Impulsada por la luz enzimática descarboxilación

El objetivo general de este experimento es impulsar reacciones enzimáticas utilizando luz visible. En este enfoque, la luz se utiliza para convertir los ácidos grasos en alquinos terminales en condiciones de reacción suaves. La descarboxilación requiere la ruptura de los enlaces CC.

Y este vínculo es muy estable, lo que hace que esta sea una reacción muy difícil. El uso de la luz es un enfoque sostenible para lograr una reacción tan difícil. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando intentamos añadir peróxido de hidrógeno directamente a la reacción, lo que condujo a la inactivación de las enzimas.

La principal ventaja de esta técnica es que suministra una cantidad constante de peróxido de hidrógeno. En primer lugar, utilizamos OleT purificado para la biocatálisis impulsada por la luz para caracterizar nuestra enzima. Más tarde también probamos el extracto crudo, que sería importante para el desarrollo de aplicaciones industriales.

Después de clonar el gen sintético OleT en el vector de expresión y transformar el plásmido en E. Coli como se describe en el protocolo de texto, inocule las células en dos tubos de ensayo que contengan tres mililitros de medio LB con 100 microgramos por mililitro de ampicilina. Incubar los precultivos en un agitador durante 15 horas. Diluir dos mililitros del cultivo en 200 mililitros de LB con ampicilina en dos matraces de un litro.

Incubar los matraces en un agitador a 37 grados centígrados y 180 RPM hasta que los cultivos alcancen una densidad óptica a 600 nanómetros entre 0,6 y 0,8. A continuación, agregue 0,5 milimolares de ácido delta aminolevulínico a los cultivos. Y luego inducir las células añadiendo tetraciclina a 0,2 microgramos por mililitro a los frascos.

Incubar los cultivos durante 15 horas a 20 grados centígrados y 180 RPM. Después de la inducción, decantar los cultivos en tubos de centrífuga y centrifugar los tubos a 12000 veces G y cuatro grados centígrados durante 20 minutos. Deseche el sobrenadante.

Vuelva a suspender los gránulos pipeteando en 50 mililitros de tampón Tris helado y transfiera la suspensión a un tubo de centrífuga cónico. Continúe centrifugando a 4000 veces G y cuatro grados centígrados durante 15 minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender cada pellet en tres mililitros de tampón mediante pipeteo repetido.

Lisar las células mediante sonicación con tres ciclos de 30 segundos, haciendo una pausa de un minuto entre ciclos. A continuación, centrifugar el lisado a 15000 veces G y cuatro grados Celsius durante 20 minutos, y luego pipetear cuidadosamente el extracto libre de células en tubos de centrífuga cónicos. Para la preparación del extracto crudo para la biocatálisis impulsada por luz, transfiera tres mililitros de extracto libre de una célula a un filtro centrífugo de 10 kilodalton y centrifugue a 4000 veces G a cuatro grados Celsius para eliminar las moléculas pequeñas.

Resuspende la proteína en tres mililitros de Tris. Para caracterizar la actividad de OleT en la biocatálisis impulsada por la luz, es necesario purificar la proteína. Para iniciar la purificación de proteínas, cargue tres mililitros del extracto libre de células en columnas de centrifugado NTA de níquel equilibradas.

Selle las columnas con tapones inferiores y tapones de rosca. Y agítalos ligeramente hasta que la resina se distribuya uniformemente. Continúe incubando las columnas en un agitador aéreo.

A continuación, centrifuga la columna. A continuación, lavar las columnas añadiendo un mililitro de tampón de lavado y centrifugarlas a 700 veces G durante dos minutos. Repite el lavado dos veces más.

Después del lavado, coloque las columnas en tubos de centrífuga cónicos y agregue un mililitro de tampón de elución a cada columna. Centrifugar los tubos a 700 veces G durante dos minutos y repetir la elución dos veces más. Agregue los extractos de columna combinados a un filtro centrífugo de 10 kilodalton y centrifugue a 4000 veces G y cuatro grados centígrados para separar el imidazol utilizado para la elución de la enzima.

Finalmente, determine la pureza y concentración de la proteína como se indica en el protocolo de texto. Para iniciar el procedimiento de biotransformación, primero agregue un 10% de un tensioactivo como el tergitol y 28,4 miligramos de ácido esteárico al agua destilada para hacer 10 mililitros de una solución madre de 10 milimolares. Calentar la solución en una cámara de calentamiento, a 60 grados centígrados hasta que el ácido esteárico se disuelva por completo.

Utilice esta solución para preparar una mezcla de reacción de acuerdo con el siguiente protocolo. Agregue FMN, EDTA, tampón y ácido esteárico a dos tubos de vidrio transparente y revuelva en un baño de agua a 25 grados centígrados. Continúe agregando 200 microgramos por mililitro de la enzima purificada o extracto crudo a los tubos.

E iluminarlos con una bombilla LED clara a una distancia de dos centímetros. A continuación, tome muestras de 200 microlitros en puntos de tiempo específicos en tubos precargados con 20 microlitros de ácido clorhídrico al 37% para detener las reacciones. A continuación, añada cinco microlitros de una solución de ácido mirístico de 10 milimolares a cada muestra como patrón interno.

Para analizar los productos de la reacción, agregue dos veces 500 microlitros de acetato de etilo a los tubos. Invierta los tubos para mezclarlos y centrifugue durante un minuto a 13, 000 veces G. A continuación, transfiera 400 microlitros de los sobrenadantes a los tubos de micro centrífuga y evapore completamente soplando suavemente los tubos con aire comprimido. Agregue 200 microlitros de MSTFA a los tubos.

E incubar la mezcla a 60 grados centígrados durante 30 minutos para derivatizar las muestras antes del análisis. Analice los productos de reacción inyectando una muestra de cuatro microlitros en un cromatógrafo de gases equipado con un detector de ionización de llama utilizando el perfil de temperatura descrito en el protocolo de texto. A continuación, determine la proporción de un heptadecano y el betahidroxiácido formado en cada muestra de reacción con un cromatógrafo de gases acoplado a un espectrómetro de masas.

Utilice la temperatura del horno y la configuración del espectrómetro de masas como se describe en el protocolo de texto. Inyecte un microlitro de cada muestra en el cromatógrafo de gases y registre el cromatograma. Por último, monitorice los cromatogramas GCMS de cada muestra y analícelos según el protocolo del fabricante.

Los pesos moleculares de los productos de las reacciones enzimáticas se determinaron mediante el uso de un cromatógrafo de gases acoplado a un espectrómetro de masas. En el caso de los ácidos grasos con cadenas de acilo más largas, la enzima OleT, cataliza preferentemente su descarboxilación a olefinas de diferentes longitudes. Las muestras de la reacción de biotransformación se analizaron mediante un cromatógrafo de gases equipado con un detector de ionización de llama.

Se demostró que la descarboxilación del ácido esteárico ocurre tres veces más rápido que la reacción de hidroxilación, con el 99% del ácido esteárico convertido en una mezcla 3.3:1 de un heptadecano con ácido 2-hidroxiesteárico. Una vez dominada, la biocatálisis impulsada por la luz se puede realizar en unas pocas horas si, por ejemplo, me desempeño correctamente. En la catálisis de luz, el desafío es vincular las reacciones útiles con la recolección de luz.

En nuestro caso, tenemos la luz dentro de la molécula FMN como fotosensibilizador y los unimos a nuestra enzima a través de una molécula de transferencia que es el peróxido de hidrógeno.