Tinción rápida de Golgi para la visualización de la columna dendrítica en el hipocampo y la corteza prefrontal

El protocolo describe una modificación del método rápido de Golgi, que se puede adaptar a cualquier parte del sistema nervioso, para teñir las neuronas en el hipocampo y la corteza prefrontal medial de la rata.

Aunque es relativamente simple, la técnica de impregnación de Golgi tiene algunos pasos complicados y el hecho de no hacerlos correctamente da como resultado células que no son aptas para el análisis. Esta técnica proporciona un etiquetado rápido y reproducible de las neuronas impregnadas de Golgi. Y además, el pequeño error estándar de la media permite la comparación entre experimentos.

La parte más desafiante de esta técnica es cortar las secciones de criostato, porque hay una consistencia y fijación inusuales, y por lo tanto, ponerlas en el tobogán plano es un poco un desafío requiere práctica. Primero, coloque una pequeña cantidad de tejido mediano en un mandril de criostato preenfriado. Monte los bloques cerebrales en los mandriles de criostato descongelando un lado del bloque ligeramente en una mano enguantada y colocándolo en el medio de tejido.

Use un aerosol de congelación en el cuchillo y el bloque. Use la placa antivuelco o el cepillo para mantener la sección plana mientras corta. Corte secciones de 100 micrómetros en un criostato a menos 22 grados centígrados.

Descongele el soporte, si es posible, mediante el uso de un tobogán a temperatura ambiente y oponga rápidamente a la sección. Alternativamente, mantenga las diapositivas en el criostato, para que se congelen. Transfiera la sección con pinzas frías o un pincel frío y luego descongele el soporte.

Montar tres o cuatro secciones coronales en subsidios. Limpie el cuchillo con toallitas de papel entre rodajas. Si el cuchillo requiere una limpieza adicional, use etanol 100% y séquelo antes de cortar la siguiente rebanada.

Coloque las correderas en bastidores, espaciadas lo suficiente como para permitir el acceso de la solución a las secciones. Coloque las secciones en agua destilada dos veces durante cuatro minutos antes de colocarlas en la solución de impregnación de Golgi durante 10 minutos. Separe los resbalones de la cubierta para asegurarse de que solo se coloque un resbalón de la cubierta en las secciones.

Cubra los portaobjetos de vidrio con una cantidad generosa de medio de montaje antes de colocar un resbalón de cubierta de vidrio en el portaobjetos. Una vez que la cubierta se desliza, los toboganes secos se marcan en cualquier papel no poroso durante tres a cinco días, moviéndolos ligeramente, especialmente después del primer día para evitar que se peguen. Más tarde, transfiera las diapositivas a los soportes de diapositivas e idealmente, seque las diapositivas durante al menos tres semanas antes de examinarlas.

Para analizar la densidad de la columna dendrítica en neuronas piramidales tanto de la corteza prefrontal medial como de la región CA1 del hipocampo, mida la longitud dendrítica utilizando en el programa de análisis de imágenes. Cuente las espinas en las dendritas usando un contador de manos y registre tanto la longitud como el número de espinas. Para el análisis, elija neuronas con cuerpos celulares y dendritas mientras están impregnadas, y dendritas que sean continuas y distinguibles de las células adyacentes.

La figura muestra ejemplos de células impregnadas de Golgi en la región CA1 del hipocampo que se muestra a baja y alta potencia. La figura ilustra un experimento en el que la densidad de la columna vertebral dendrítica basal se incrementó en células piramidales en ratas macho y hembra adolescentes después del enriquecimiento ambiental en CA1 y la corteza prefrontal medial. Es un desafío mantener las secciones lo suficientemente frías al cortar y usamos una gran cantidad de aerosol de congelación para hacerlo.

Y luego, posteriormente, es difícil colocar las secciones en los toboganes y hacer que se sequen planas. Esta técnica se utiliza para examinar las características neuroanatómicas. Se puede utilizar solo o en combinación con otros métodos de rastreo neuroanatómico.