Tinción rápida de Golgi para la visualización de la columna dendrítica en el hipocampo y la corteza prefrontal
3 de diciembre de 2021
El protocolo describe una modificación del método rápido de Golgi, que se puede adaptar a cualquier parte del sistema nervioso, para teñir las neuronas en el hipocampo y la corteza prefrontal medial de la rata.
Aunque es relativamente simple, la técnica de impregnación de Golgi tiene algunos pasos complicados y el hecho de no hacerlos correctamente da como resultado células que no son aptas para el análisis. Esta técnica proporciona un etiquetado rápido y reproducible de las neuronas impregnadas de Golgi. Y además, el pequeño error estándar de la media permite la comparación entre experimentos.
La parte más desafiante de esta técnica es cortar las secciones de criostato, porque hay una consistencia y fijación inusuales, y por lo tanto, ponerlas en el tobogán plano es un poco un desafío requiere práctica. Primero, coloque una pequeña cantidad de tejido mediano en un mandril de criostato preenfriado. Monte los bloques cerebrales en los mandriles de criostato descongelando un lado del bloque ligeramente en una mano enguantada y colocándolo en el medio de tejido.
Use un aerosol de congelación en el cuchillo y el bloque. Use la placa antivuelco o el cepillo para mantener la sección plana mientras corta. Corte secciones de 100 micrómetros en un criostato a menos 22 grados centígrados.
Descongele el soporte, si es posible, mediante el uso de un tobogán a temperatura ambiente y oponga rápidamente a la sección. Alternativamente, mantenga las diapositivas en el criostato, para que se congelen. Transfiera la sección con pinzas frías o un pincel frío y luego descongele el soporte.
Montar tres o cuatro secciones coronales en subsidios. Limpie el cuchillo con toallitas de papel entre rodajas. Si el cuchillo requiere una limpieza adicional, use etanol 100% y séquelo antes de cortar la siguiente rebanada.
Coloque las correderas en bastidores, espaciadas lo suficiente como para permitir el acceso de la solución a las secciones. Coloque las secciones en agua destilada dos veces durante cuatro minutos antes de colocarlas en la solución de impregnación de Golgi durante 10 minutos. Separe los resbalones de la cubierta para asegurarse de que solo se coloque un resbalón de la cubierta en las secciones.
Cubra los portaobjetos de vidrio con una cantidad generosa de medio de montaje antes de colocar un resbalón de cubierta de vidrio en el portaobjetos. Una vez que la cubierta se desliza, los toboganes secos se marcan en cualquier papel no poroso durante tres a cinco días, moviéndolos ligeramente, especialmente después del primer día para evitar que se peguen. Más tarde, transfiera las diapositivas a los soportes de diapositivas e idealmente, seque las diapositivas durante al menos tres semanas antes de examinarlas.
Para analizar la densidad de la columna dendrítica en neuronas piramidales tanto de la corteza prefrontal medial como de la región CA1 del hipocampo, mida la longitud dendrítica utilizando en el programa de análisis de imágenes. Cuente las espinas en las dendritas usando un contador de manos y registre tanto la longitud como el número de espinas. Para el análisis, elija neuronas con cuerpos celulares y dendritas mientras están impregnadas, y dendritas que sean continuas y distinguibles de las células adyacentes.
La figura muestra ejemplos de células impregnadas de Golgi en la región CA1 del hipocampo que se muestra a baja y alta potencia. La figura ilustra un experimento en el que la densidad de la columna vertebral dendrítica basal se incrementó en células piramidales en ratas macho y hembra adolescentes después del enriquecimiento ambiental en CA1 y la corteza prefrontal medial. Es un desafío mantener las secciones lo suficientemente frías al cortar y usamos una gran cantidad de aerosol de congelación para hacerlo.
Y luego, posteriormente, es difícil colocar las secciones en los toboganes y hacer que se sequen planas. Esta técnica se utiliza para examinar las características neuroanatómicas. Se puede utilizar solo o en combinación con otros métodos de rastreo neuroanatómico.
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Descripción general
Este estudio describe un método Golgi rápido modificado para la tinción específica de neuronas en el hipocampo y la corteza prefrontal medial de ratas. La técnica permite una etiquetación eficaz de las neuronas, lo que posibilita el análisis de las características neuroanatómicas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Neuroanatomía
- Biología celular
Antecedentes
- La técnica de impregnación de Golgi es un método bien establecido para la tinción de neuronas.
- La aplicación permite la investigación de la estructura dendrítica y la densidad de espinas.
- El método puede adaptarse a diversas regiones del sistema nervioso.
- Existen dificultades al cortar secciones en criostatos debido a la consistencia del tejido.
Objetivo del estudio
- Mejorar el método de Golgi existente para lograr una mejor marcación neuronal.
- Investigar la densidad de espinas dendríticas en regiones cerebrales específicas.
- Explorar los efectos de factores ambientales sobre la morfología neuronal.
Métodos Utilizados
- Técnica de impregnación Golgi rápida en tejidos cerebrales de rata.
- Alta precisión al cortar secciones criostáticas de 100 micrómetros.
- Técnicas de descongelación para montar correctamente las secciones sobre portaobjetos.
- Incubación en solución Golgi para una tinción neuronal eficaz.
- El análisis incluyó la medición de la longitud dendrítica y el conteo de espinas mediante software de análisis de imágenes.
Resultados principales
- La técnica dio como resultado una marcación reproducible de neuronas adecuada para el análisis.
- Las evidencias mostraron un aumento en la densidad de espinas en neuronas piramidales tras el enriquecimiento ambiental.
- Se observó una identificación exitosa de los cambios en la densidad de espinas dendríticas basales en ratas adolescentes de ambos sexos.
Conclusiones
- Este estudio valida el método Golgi modificado como un enfoque confiable para el análisis neuroanatómico.
- Los conocimientos sobre la densidad de espinas dendríticas contribuyen a comprender la plasticidad neuronal.
- Las aplicaciones futuras podrían incluir la evaluación de las influencias ambientales sobre la morfología cerebral.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método rápido de tinción Golgi proporciona un enfoque reproducible y de baja variabilidad para visualizar la densidad de espinas dendríticas en regiones cerebrales clave relacionadas con modelos de enfermedades neuropsiquiátr游戏副本
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar hipótesis terapéuticas relacionadas con la plasticidad sináptica y la morfología dendrítica en circuitos neuronales relevantes para enfermedades.
- Valor operativo: Proporciona mediciones estandarizadas y cuantitativas de la densidad de espinas por cada 10 µm de dendrita para permitir comparaciones fiables entre experimentos.
- Valor predictivo: Facilita la reducción del riesgo biológico al vincular la neuroanatomía estructural con resultados funcionales en modelos de enriquecimiento ambiental y farmacológicos.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Listo para el ensayo: Produce neuronas consistentemente bien impregnadas con un mínimo de restos de fondo, lo que permite una visualización y conteo fiables de las espinas dendríticas.
- Reproducibilidad: Muestra desviaciones extremadamente pequeñas en la densidad de espinas entre experimentos, lo que respalda la precisión del ensayo y el poder estadístico.
- Escalabilidad: Permite la acumulación del tejido cerebral y su almacenamiento congelado hasta el procesamiento, facilitando el procesamiento por lotes y la eficiencia del flujo de trabajo en las líneas de descubrimiento.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Aplicable a regiones del hipocampo y la corteza prefrontal implicadas en modelos de cognición, depresión y esquizofrenia.
- Continuidad traslacional: Permite el análisis de la densidad de espinas como lectura alineada con biomarcadores para evaluar los efectos de compuestos sobre la estructura neuronal.
- Reducción del riesgo mecanicista: Relaciona cambios estructurales (por ejemplo, el aumento de la densidad de espinas tras un enriquecimiento ambiental) con la plasticidad funcional, apoyando la confianza en los objetivos de programas del SNC.
Integración de la Línea de Procesamiento y del Flujo de Trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación temprana del blanco hasta la selección fenotípica preclínica, especialmente para programas centrados en el SNC que evalúan la neuroplasticidad y la integridad sináptica.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre la estructura dendrítica y la densidad de espinas como indicadores de la salud sináptica y la conectividad neuronal.
- Selección: Proporciona resultados cuantitativos y reproducibles (número de espinas por 10 µm de dendrita) adecuados para análisis de alto contenido y comparación de efectos de compuestos.
- Análisis: Permite la comparación estadística de la densidad de espinas entre diferentes condiciones mediante análisis de imágenes y conteo manual, con un bajo error estándar de la media que aumenta la confianza en los datos.
- Investigación Traducional: Se alinea con la validación preclínica al ofrecer lecturas estructurales que se correlacionan con resultados funcionales en modelos de aprendizaje y memoria.
- Reutilización Empresarial: Representa una plataforma neuroanatómica estandarizada y reutilizable, aplicable a múltiples regiones cerebrales y modelos de enfermedad.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad mecanicista en las evaluaciones de plasticidad sináptica.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y la estandarización mediante una impregnación constante, fondo bajo y mínima varianza entre experimentos.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar datos neuroanatómicos confiables para priorizar compuestos con efectos demostrables sobre la estructura dendrítica.
- Impacto en la cartera: Permite un avance ajustado al riesgo mediante la cuantificación de biomarcadores estructurales del SNC asociados a resultados cognitivos y conductuales.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el corte con criostato y en el manejo de tejidos para mantener la planicidad e integridad de las secciones durante el corte a -22°C.
- Depende de técnicas adecuadas de montaje por descongelación y del uso de la placa antirrolido o del pincel para prevenir daños en las secciones durante la transferencia a las portaobjetos.
- Necesita tiempos estandarizados de tinción (10 min en solución de Golgi) y aplicación del medio de montaje para garantizar una marcación neuronal consistente.
- Implica períodos prolongados de secado (3–5 días inicialmente, luego ≥3 semanas) antes de la obtención de imágenes, lo que requiere una planificación anticipada del flujo de trabajo.
- Depende de personal capacitado para el conteo preciso de espinas dendríticas y la medición de su longitud mediante herramientas de análisis de imágenes y contadores manuales.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:48
Sectioning of Brain Tissues and Mounting
2:04
Staining and Dehydration of Brain Tissue
3:06
Determination of Dendritic Spine Density
3:48
Results: Observation of Hippocampus and Effect of Environmental Enrichment on CA1 and mPFC
4:23
Conclusion
