Impulsada por la luz enzimática descarboxilación

El objetivo general de este experimento es impulsar reacciones enzimáticas utilizando luz visible. En este enfoque, se utiliza luz para convertir ácidos grasos en alquinos terminales bajo condiciones de reacción suaves. La descarboxilación requiere la ruptura de enlaces CC.

Y este enlace es muy estable, lo que convierte a esta en una reacción muy difícil. El uso de luz es un enfoque sostenible para lograr una reacción tan difícil. Tuvimos la idea de este método cuando intentamos agregar peróxido de hidrógeno directamente a la reacción, lo que provocó la inactivación de las enzimas.

La principal ventaja de esta técnica es que suministra una cantidad constante de peróxido de hidrógeno. Primero utilizamos OleT purificada para la biocatálisis impulsada por luz con el fin de caracterizar nuestra enzima. Posteriormente, también probamos extracto crudo, lo cual sería importante para el desarrollo de aplicaciones industriales.

Después de clonar el gen sintético OleT en el vector de expresión y transformar el plásmido en E. coli según se describe en el protocolo escrito, inocular las células en dos tubos de ensayo que contienen tres mililitros de medio LB con 100 microgramos por mililitro de ampicilina. Incubar las pre-culturas en un agitador durante 15 horas. Diluir dos mililitros de la cultura en 200 mililitros de LB con ampicilina en dos matraces de un litro.

Incube los matraces en un agitador a 37 grados Celsius y 180 RPM hasta que los cultivos alcancen una densidad óptica a 600 nanómetros entre 0,6 y 0,8. A continuación, agregue 0,5 milimolar de ácido delta aminolevulínico a los cultivos. Luego induzca las células agregando tetraciclina a 0,2 microgramos por mililitro a los matraces.

Incube los cultivos durante 15 horas a 20 °C y 180 RPM. Después de la inducción, vierta los cultivos en tubos de centrífuga y centrifugue los tubos a 12000 ×g y 4 °C durante 20 minutos. Deseche el sobrenadante.

Re-suspender los pellet pipeteando 50 mililitros de tampón Tris frío con hielo y transferir la suspensión a un tubo cónico para centrífuga. Continuar centrifugando a 4000 ×g y 4 °C durante 15 minutos. Desechar el sobrenadante y re-suspender cada pellet en 3 mililitros de tampón mediante pipeteo repetido.

Lise las células mediante sonicación con tres ciclos de 30 segundos, haciendo una pausa de un minuto entre cada ciclo. A continuación, centrifugue el lisado a 15000 × g y cuatro grados Celsius durante 20 minutos, y luego pipetee cuidadosamente el extracto libre de células en tubos cónicos para centrifuga. Para la preparación del extracto crudo para la biocatálisis impulsada por luz, transfiera tres mililitros de un extracto libre de células a un filtro centrífugo de 10 kilodalton y centrifugue a 4000 × g a cuatro grados Celsius para eliminar las moléculas pequeñas.

ReSuspender la proteína en tres mililitros de Tris. Para caracterizar la actividad de OleT en la biocatálisis impulsada por luz, es necesario purificar la proteína. Para iniciar la purificación de la proteína, cargar tres mililitros del extracto libre de células en columnas giratorias de níquel NTA equilibradas.

Cierre las columnas con tapones inferiores y tapas roscadas. Agite suavemente hasta que la resina se distribuya uniformemente. A continuación, incube las columnas en un agitador rotatorio.

Luego, centrifugue la columna. A continuación, lave las columnas añadiendo un mililitro de tampón de lavado y centrifugándolas a 700 ×g durante dos minutos. Repita el lavado otras dos veces.

Después del lavado, coloque las columnas en tubos cónicos de centrífuga y añada un mililitro de tampón de elución a cada columna. Centrifugue los tubos a 700 ×g durante dos minutos y repita la elución otras dos veces. Añada los extractos combinados de las columnas a un filtro de centrífuga de 10 kilodalton y centrifugue a 4000 ×g y cuatro grados centígrados para separar la imidazol utilizada en la elución de la enzima.

Finalmente, determine la pureza y concentración de la proteína según se indica en el protocolo del texto. Para iniciar el procedimiento de bio transformación, agregue primero un 10 % de un agente tensoactivo como tergitol y 28,4 miligramos de ácido esteárico a agua destilada para preparar 10 mililitros de una solución stock de 10 milimolar. Caliente la solución en una cámara de calentamiento a 60 grados celsius hasta que el ácido esteárico se disuelva completamente.

Utilice esta solución para preparar una mezcla de reacción según el siguiente protocolo. Añada FMN, EDTA, tampón y ácido esteárico a dos tubos de vidrio transparentes y agite en un baño de agua a 25 grados Celsius. A continuación, añada 200 microgramos por mililitro de la enzima purificada o extracto crudo a los tubos.

Y márquelas con una bombilla LED clara a una distancia de dos centímetros. A continuación, tome muestras de 200 microlitros en puntos de tiempo específicos en tubos previamente llenados con 20 microlitros de ácido clorhídrico al 37% para detener las reacciones. Luego agregue cinco microlitros de una solución de ácido mirístico 10 milimolar a cada muestra como estándar interno.

Para analizar los productos de la reacción, agregue dos veces 500 microlitros de acetato de etilo a los tubos. Invierta los tubos para mezclarlos y centrifugue durante un minuto a 13.000 ×g. A continuación, transfiera 400 microlitros de los sobrenadantes a tubos microcentrífugos y evapore completamente soplando suavemente sobre los tubos con aire comprimido. Agregue 200 microlitros de MSTFA a los tubos.

Y incubar la mezcla a 60 grados Celsius durante 30 minutos para derivatizar las muestras antes del análisis. Analizar los productos de la reacción inyectando una muestra de cuatro microlitros en un cromatógrafo de gases equipado con un detector de ionización de llama, utilizando el perfil de temperatura descrito en el protocolo del texto. A continuación, determinar la relación de heptadecano y ácido beta hidroxilo formados en cada muestra de reacción mediante un cromatógrafo de gases acoplado a un espectrómetro de masas.

Utilice la temperatura del horno y los ajustes del espectrómetro de masas según se describe en el protocolo del texto. Inyecte un microlitro de cada muestra en el cromatógrafo de gases y registre el cromatograma. Finalmente, supervise los cromatogramas de GC-EM para cada muestra y analícelos de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Los pesos moleculares de los productos de las reacciones enzimáticas se determinaron utilizando un cromatógrafo de gases acoplado a un espectrómetro de masas. Para ácidos grasos con cadenas acilo más largas, la enzima OleT cataliza preferentemente su descarboxilación a olefinas de diferentes longitudes. Las muestras de la reacción de biotransformación se analizaron mediante un cromatógrafo de gases equipado con un detector de ionización de llama.

Se demostró que la descarboxilación del ácido esteárico ocurre tres veces más rápido que la reacción de hidroxilación, con el 99 % del ácido esteárico convertido en una mezcla de 3,3:1 de heptadecano a ácido 2-hidroxiesteárico. Una vez dominada, la biocatálisis impulsada por luz puede realizarse en pocas horas si se realiza adecuadamente. En la catálisis fotocatalítica, el desafío consiste en vincular reacciones útiles a la captación de luz.

En nuestro caso, tenemos la luz dentro de la molécula FMN como fotosensibilizador y las vinculamos a nuestra enzima mediante una molécula de transferencia que es el peróxido de hidrógeno.