La utilización de la Estrategia de la cápside-Incorporación Antigen para el desarrollo de enfoques adenovirus serotipo 5-Vectored de vacunas

El objetivo general de este procedimiento es utilizar la estrategia de incorporación de tapas de antígeno para el desarrollo de enfoques de vacunas vectoriales de serotipo de adenovirus cinco utilizando un vector adenoviral divente recombinante como prueba de principio mediante el uso de la estrategia de incorporación de cápside de antígeno, se utilizan múltiples pasos de clonación para construir el plásmido modificado, A D cinco R uno K-W-S-H-V-R cinco silbidos. A continuación, el vector viral adenilo divalente. R uno K era HVR cinco.

El silbido es rescatado, propagado y purificado. A continuación, se caracterizan los títulos virales y la visualización antigénica de los antígenos incorporados en la cápside viral. Finalmente, se evalúa el potencial del vector viral Divalente Aden para eludir la neutralización por un suero D 5 positivo mediante la estrategia de incorporación de antígeno cápside.

Se utilizan múltiples pasos de clonación para construir el plásmido modificado, A D five R one K-W-A-S-H-V-R five hiss. Hoy vamos a demostrar la estrategia de incorporación de antígenos de la cápside. Esta estrategia es beneficiosa en comparación con otras estrategias como el método de expresión transgénica porque no solo muestra el antígeno de interés en el adenovirus cautivo como proteína, sino que permite una respuesta humoral robusta contra ese antígeno.

La demostración visual de este método es crítica, ya que los pasos relacionados con la generación del adenovirus modificador de la tapa son difíciles de aprender porque muchas variables contribuyen al desarrollo de los vectores virales recomendados, como la selección de las enzimas de restricción, la lente de la energía de interés en otros procedimientos. Hoy serán mis dos postdoctorados, el Dr. Lin Lin Gu y la Dra. Nitra Farrow. También Alexandre Kren, el investigador asociado en el laboratorio Para construir el plásmido lanzadera, agregue seis unidades de cada uno GE y un CCC uno a seis microgramos del HVR un fragmento de KWA.

Incubar la reacción de digestión a 37 grados centígrados durante tres horas. Resuelva el fragmento digestivo en un gel 2%agros por electroforesis y utilice un kit de extracción de gel de ADN según el protocolo del fabricante para purificar el fragmento. A continuación, ligar 12 nanogramos del fragmento purificado en los sitios a G one y ACC one de los 100 nanogramos del plásmido lanzadera previamente construido.

HVR cinco, silbido, seis, pH, cinco s y un volumen de reacción de 10 microlitros a temperatura ambiente durante dos horas. A continuación, añada un microlitro de la reacción de ligadura a 50 microlitros de cinco pilas alfa DH electrocompetentes, un electro ocho antes de añadir 950 microlitros de medio SOC. Incubar las células transformadas a 37 grados Celsius y 200 RPM durante una hora antes de esparcir de 100 a 200 microlitros del cultivo en una placa LB CNY.

Incubar durante la noche a 37 grados centígrados. Utilice seis unidades de Echo R one y PME one para digerir seis microgramos del plásmido de lanzadera purificado a 37 grados centígrados durante tres horas. Después de purificar el fragmento que contiene los brazos de recombinación homólogos y el gen del exón cinco modificado dualmente, use SUA uno para linealizar el plásmido de la columna vertebral, PAD cinco, delta H cinco para llevar a cabo la recombinación homóloga.

Utilice la electroporación para cotransformar 100 nanogramos de cada uno de los fragmentos de lanzadera purificados y el plásmido de la columna vertebral en 50 microlitros de celdas BJ 5 180 3 electrocompetentes. Como se demostró anteriormente en este video, al día siguiente, recoja aproximadamente 10 colonias en tres mililitros de LB líquido que contenga micina y crezca durante la noche antes de la detección de acuerdo con el protocolo de texto. A continuación, transforme 100 nanogramos de plásmido purificado en células alfa DH cinco, como se ha demostrado anteriormente, para rescatar el vector viral añadido.

Comience usando PAC one para linealizar 15 microlitros del vector en un volumen de 100 microlitros. Incubar a 37 grados centígrados durante tres horas después de la digestión. Para extraer el plásmido linealizado bajo una campana extractora.

Agregue un volumen igual de cloroformo fenol, alcohol isoamílico a la centrífuga de reacción a 10, 000 G durante un minuto y recoja el sobrenadante antes de repetir la extracción y centrifugar hasta el volumen extraído. Añadir 300 microlitros de etanol al 100% y 10 microlitros de acetato centrifugar a 10.000 g durante 10 minutos. Luego, después de desechar el sobrenadante, agregue 700 microlitros de etanol al 70% antes de volver a centrifugar.

Una vez que se ha resuspendido el pellet y se ha cuantificado el ADN, transfecte tres microgramos del plásmido linealizado junto con el reactivo de transfección liposomal comercial en un matraz T 25 previamente preparado de células HEK 2 93 confluentes al 80% de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de incubar durante seis horas, reemplace el medio de transfección con medio completo antes de devolver el matraz a la incubadora. Cuando las placas desarrollen un efecto citopático completo o CPE bajo una campana estéril, raspe las células restantes del matraz y centrifugue el cultivo a 300 g y cuatro grados Celsius durante 10 minutos.

A continuación, utilice un mililitro de medio que contenga un 2% de FBS para resuspender el pellet de la célula. A continuación, rompa las células realizando cuatro rondas de congelación y descongelación, luego centrifugue el lisado a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Recolectar el sobrenadante S que contiene el virus rescatado para propagar el vector viral en un cultivo a gran escala.

Un tercio de todo el lisado viral del matraz T 25 en un matraz T 75 que contiene células HEK 2 93. Después de permitir que se desarrolle el CPE completo y recolectar el supinato como se demostró anteriormente, propague la mitad de todo el virus en uno o más. A continuación, los matraces T 1 75 de células HK 2 93 propagan el virus aislado de los matraces T 1 75 en una docena o más.

T 1 75 frascos de células después de preparar un punto 33 gramos por mililitro y 1,45 gramos por mililitro. Las soluciones de cloruro de cesio agregan cuatro mililitros, 1,33 gramos por mililitro, cloruro de cesio a un tubo ultracentrífugo y agregan cuatro mililitros, 1,45 gramos por mililitro, cloruro de cesio contra el fondo del mismo tubo. Agregue cuatro mililitros de supinato de lisado viral en la parte superior del mismo tubo, luego centrifugue el tubo a 110, 000 G y cuatro grados Celsius durante tres horas.

Esto separará la banda de virus inferior madura de la banda de virus superior defectuosa debajo del capó. Use una aguja de calibre 33 conectada a una jeringa de tres mililitros para recoger la banda inferior. Luego usa cinco hippies para llevar la solución a cuatro mililitros.

Luego, después de preparar dos gradientes más de cloruro de cesio, cargue el virus diluido encima y centrifugue los gradientes a 110, 000 G y cuatro grados Celsius durante la noche. Bajo el capó. Recoge la banda viral como se acaba de demostrar.

A continuación, utilice una aguja de calibre 33 y una jeringa de tres mililitros para inyectar la solución del virus en un casete de diálisis. Se colocó un casete en 700 mililitros de un tampón de diálisis preparado según el protocolo de texto, reemplazando el tampón cuatro veces cada tres horas. Luego, con una aguja y una jeringa.

Recoja la solución viral del casete para determinar el título físico viral. Utilice el tampón de lisis viral para diluir tanto el virus como el tampón de diálisis utilizados como control de fondo en uno a 10 y uno a 20 e incube todos los tubos a 56 grados centígrados durante 10 minutos. Encienda un fotómetro biológico y establezca el modo de absorbancia en una densidad óptica de 260 nanómetros.

Utilice el tampón de diálisis diluido de uno a 10 para equilibrar la señal de fondo haciendo clic en el botón en blanco. Escriba 10 más 90 en la pantalla del fotómetro biológico. Reemplace el tubo con un tubo de virus diluido de uno a 10 y lea la señal del virus diluido de uno a 10.

Para medir la dilución de uno a 20, use el tampón de diálisis diluido a uno a 20 para equilibrar el fondo escribiendo cinco más 95 en la pantalla antes de reemplazar el tubo tampón con un tubo de virus diluido de uno a 20 y leer la señal. Multiplique los dos números de lectura del virus por 1,1 por 10 elevado a 12 y calcule el título promedio con unidades de VP por mililitro en función de los dos títulos individuales de las dos diluciones. Evalúe el virus en ratones de acuerdo con el protocolo de texto para demostrar si el virus rescatado muestra el antígeno antigénico del VIH y la etiqueta hist en la superficie de la cápside viral.

Proteína principal Heon cinco. Eliza se llevó a cabo con el anticuerpo monoclonal humano dos F 5 y el anticuerpo monoclonal anti etiqueta silbido de ratón respectivamente, como se muestra aquí, tanto el anticuerpo humano dos F 5 como el anticuerpo anti silbido de ratón unidos a la partícula divalente del virus add five, mientras que no hubo unión al control negativo. Se utilizó un análisis de sangre occidental de cinco vectores para confirmar los datos de E iza, ya que tanto el anticuerpo humano de dos F cinco como el anticuerpo antisilbido de ratón detectaron bandas específicas alrededor de 117 kilodaltons solamente.

En el DIVALENTE agregue cinco virus, que corresponde al tamaño de la proteína Heon cinco. Para evaluar el potencial del virus construido add five para eludir la neutralización mediante add five positivos, se llevó a cabo un ensayo de neutralización. Los resultados muestran que las unidades luminiscentes relativas o rlu fueron 12 veces mayores cuando el vector de adición de cinco veces se trató sin suero positivo de adición de cinco que cuando se trató con suero, lo que sugiere que el virus fue neutralizado.

Por el contrario, hubo poca diferencia en el uso de R para el virus AD 5 divalente construido entre las muestras tratadas y no tratadas, lo que sugiere que el virus construido escapó a la neutralización. Después de ver este video, debería tener una mayor comprensión del enfoque de incorporación de antígeno de la cápside para el desarrollo de vacunas de vectores adicionales. Actualmente, estamos utilizando esta estrategia en combinación con vectores de serotipo raros.

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