Name: Tinción rápida de Golgi para la visualización de la columna dendrítica en el hipocampo y la corteza prefrontal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 58 s
Description: Aprende la técnica de impregnación rápida de Golgi para visualizar neuronas en el hipocampo y corteza prefrontal de ratas. Este método permite analizar la densidad de espinas dendríticas y la plasticidad neuronal.

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Este trabajo fue apoyado por Sacred Heart University Undergraduate Research InitiativeGrants.

Todos los procedimientos experimentales están aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad del Sagrado Corazón y están de acuerdo con la Guía de los NIH para el Cuidado y Uso de Animales.
1. Aislamiento e infiltración del tejido cerebral
<ol><li>Soluciones de premezcla A y B del kit de tinción Golgi 24 h antes de su uso y conservar en botellas oscuras y/o en oscuro. Haga aproximadamente 80 ml de mezcla de solución A y B, que es suficiente para cambiar la solución después de 24 h. Almacenar en botellas herméticas. NOTA: La perfusión con solución salina o paraformaldehído no es necesaria.</li>
	<li>Sacrifica ratas con guillotina después de la eutanasia con dióxido de carbono y elimina los cerebros en cuestión de segundos. Enjuague los cerebros con solución salina si es necesario pero no es necesario.<ol>
<li>Coloque el cerebro, la corteza hacia abajo para que el hipotálamo sea visible porque los cortes se hacen anteriores y posteriores a él, sobre una superficie no porosa. Corte en un bloqueo anterior (contiene la corteza prefrontal) y posterior (contiene el hipocampo) como se muestra en la Figura 1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque los bloques en las soluciones premezcladas de A y B, asegurándose de que estén bien inmersos en la solución. Asegúrese de que el volumen de soluciones A y B sea suficiente para sumergir los bloques. Guarde los bloques en botellas marrones o botellas transparentes cubiertas con papel de aluminio (para mantener la luz apagada) en la oscuridad a temperatura ambiente.</li>
	<li>Reemplace la solución después de 24 h y manténgala en la oscuridad durante otros 13 días a temperatura ambiente. NOTA: Si se usa con cerebros de ratón, no hay necesidad de bloquear, y todo el cerebro se puede colocar en la solución. Si se tiñen áreas cerebrales, que son diferentes en tamaño, el tiempo en las soluciones A y B puede tener que determinarse por ensayo y error.</li>
	<li>Después de dos semanas, el tejido se infiltra bien con las soluciones A y B, transfiera los bloques a la solución crioprotectora (solución C en el kit de tinción Golgi) y déjelos durante 48-72 h a 4 ° C. NOTA: Después de la crioprotección, los bloques pueden congelarse hasta su posterior procesamiento. Además, tenga en cuenta que todas las soluciones del kit se recogen y eliminan como residuos peligrosos.</li>
	<li>Congela el cerebro, la corteza hacia abajo, en un portaobjetos de vidrio sobre hielo seco. Una vez congelado, corte el criostato o guárdelo a -80 °C hasta seccionar con un criostato. NOTA: No congele en nitrógeno líquido ya que esto produce grietas en el tejido.</li>
</ol>2. Seccionamiento de los tejidos cerebrales
<ol><li>Coloque una pequeña cantidad de tejido mediano en un mandril de criostato preenfriado. Monte bloques en mandriles de criostato descongelando un lado del bloque ligeramente en la mano (enguantado) y colocándolo en el medio de tejido. NOTA: No es necesario incrustar el tejido. El bloque que contiene el hipocampo es algo más fácil de cortar que el bloque con la corteza prefrontal porque este último es anterior al cuerpo calloso y las dos mitades están separadas.</li>
	<li>Cortar secciones de 100 μm en un criostato a -22 °C y montar en portaobjetos subtitulados. Se pueden utilizar secciones de hasta 150 μm de espesor. Intente montar 3-4 secciones coronales por diapositiva, ya que esto disminuye el número de diapositivas que requieren procesamiento. Utilice una de las siguientes técnicas para mantener las secciones congeladas hasta que suban a la diapositiva. NOTA: Estas secciones no se fijan de la manera habitual y, por lo tanto, tienden a derretirse rápidamente. Permita que las secciones se derritan en la diapositiva. Si comienzan a derretirse antes de colocarse en el tobogán, es imposible conseguir que estén planos en el tobogán. Hay varias técnicas para hacer esto.<ol>
<li>Use un aerosol de congelación en el cuchillo y el bloque. Dependiendo de la temperatura y la humedad en la habitación, esto puede ser necesario para cada sección. Use la placa antivuelco o un cepillo para mantener la sección plana mientras corta. NOTA: Asegúrese de tener suficiente aerosol de congelación. Se pueden usar varias latas al cortar 20 bloques.</li>
		<li>Descongele el soporte, si es posible, mediante el uso de un tobogán a temperatura ambiente y adjúntelo rápidamente a la sección. Con la práctica, uno puede montar varias secciones a la vez. Si esto no funciona, mantenga las diapositivas en el criostato para que estén muy frías y transfiera la sección con pinzas frías o un pincel frío y luego descongele el soporte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Limpie el cuchillo con toallitas de papel entre rodajas. Si el cuchillo requiere más limpieza, use etanol 100% (EtOH) y déjelo secar antes de cortar la siguiente rebanada.</li>
	<li>Una vez montado en el tobogán, coloque el portaobjetos plano sobre bandejas deslizantes de cartón y deje que las secciones se sequen a temperatura ambiente (durante varias horas hasta un máximo de 48 h) en la oscuridad. No cubra la bandeja deslizante. Asegúrese de que las secciones estén completamente secas antes de la impregnación de Golgi. Conservar plano, en la oscuridad, en bandejas deslizantes hasta la impregnación de Golgi. NOTA: El secado de las secciones no causa ningún daño.</li>
</ol>3. Tinción y deshidratación del tejido cerebral
<ol><li>Realizar tinción en platos de tinción de vidrio. Mezcle las soluciones D y E inmediatamente antes de la tinción. Según el protocolo, agregue una parte de la solución D, una parte de la solución E y dos partes de agua destilada. Para platos de tinción de vidrio, haga una solución de 200 ml para sumergir completamente las secciones. Para los frascos Koplin, esto requiere menos volumen.</li>
	<li>Coloque las correderas en bastidores lo suficientemente separados como para permitir el acceso de la solución a las secciones.</li>
	<li>Coloque las secciones en agua destilada durante 4 min (2x) antes de colocarlas en la solución de tinción por impregnación de Golgi durante 10 min. Cambie la solución de tinción cada 70 secciones. Cambie el agua destilada cuando se vuelva amarilla. NOTA: El momento para el paso de tinción es crítico. Demasiado corto no permite suficiente tinción y demasiado largo causa sobremanchas, lo que hace que las dendritas sean difíciles de separar al hacer análisis. Una vez fuera de la solución de tinción, el momento es menos crítico.</li>
	<li>Deshidrate las secciones de la siguiente manera: 70% EtOH (5 min), 95% EtOH (5 min; 2x), 100% EtOH (5 min; 2x), agente de compensación (5 min; 3x). Cambie todas las soluciones con frecuencia, especialmente el EtOH 100% y el agente de compensación para garantizar que las secciones permanezcan anhidras. NOTA: No es necesario pasar por un paso de EtOH del 50%. La contratinción no es necesaria para la visualización celular porque la impregnación de Golgi proporciona suficiente contraste. El uso de otros agentes de compensación no ha funcionado tan bien como el utilizado aquí (ver Tabla de materiales).</li>
	<li>Funda con fundas de vidrio de 60 mm de largo con una generosa cantidad de medio de montaje. Asegúrese de que haya la menor cantidad de burbujas de aire posible. Si es necesario, retire con cuidado y vuelva a hacer el deslizamiento (se puede hacer incluso semanas después). Haga esto muy lentamente para no dañar la sección (se puede hacer debido a la gran cantidad de medio de montaje). NOTA: Una gran cantidad de medio de montaje es algo desordenado, pero sigue siendo necesario porque se debe usar suficiente medio de montaje para cubrir las secciones gruesas de 100 μm.</li>
	<li>Para asegurarse de que solo se coloque una cubierta en las secciones, separe las cubiertas antes del proceso.</li>
	<li>Una vez deslizada la cubierta, se desliza en seco sobre cualquier papel no poroso durante 3-5 días, moviéndolos ligeramente, especialmente después del primer día, para evitar que se peguen. Después de 3-5 días, transfiera los portaobjetos a soportes de diapositivas e, idealmente, en seco durante al menos 3 semanas antes de examinarlos. Mantenga los toboganes planos para disminuir la posibilidad de que se formen burbujas de aire.</li>
</ol>4. Determinación de la densidad de la columna dendrítica
<ol><li>Para el análisis de la densidad de la columna dendrítica en neuronas piramidales tanto del mPFC como de la región CA1 del hipocampo, examine las dendritas basales secundarias más laterales y las dendritas apicales terciarias más laterales como se describe en el paso 4.1.1 (Figura 2).<ol>
<li>Elija una dendrita, mida la longitud de la dendrita utilizando un programa de análisis de imágenes, cuente las espinas de las dendritas con un contador de manos y registre tanto la longitud como el número de espinas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Estudiar y analizar seis células por región (mPFC, CA1) por cerebro. Cuantificar un mínimo de seis cerebros por grupo como se describió anteriormente 7,8. Elija neuronas que cumplan con los siguientes criterios para el análisis: los cuerpos celulares y las dendritas están bien impregnados; las dendritas son distinguibles de las celdas adyacentes y son continuas.</li>
	<li>Cuente las espinas a 1000x (inmersión en aceite) contando a mano con un microscopio de luz y mida la longitud dendrítica utilizando un programa de análisis de imágenes. Calcule la densidad de la columna vertebral dividiendo el número de la columna vertebral por la longitud de la dendrita y exprese los datos como el número de espinas / 10 μm de dendrita. NOTA: Hay métodos mucho más sofisticados para diferenciar los subtipos de columna vertebral y la arquitectura dendrítica que se pueden usar, pero contar a mano con un microscopio de luz a 1000x puede dar un resultado rápido que luego puede determinar si es necesaria una mayor investigación. Aunque se hace todo lo posible para muestrear consistentemente dendritas similares, hay variaciones en el grosor que pueden afectar el conteo.</li>
</ol>

<ol><li>Pannese, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Golgi+Stain%3A+invention%2C+diffusion+and+impact+on+neurosciences%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+History+of+the+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">The Golgi Stain: invention, diffusion and impact on neurosciences.</a> Journal of the History of the Neurosciences. 8 (2), 132-140 (1999).</li>
<li>Bentivoglio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Original+Histological+Slides+of+Camillo+Golgi+and+His+Discoveries+on+Neuronal+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">The Original Histological Slides of Camillo Golgi and His Discoveries on Neuronal Structure.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 13, 3(2019).</li>
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<li>Gabbott, P. L., Somogyi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%27single%27+section+Golgi-impregnation+procedure%3A+methodological+description%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">The 'single' section Golgi-impregnation procedure: methodological description.</a> Journal of Neuroscience Methods. 11 (4), 221-230 (1984).</li>
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<li>Gould, E., Woolley, C. S., Frankfurt, M., McEwen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadal+steroids+regulate+dendritic+spine+density+in+hippocampal+pyramidal+cells+in+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Gonadal steroids regulate dendritic spine density in hippocampal pyramidal cells in adulthood.</a> Journal of Neuroscience. 10 (4), 1286-1291 (1990).</li>
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<li>Wallace, M., Luine, V., Arellanos, A., Frankfurt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovariectomized+rats+show+decreased+recognition+memory+and+spine+density+in+the+hippocampus+and+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Ovariectomized rats show decreased recognition memory and spine density in the hippocampus and prefrontal cortex.</a> Brain Research. 1126 (1), 176-182 (2006).</li>
<li>Wallace, M., Frankfurt, M., Arellanos, A., Inagaki, T., Luine, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+recognition+memory+and+decreased+prefrontal+cortex+spine+density+in+aged+female+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Science%22%5BJournal%5D)">Impaired recognition memory and decreased prefrontal cortex spine density in aged female rats.</a> Annals of the New York Academy of Science. 1097, 54-57 (2007).</li>
<li>Bowman, R. E., Hagedorn, J., Madden, E., Frankfurt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+adolescent+Bisphenol-A+exposure+on+memory+and+spine+density+in+ovariectomized+female+rats%3A+Adolescence+vs+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22Hormones+Behavior%22%5BJournal%5D)">Effects of adolescent Bisphenol-A exposure on memory and spine density in ovariectomized female rats: Adolescence vs adulthood.</a> Hormones Behavior. 107, 26-34 (2019).</li>
<li>Novaes, L. S., Dos Santos, N. B., Perfetto, J. G., Goosens, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+enrichment+prevents+acute+restraint+stress-induced+anxiety-related+behavior+but+not+changes+in+basolateral+amygdala+spine+density%5BTitle%5D)+AND+%22Psychoneuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Environmental enrichment prevents acute restraint stress-induced anxiety-related behavior but not changes in basolateral amygdala spine density.</a> Psychoneuroendocrinology. 98, 6-10 (2018).</li>
<li>Trzesniewski, J., Altmann, S., Jäger, L., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+Purkinje+cell+size+is+compatible+with+near+normal+morphology+and+function+of+the+cerebellar+cortex+in+a+mouse+model+of+spinocerebellar+ataxia%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Reduced Purkinje cell size is compatible with near normal morphology and function of the cerebellar cortex in a mouse model of spinocerebellar ataxia.</a> Experimental Neurology. 311, 205-212 (2019).</li>
<li>Zemmar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocyte-+and+Neuron-Specific+Nogo-A+Restrict+Dendritic+Branching+and+Spine+Density+in+the+Adult+Mouse+Motor+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocyte- and Neuron-Specific Nogo-A Restrict Dendritic Branching and Spine Density in the Adult Mouse Motor Cortex.</a> Cerebral Cortex. 28 (6), 2109-2117 (2018).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El presente protocolo describe un método de impregnación de Golgi que permite el procesamiento simultáneo rápido de muchas secciones. Es una mejora con respecto alos 5 métodos más intensivos en mano de obra descritos anteriormente y produce constantemente neuronas impregnadas para su análisis. Además, hay menos exposición a productos químicos tóxicos utilizados en la impregnación de Golgi. La parte más desafiante del proceso es lograr que las secciones sean planas en las diapositivas, lo que requi...

El método de uso de dicromato de potasio y nitrato de plata para etiquetar las neuronas fue descrito por primera vez por Camillo Golgi 1,2 y posteriormente utilizado por Santiago Ramón y Cajal para producir un inmenso cuerpo de trabajo diferenciando subtipos neuronales y gliales. Un libro recientemente publicado con sus ilustraciones ya está disponible3. Siguiendo los estudios de Ramón y Cajal, que se publicaron hace más de 100 años, se utilizó muy poca impregnación de Golgi. La impregnación de Golgi es un proceso laborioso que permite la visualización tridimensional de las neuronas con un microscopio de luz. Ha habido numerosas modificaciones del método golgi a lo largo de los años para facilitar el método y la tinción más consistente4. En 1984, Gabbott y Somogyi5 describieron el procedimiento de impregnación de Golgi de sección única que permitió un procesamiento más rápido. Este método de impregnación de Golgi requiere perfusión con 4% de paraformaldehído y 1,5% de ácido pícrico, después de la fijación seguida de seccionamiento de vibratomo en un baño de dicromato de potasio al 3%. Las secciones se montan en toboganes de vidrio, las cuatro esquinas de los cubrehojas se pegan para que cuando se sumergen en nitrato de plata, la difusión sea gradual. Los cubrehojas se desprenden, las secciones se deshidratan y, finalmente, la cubierta se desliza permanentemente con el medio de montaje. Esta técnica se utilizó con éxito para etiquetar neuronas y glía 6,7,8 en el hipocampo. El método rápido de Golgi descrito aquí es una mejora porque hay mucha menos exposición tanto al dicromato de potasio como al nitrato de plata y no se utilizan paraformaldehído ni ácido pícrico. Además, aunque las células que se impregnaron utilizando modificaciones del método Gabbott y Somogyi5 pudieron analizarse, a menudo las secciones estaban sobreexpuestas o subexpuestas o se caían de los toboganes durante la etapa de deshidratación y, en general, se tuvieron que agrupar varios experimentos para tener suficientes células para el análisis.
El presente protocolo describe el uso del kit de tinción de Golgi (ver Tabla de materiales) para etiquetar dendritas y espinas dendríticas en el hipocampo y la corteza prefrontal medial (mPFC) de la rata. Las ventajas de este método sobre los anteriores son que es rápido, hay menos exposición a sustancias químicas nocivas para el investigador y hay una tinción constante de neuronas. El protocolo descrito a continuación se ha utilizado con modificaciones menores para evaluar la densidad de la columna dendrítica en el hipocampo y mPFC de la rata en muchos estudios 9,10,11,12,13,14,15.

<table><tbody><tr><td>Bandejas de portaobjetos de cartón</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-587-10</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos 24 x 60 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-M</td><td></td></tr><tr><td>FD Rapid GolgiStain kit</td><td>FD Neurotechnologies</td><td>PK 401</td><td>Estable en RT en la oscuridad durante meses; Kit de tinción Golgi</td></tr><tr><td>Spray congelante</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-022524</td><td></td></tr><tr><td>HISTO-CLEAR</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-899-90147</td><td>agente de limpieza</td></tr><tr><td>NCSS Software</td><td>Kaysville, UT, EE. UU.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP-15-100 medio de</td><td>montaje</td></tr><tr><td>Superfrost Plus Portaobjetos de microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Tek CTYO OCT Compound</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-373-65</td><td>Se utiliza para montar cerebros en un mandril de criostato</td></tr></tbody></table>

tinción rápida de golgi para la visualización de la columna dendrítica en el hipocampo y la corteza prefrontal

Rapid Golgi Stain for Dendritic Spine Visualization in Hippocampus and Prefrontal Cortex

La impregnación de Golgi, utilizando el kit de tinción de Golgi con adaptaciones menores, se utiliza para impregnar espinas dendríticas en el hipocampo de la rata y la corteza prefrontal medial. Esta técnica es una mejora notable con respecto a los métodos anteriores de impregnación de Golgi porque los productos químicos premezclados son más seguros de usar, las neuronas están consistentemente bien impregnadas, hay muchos menos desechos de fondo y, para una región determinada, hay desviaciones extremadamente pequeñas en la densidad de la columna vertebral entre los experimentos. Además, los cerebros se pueden acumular después de un cierto punto y mantenerse congelados hasta su posterior procesamiento. Usando este método se puede estudiar cualquier región del cerebro de interés. Una vez teñida y cubierta deslizada, la densidad de la columna dendrítica se determina contando el número de espinas para una longitud de dendrita y se expresa como densidad de la columna vertebral por dendrita de 10 μm.

Usando el método rápido de Golgi, las células están consistentemente bien impregnadas para que haya muchas células para analizar. Esta es una mejora notable con respecto a los métodos anteriores en los que los experimentos tenían que agruparse para tener suficientes datos para el análisis. Por lo tanto, se pueden procesar más muestras a la vez y los cerebros se pueden almacenar congelados hasta su procesamiento. Ejemplos de células impregnadas de Golgi en la región CA1 del hipocampo se muestran a baja y alta potencia en ...

El protocolo describe una modificación del método rápido de Golgi, que se puede adaptar a cualquier parte del sistema nervioso, para teñir las neuronas en el hipocampo y la corteza prefrontal medial de la rata.

Tinción rápida de Golgi para la visualización de la columna dendrítica en el hipocampo y la corteza prefrontal

Golgi impregnation, using the Golgi staining kit with minor adaptations, is used to impregnate dendritic spines in the rat hippocampus and medial ...

Aunque es relativamente simple, la técnica de impregnación de Golgi tiene algunos pasos complicados y el hecho de no hacerlos correctamente da como resultado células que no son aptas para el análisis. Esta técnica proporciona un etiquetado rápido y reproducible de las neuronas impregnadas de Golgi. Y además, el pequeño error estándar de la media permite la comparación entre experimentos.La parte más desafiante de esta técnica es cortar las secciones de criostato, porque hay una consistencia y fijación inusuales, y por lo tanto, ponerlas en el tobogán plano es un poco un desafío requiere práctica. Primero, coloque una pequeña cantidad de tejido mediano en un mandril de criostato preenfriado. Monte los bloques cerebrales en los mandriles de criostato descongelando un lado del bloque ligeramente en una mano enguantada y colocándolo en el medio de tejido.Use un aerosol de congelación en el cuchillo y el bloque. Use la placa antivuelco o el cepillo para mantener la sección plana mientras corta. Corte secciones de 100 micrómetros en un criostato a menos 22 grados centígrados.Descongele el soporte, si es posible, mediante el uso de un tobogán a temperatura ambiente y oponga rápidamente a la sección. Alternativamente, mantenga las diapositivas en el criostato, para que se congelen. Transfiera la sección con pinzas frías o un pincel frío y luego descongele el soporte.Montar tres o cuatro secciones coronales en subsidios. Limpie el cuchillo con toallitas de papel entre rodajas. Si el cuchillo requiere una limpieza adicional, use etanol 100% y séquelo antes de cortar la siguiente rebanada.Coloque las correderas en bastidores, espaciadas lo suficiente como para permitir el acceso de la solución a las secciones. Coloque las secciones en agua destilada dos veces durante cuatro minutos antes de colocarlas en la solución de impregnación de Golgi durante 10 minutos. Separe los resbalones de la cubierta para asegurarse de que solo se coloque un resbalón de la cubierta en las secciones.Cubra los portaobjetos de vidrio con una cantidad generosa de medio de montaje antes de colocar un resbalón de cubierta de vidrio en el portaobjetos. Una vez que la cubierta se desliza, los toboganes secos se marcan en cualquier papel no poroso durante tres a cinco días, moviéndolos ligeramente, especialmente después del primer día para evitar que se peguen. Más tarde, transfiera las diapositivas a los soportes de diapositivas e idealmente, seque las diapositivas durante al menos tres semanas antes de examinarlas.Para analizar la densidad de la columna dendrítica en neuronas piramidales tanto de la corteza prefrontal medial como de la región CA1 del hipocampo, mida la longitud dendrítica utilizando en el programa de análisis de imágenes. Cuente las espinas en las dendritas usando un contador de manos y registre tanto la longitud como el número de espinas. Para el análisis, elija neuronas con cuerpos celulares y dendritas mientras están impregnadas, y dendritas que sean continuas y distinguibles de las células adyacentes.La figura muestra ejemplos de células impregnadas de Golgi en la región CA1 del hipocampo que se muestra a baja y alta potencia. La figura ilustra un experimento en el que la densidad de la columna vertebral dendrítica basal se incrementó en células piramidales en ratas macho y hembra adolescentes después del enriquecimiento ambiental en CA1 y la corteza prefrontal medial. Es un desafío mantener las secciones lo suficientemente frías al cortar y usamos una gran cantidad de aerosol de congelación para hacerlo.Y luego, posteriormente, es difícil colocar las secciones en los toboganes y hacer que se sequen planas. Esta técnica se utiliza para examinar las características neuroanatómicas. Se puede utilizar solo o en combinación con otros métodos de rastreo neuroanatómico.

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Neurociencia

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Fuente: McLeod, F., et al. Evaluación de la densidad de sinapsis en cortes de cerebro de roedores hipocampales. J. Vis. Exp. (2017). Este video muestra un método para visualizar marcadores sinápticos en cortes de cerebro del hipocampo utilizando el análisis de inmunofluorescencia confocal. Los cortes se inmunotiñen con anticuerpos primarios dirigidos a marcadores presinápticos y postsinápticos, seguidos de anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos. A continuación, los marcadores...

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La localización y distribución de proteínas proporcionan información importante para entender sus funciones celulares. La resolución espacial superior de la microscopía electrónica (EM) se puede utilizar para determinar la localización subcelular de un antígeno dado después de inmunohistoquímica. Para los tejidos del sistema nervioso central (SNC), la preservación de la integridad estructural, mientras que el mantenimiento de la antigenicidad ha sido especialmente difícil en los estudios de EM.

Post-Etiquetado Inmunoelectrónica incorporación de proteínas sinápticas en cultivos de cortes de hipocampo

En este trabajo se describen los procedimientos para la estimulación táctil de crías de rata y la posterior tinción de Golgi-Cox de la morfología neuronal. Estímulo táctil es una experiencia positiva que se administra en el periodo perinatal por acariciar cachorros con un plumero hogar. Tinción de Golgi-Cox es un procedimiento confiable que permite la visualización de las neuronas enteras.

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En este artículo se describe un protocolo de trabajo para obtener imágenes de las espinas dendríticas de las neuronas del hipocampo in vitro utilizando Estructurado Iluminación Microscopía (SIM). Super-resolución de la microscopía utilizando SIM ofrece una resolución de imagen de manera significativa más allá del límite de difracción de la luz en las tres dimensiones espaciales, lo que permite la obtención de imágenes de las espinas dendríticas individuales con detalles mejorados.

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Tinción rápida de Golgi para la visualización de la columna dendrítica en el hipocampo y la corteza prefrontal

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