Análisis de Yersinia enterocolitica Efector translocación en las células huésped Usando beta-lactamasa Efector fusiones

El objetivo general del siguiente experimento es medir la translocación de proteínas efectoras a las células huésped a través del sistema de secreción de tipo tres de vernia. Esto se logra mediante la incubación de células heela con mutantes de yersinia que expresan fusiones de betalactamasas efectoras TEM one para permitir la translocación de fusiones efectoras en las células HELOC. Como segundo paso, las células HELOC infectadas se cargan con un compuesto reportero de traste permeado por la célula, que es procesado por el estro celular a la carga en CCF fluorescente cuatro y, por lo tanto, atrapado dentro de la célula.

A continuación, la escisión de CCF cuatro por la betalactamasa translocalizada da lugar a la interrupción de la fre, que se registra mediante microscopía de barrido láser para analizar las intensidades de fluorescencia del donante y del aceptor. Los resultados muestran diferentes cantidades de TEM efector translocalizado y una fusión de beta lactamasas en función de diferentes cinéticas de aumento de la fluorescencia del donante. Una de las principales ventajas de esta técnica sobre los métodos existentes es que el procesamiento intercelular del compuesto CCF cuatro proporciona una herramienta altamente específica y sensible para medir la translocación.

El método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la patogénesis bacteriana, como la forma en que se ajusta la translocación durante la interacción de las bacterias y las células huésped un día antes de la infección. Inocular tres viales separados que contengan tres mililitros de medio LB y los antibióticos requeridos con una colonia de cada una de las cepas transformadas de Y enterocolitica preparadas como se describe en el protocolo de texto adjunto. Además, prepare placas que contengan células de heela el día antes de la infección sembrando 15.000 células en 200 microlitros de medio de cultivo en nueve pocillos de una placa de 96 pocillos, incube las células en una incubadora de CO2 al 5% a 37 grados centígrados el día de la infección.

Inocular dos mililitros del cultivo durante la noche en 40 mililitros de medio lb fresco sin antibióticos. Incubar las bacterias durante 90 minutos a 37 grados centígrados en un agitador a 180 RPM. Esto inducirá la expresión del sistema de secreción de tipo tres después de 90 minutos, transferirá los cultivos a un tubo nuevo y mantendrá los cultivos en hielo.

A partir de este momento. Centrifugar los cultivos durante 10 minutos a 5.000 g y cuatro grados centígrados para pellet las bacterias. A continuación, vuelva a suspender el pellet en dos o tres mililitros de PBS helado, diluya la suspensión de bacterias a una concentración de 800 millones de unidades formadoras de colonias por mililitro y luego coloque los cultivos en hielo.

A continuación, determine la densidad óptica correspondiente de cada cultivo. Añadir 3,5 microlitros de la suspensión bacteriana de cada cepa a diferentes pocillos de los 96 preparados. Coloque y mezcle pipeteando suavemente el medio dos veces, permita que las bacterias se sedimenten en las células en un grado de infección de aproximadamente 100 bacterias por célula.

Realice un curso de tiempo iniciando las infecciones a intervalos de 30 minutos y manteniendo las células en una cámara de CO2 al 5% a 37 grados centígrados. Después de cada infección, 90 minutos después de la primera infección, aspire cuidadosamente el medio sin eliminar ninguna de las células hela. Luego agregue 50 microlitros de PBS que contienen 20 microgramos por mililitro de cloranfenicol y 2,5 milimolares de pronico.

Esto detendrá la expresión de efectores y reducirá la exportación de CCF cuatro. Para preparar la microscopía, asegure una inmersión continua esparciendo el medio de inmersión hasta el fondo de los pocillos, utilizando una jeringa de un mililitro. Evite atrapar burbujas de aire en el medio de inmersión.

A continuación, transfiera la placa de 96 pocillos a la platina del microscopio y localice los puntos adecuados para su posterior análisis en cada uno. Bueno, termine este paso en 10 minutos. Luego agregue 70 microlitros de solución de carga CF 4:00 AM en cada uno.

Incubar bien la placa durante cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, aspire la solución de carga y agregue 100 microlitros de PBS que contengan 20 microgramos por mililitro de cloranfenicol y 2,5 milimolares de pronico. A continuación, inicie rápidamente la microscopía.

Coloque un objetivo de inmersión de alta apertura numérica con aumento de 20 veces en su lugar y abra el orificio del detector a 2,5 unidades aireadas y transfiera la placa de 96 pocillos a la etapa de escaneo láser confocal. A continuación, elija detectores de fosfato de arseniuro de galio de alta sensibilidad con canales donantes y aceptores activos simultáneamente. Profundidad de ocho bits, triple marco promediado y excitado con el 10% de un láser de diodo de 405 nanómetros.

Para garantizar una cuantificación correcta, ajuste la ganancia del detector de ambos canales al mismo valor y evite los píxeles saturados. A continuación, active la luz transmitida y vuelva a verificar los campos de visión representativos en cada uno, ajuste y vuelva a guardar las posiciones según sea necesario utilizando una etapa automática calibrada. Finalmente, establezca el lapso de tiempo en dos minutos, la duración en dos horas y comience a adquirir imágenes.

Después de la adquisición de la imagen, importe el conjunto de datos en un software que permita cálculos aritméticos de matrices de píxeles. Reste el fondo en ambos canales usando el mismo desplazamiento haciendo clic primero en el menú, y luego vaya al procesamiento de imágenes y seleccione la resta de línea base. A continuación, seleccione cada canal e introduzca el valor de referencia.

Corrija el sangrado a través del canal donante, el canal uno en el canal aceptor dos con el factor de corrección predeterminado, creando un nuevo canal canal dos principal para este fin. Haga clic en el menú y luego seleccione Procesamiento de imágenes seguido de Aritmética de canales e ingrese el valor absoluto del canal dos restado por punto 33 veces. Canal uno Posteriormente, elimine el canal dos y asegúrese de que el sangrado a través del canal del aceptador corregido permanezca como el nuevo canal dos.

A continuación, cree un nuevo canal con la operación que se muestra aquí para determinar el coeficiente de traste relativo. A continuación, vuelve al menú de aritmética de canales e introduce el canal dos dividido por el canal uno más el canal dos para una correcta visualización del canal de trastes. En una imagen de ocho bits, cree un cuarto canal canal cuatro, que es igual a 255 veces canal tres.

Cambie el color del canal yendo al menú de propiedades de la imagen, seleccione el canal cuatro, luego el color asignado, seguido del archivo de tabla de colores y seleccione jet. A continuación, aplique un filtro de mediana de tres por tres a los canales tres y cuatro. Eso reducirá el ruido en las imágenes ingresando al menú de procesamiento de imágenes y seleccionando suavizado.

Seguido del filtro mediano, seleccione ambos canales y aplique un tamaño de filtro de tres en tres por uno para la cuantificación de las señales celulares. Detecte las celdas en el canal cuatro seleccionando vista de repaso y haciendo clic en el icono. Agregue nuevas superficies.

Defina los parámetros del algoritmo de detección en la ventana de superficie y active las dos casillas de verificación. Segmente solo una región de interés y procese la imagen completa. Por último, a continuación, defina la región de interés editando sus dimensiones.

Seleccione el canal cuatro como canal de origen y establezca el umbral yendo al menú de umbrales y seleccionando en la sustracción de fondo. Ajuste el diámetro a 10 micrómetros, el umbral de intensidad mínima manualmente a cero y el umbral máximo a la intensidad máxima. Filtre las estructuras por área y establezca el valor mínimo en 187 micrómetros cuadrados.

A continuación, finalice la detección de la superficie. Por último, extraiga los valores medios de la intensidad de fluorescencia del donante en el canal uno y el coeficiente de fret relativo en el canal tres, junto con sus desviaciones estándar en la entidad celular. Para demostrar la capacidad de este método para analizar cuantitativamente la translocación de efectores en células diana, se estudiaron dos cepas de yersinia con diferentes cinéticas de translocación utilizando coeficientes de fluorescencia del donante y de traste relativos.

Las células infectadas de tipo salvaje muestran un aumento de la intensidad de la fluorescencia con el tiempo. Como se esperaba, la pendiente máxima de la intensidad de la fluorescencia se correlaciona positivamente con la duración de la infección, lo que indica que se pueden distinguir diferentes concentraciones de beta lactamasas traducidas de acuerdo con estudios previos. Las células infectadas con el mutante de deleción YOPE de yersinia exhiben un aumento más rápido de la intensidad de fluorescencia en comparación con la cepa de tipo salvaje.

Curiosamente, la expansión de la infección a 90 minutos no aceleró aún más el aumento de la fluorescencia del donante en comparación con los 60 minutos de infección Al intentar este procedimiento, es importante tener en cuenta que el procesamiento del compuesto CCR cuatro comienza inmediatamente después de su adición. Por lo tanto, es importante iniciar la adquisición de imágenes a tiempo.