de goma y transfiera el cartucho a un generador manual de gotas para iniciar la generación de gotas.
Después de la generación de gotas, use las puntas recomendadas por el fabricante para transferir las gotas a una placa de PCR nueva. Aspire y dispense las gotas lentamente, durante 5 a 6 segundos cada una, sin tocar el extremo de la punta con el cartucho o la placa de gotas. Selle la placa con un sellador de placas de aluminio.
Realice la PCR en el termociclador utilizando los siguientes ajustes. Una vez completado el funcionamiento del termociclador, lea la placa con un lector de gotas. Cree un diseño de placa para el software del lector que identifique la ubicación de los controles y las muestras y cárguelo en el software para iniciar la lectura.
Los resultados de la lectura de la placa se analizan utilizando software disponible en el mercado. Comience navegando al menú de análisis para ver gráficos de amplitud 2 dimensionales o 2D. Evalúe la calidad general de los datos examinando los datos de gotas.
Mediante el menú de eventos, evalúe los datos para el número total de eventos aceptados. Debería haber más de 10.000 eventos por pozo. De lo contrario, los datos deben evaluarse cuidadosamente para detectar problemas adicionales.
A continuación, compruebe los datos para ver si hay amplitudes de fluorescencia abominables. Las diferencias significativas de amplitud y concentración entre las muestras replicadas indican una mala manipulación o mezcla de las muestras. Tome nota de los grupos de gotas con patrones de rociado en un eje de 45 grados, lo que es indicativo de gotas de mala calidad o muestras problemáticas.
Examine primero los datos para el control positivo, sin control de transcriptasa inversa y sin control de ARN. Seleccione todas las muestras de control y examine la calidad del clúster mediante un gráfico 2D para obtener un umbral adecuado, debe ser evidente una separación clara entre el grupo de gotas. Para cada variante de ensayo, establezca el umbral en función de los pocillos de control.
Establezca umbrales en gráficos 2D utilizando las herramientas de retícula para separar la población de gotas dobles negativas de la población de genes de control en el eje x y la población de genes variantes, si está presente, en el eje y. Algunas copias de cada pocillo de replicante para una sola muestra. Por último, exprese los resultados de la prueba como el número de copias de variantes detectadas.
Utilizando líneas celulares, que expresan la fusión SDC4-ROS1 y la fusión CCDC6-RET, diluidas en el fondo del ARN humano salvaje total, el límite de detección se establece en una frecuencia de variante del 0,2 por ciento con cada variante de fusión. No se detectó una preparación del 5 por ciento de ARN derivado de la línea celular objetivo, lo que demuestra la especificidad del ensayo. Los patrones analíticos de ARN múltiplex se midieron a concentraciones altas, medias y bajas durante tres corridas el mismo día.
Tres carreras en tres días consecutivos, y con dos operadores independientes. Los resultados demuestran la detección precisa tanto de la transcripción de fusión de interés como de un gen de control interno GUSB. Cada bach de muestras clínicas también se ejecutó con un control positivo, un control sin transcriptasa inversa y un control sin molde de ARN.
Las variantes de fusión se representan a lo largo del eje y, mientras que GUSB está en el eje x. Cuando se evaluaron los controles de lote en el transcurso de 21 días, se observaron gotas de fusión positiva y gotas de genes de control GUSB para ROS1 y RET en todas las corridas. Se muestran resultados representativos subóptimos donde hay contaminación dentro del control sin transcriptasa inversa, contaminación dentro del control sin ARN, intercambio y coalescencia de gotas, y condiciones de PCR mal optimizadas o inhibición de PCR.
Una vez dominado, todo este protocolo se puede hacer en aproximadamente 12 horas. Al intentar este procedimiento, es importante utilizar las mejores prácticas para manipular muestras de ARN y sangre humana. Tras el aislamiento del ARN, se podrían realizar otros métodos, como la secuenciación de nueva generación, para responder a preguntas adicionales, como la identificación de nuevas variantes de fusión.
Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo aislar el ARN circulante de la sangre total y el plasma y luego procesar el ARN recuperado para identificar variantes raras en circulación como RET y ROS1. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para la detección de mutaciones clínicamente accionables en sangre completa. Y hemos extendido estos métodos para examinar las transcripciones sobreexpresadas en circulación.
Resumen
Este artículo presenta un método para aislar y caracterizar el ácido ribonucleico circulante (cRNA) a partir de muestras de sangre de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). Mediante el uso de PCR digital por gotas, la técnica permite la detección de transcritos de fusión génica en menos de 72 horas, abordando una necesidad crítica en el diagnóstico oncológico.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Oncología
- Diagnóstico clínico
- Biología molecular
Antecedentes
- La detección de ARNc en sangre es esencial para el diagnóstico no invasivo del cáncer.
- Los métodos actuales suelen basarse en biopsias de tejido, que pueden ser invasivas.
- La PCR digital en gotas ofrece alta sensibilidad y especificidad para variantes de ARN de baja frecuencia.
- Esta técnica puede aplicarse a diversos tipos de cáncer más allá del carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC).
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método para detectar transcritos de fusión génica derivados de tumores a partir de ARN circulante.
- Proporcionar una herramienta diagnóstica rápida y mínimamente invasiva para pacientes con cáncer.
- Mejorar la comprensión de las mutaciones clínicamente significativas en el CPHN.
Métodos Utilizados
- Aislamiento de ARNc a partir de muestras de sangre completa.
- Transcripción inversa de ARNc a ADNc utilizando un kit comercial.
- Generación de gotas y amplificación por PCR del ADNc.
- Análisis de los resultados de PCR mediante software especializado para la evaluación de datos.
Resultados principales
- Detección exitosa de transcritos de fusión con un límite de detección del 0,2 % de frecuencia de variante.
- Especificidad del ensayo demostrada, sin detección de ARN fuera del blanco.
- Resultados precisos en múltiples ejecuciones y operadores.
- Separación clara de los grupos de gotas, lo que indica un correcto funcionamiento del ensayo.
Conclusiones
- El método desarrollado proporciona un enfoque confiable para detectar cRNA en muestras de sangre.
- Esta técnica puede mejorar significativamente el diagnóstico y monitoreo del cáncer.
- Las aplicaciones futuras podrían extenderse a otros tipos de cáncer y a diagnósticos basados en ARN.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método de biopsia líquida basada en sangre aborda una necesidad insatisfecha crítica en el diagnóstico oncológico al permitir la detección rápida y mínimamente invasiva de transcritos de fusión ROS1 y RET a partir de ARN circulante. El enfoque facilita la prueba temprana de hipótesis terapéuticas y la estratificación de pacientes guiada por biomarcadores en el carcinoma de pulmón no microcítico (NSCLC) y otros tumores sólidos. Al ofrecer resultados en menos de 72 horas, acelera las decisiones de avance o interrupción en los procesos de validación de dianas y de identificación de compuestos líderes.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la detección de variantes de fusión de baja frecuencia en ARN circulante.
- Valor operativo: Proporciona mediciones cuantitativas y reproducibles de la frecuencia de variantes para apoyar la evaluación de la confianza en el blanco.
- Valor predictivo: Facilita la reducción de riesgos mecanicistas mediante la validación ortogonal de la actividad oncogénica impulsada por fusiones en formato de biopsia líquida.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera entradas de ARNc estandarizadas adecuadas para el desarrollo de ensayos posteriores y campañas de cribado de biomarcadores.
- Valor operativo: Establece un flujo de trabajo robusto con un límite definido de detección (frecuencia de variante del 0,2 %) y controles de especificidad para la calificación del ensayo.
- Valor de escalabilidad: Permite la detección multiplex de ocho variantes de ROS1 y ocho variantes de RET, posibilitando la evaluación paralela de biomarcadores en cribados de descubrimiento.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor Translacional: Conecta los flujos de trabajo de descubrimiento y preclínicos al proporcionar lecturas clínicamente relevantes de biopsia líquida que reflejan los hallazgos basados en tejidos.
- Confianza Predictiva: Permite el monitoreo longitudinal de la dinámica de fusiones para orientar decisiones de avance ajustadas al riesgo en modelos preclínicos.
- Valor de Continuidad: Facilita la alineación de biomarcadores traslacionales mediante la detección de las mismas variantes de fusión identificadas en modelos tumorales utilizando muestreo no invasivo.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en la continuidad del descubrimiento, desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos iniciales, proporcionando una evaluación de biomarcadores habilitada por biopsia líquida que orienta el cribado de compuestos y el seguimiento mecanicista.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la detección de transcritos de fusión en ARN circulante para validar la relevancia del blanco en contextos semejantes al entorno in vivo.
- Cribado: Proporciona resultados cuantitativos y reproducibles de dPCR que permiten una evaluación fiable de compuestos frente a la señalización inducida por fusiones.
- Análisis: Genera lecturas digitales de copias de variantes y señales del gen de control (GUSB) para una cuantificación precisa y comparación entre diferentes condiciones.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica mediante el monitoreo de la dinámica de variantes de fusión en formato de biopsia líquida a lo largo de diferentes grupos de tratamiento.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma estandarizada y mínimamente invasiva para muestreos repetidos en estudios longitudinales y proyectos multifuncionales.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza predictiva al reducir la ambigüedad mecanicista en las vías impulsadas por fusión mediante la detección directa de biomarcadores.
- Valor operativo: Garantiza la estandarización y la reproducibilidad mediante procedimientos definidos de procesamiento de muestras, controles y establecimiento de umbrales.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir decisiones rápidas de avance o interrupción basadas en la confirmación mediante biopsia líquida del acoplamiento al objetivo.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo al proporcionar evidencia temprana de la modulación del objetivo en muestras clínicamente relevantes.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de ARN, configuración de PCR digital y generación de gotas para prevenir la degradación de la muestra y la variabilidad técnica.
- Depende de instrumentación para la generación de gotas, la amplificación por PCR y la detección de fluorescencia en un entorno controlado.
- Necesita la estandarización entre equipos en la recolección de muestras, el procesamiento y el análisis de datos para garantizar la comparabilidad entre sitios y estudios.
- Requiere adaptación del volumen de entrada y de las estrategias de control cuando se aplica a diferentes sistemas modelo o tipos de especímenes.
- Las limitaciones prácticas incluyen la necesidad de manipular cuidadosamente las gotas para evitar la coalescencia y el requisito de una frecuencia suficiente de ARN de entrada para una detección confiable.
