Name: Puesta a punto del paralelo Columna de flujo segmentado y habilitación de detección de multiplexado (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Aprende a ajustar columnas de cromatografía de flujo segmentado paralelo para habilitar la detección multiplexada en muestras complejas. Este método HPLC permite el análisis rápido de mezclas como café y vino.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este trabajo fue apoyado por UWS y ThermoFisher Scientific. Uno de los autores (DK) acusa recibo de un Premio Australiano de Posgrado.

Nota: Este protocolo contiene instrucciones sobre cómo utilizar una columna de fibras discontinuas de poliéster en un sistema HPLC junto con múltiples detectores para la detección de multiplexado. El protocolo se ha escrito asumiendo que el lector tiene conocimientos básicos y experiencia en cromatografía y diversos métodos de detección de HPLC. Precaución: Por favor, consulte las hojas de datos de seguridad de materiales (MSDS) para todos los materiales y los reactivos antes de su uso (es decir, Pedidos de metanol). Asegúrese de que el uso de todas las prácticas apropiadas de seguridad al manejar disolventes y High Performance Liquid Chromatography (HPLC) eluyente. Asegurar el uso apropiado de los controles de ingeniería de HPLC, el equilibrio y el detector de la instrumentación analítica, y asegurar el uso de equipos de protección personal (gafas de seguridad, guantes, bata de laboratorio, pantalones largos y zapatos cerrados). 1. Configuración de HPLC Instrumento <ol><li> Preparar el instrumento HPLC con agua ultrapura (por ejemplo, el 100% de agua Milli-Q) para line A y 100% de metanol para la línea B como fase móvil y purgar las bombas según el requisito del fabricante. Si uno de los detectores usados ​​es MS, ya que es aquí, añadir ácido fórmico 0,1% a ambas fases móviles A y B. </li><li> Configurar el HPLC componentes instrumentales y detectores como se ilustra en la Figura 2. Esto requiere la colocación conveniente de detectores relativos a la columna para minimizar el volumen muerto entre el detector y la columna. La flexibilidad en la configuración del sistema HPLC es deseable. </li></ol> 2. Configuración de la radiación UV-Vis y MS Detectores <ol><li> Ajuste el detector de UV-Vis a la longitud de onda deseada depende de la muestra de interés (por ejemplo, 280 nm). </li><li> Ajuste el detector de MS en modo positivo para el conde de iones totales (TIC) análisis según el método de detección de Análisis completo. También ajustar los siguientes parámetros de MS en consecuencia: temperatura del vaporizador 500 ° C, temperatura del capilar 350 ° C, gas vaina fijado en una tasa de 60 unidades, el flujo de gas auxiliar40 y barrer el flujo de gas a 5 unidades, y el voltaje de pulverización 3,5 kV. Estos ajustes se pueden ajustar más adelante para conocer los requisitos específicos de usuarios que dependen de la muestra que se está analizando. </li></ol> 3. Preparación de 2,2-difenil-1-Radical picrilhidrazil (DPPH •) Reactivo de configuración de DPPH • Detector System <ol><li> Pesar 25 mg de DPPH • y disolver en 250 ml de metanol en un matraz aforado. </li><li> Añadir 250 ml de ácido fórmico al DPPH • reactivo. Tapar el matraz en papel de aluminio para evitar la exposición a la luz. </li><li> Sonicar el matraz que contiene el reactivo para DPPH • 10 min. </li><li> Purgar la bomba de DPPH • con el preparado DPPH • reactivo según el requisito del fabricante. </li><li> Configurar el sistema de DPPH • acuerdo con la Figura 2 conectando la línea de la bomba a la entrada de una pieza en T. </li><li> Adjunte una bobina de reacción de l 100 a the salida de la pieza en T y conectar el otro extremo de la bobina de reacción al detector. </li><li> Encajona en el serpentín de reacción en un calentador de columna y ajustar la temperatura del calentador de la columna a 60 ° C. </li><li> Ajuste el DPPH • UV-Vis detector a 520 nm. </li></ol> 4. Configuración de Columna PSF <ol><li> Conectar la entrada de la columna de la PSF al instrumento HPLC. </li><li> Conectar el puerto central al detector MS, utilizando una longitud de 15 cm de tubo de 0,13 mm ID. </li><li> Conectar un puerto periférico al detector de UV-Vis utilizando una longitud de 15 cm de tubo de 0,13 mm ID. </li><li> Conecte otro puerto de periféricos de la pieza en T del sistema de detección de DPPH • utilizando una longitud de 15 cm de tubo Identificación del 0,13 mm. </li><li> Bloquear el puerto de periféricos no utilizados usando un tapón de columna. </li><li> Llevar la velocidad de flujo de la bomba de HPLC a 1 ml min -1 a 100% de la línea B - 100% de metanol (ácido fórmico al 0,1%). </li><li> Equilibrar la columna con el pH móvil metanol 100%ase durante 20 min para una columna mm de longitud 4,6 mm de diámetro x 250. Esta vez se escala de acuerdo a las dimensiones de otras columnas el usuario puede emplear. </li></ol> 5. Ajuste la Columna PSF para la detección multiplexada <ol><li> Medir la masa de al menos dos recipientes de recogida vacíos (uno para el puerto conectado al detector de UV-Vis y uno para el detector de DPPH •) utilizando una balanza analítica. </li><li> Recoger la fase móvil desde el UV-Vis y los puertos de DPPH • en dos recipientes de recogida, pesadas previamente separadas (5.1). Anote el período de tiempo para la colección. Recoge al menos 500 mg de disolvente en cada buque. </li><li> Sopesar los recipientes de recogida y determinar la masa de la fase móvil. Teniendo en cuenta la densidad del metanol es 0,791 g ml -1, determinar el volumen de fase móvil recogido de cada puerto. </li><li> Por diferencia, es decir, conjunto de caudal de la bomba nominal menos la tasa de flujo a través del DPPH • y UV-Vis Detectopuertos de flujo r, determinan la velocidad de flujo al detector MS. Expresar cada proporción de flujo como un porcentaje del flujo total. Nota: Idealmente, los porcentajes de flujo son: para la MS es 18% de la velocidad de flujo total, a la UV-Vis 22%, a la DPPH • detector 60%. </li><li> Si no es así, ajustar los porcentajes de flujo cambiando la presión de nuevo en el detector UV-Vis. Por ejemplo, si el flujo a la UV-Vis es demasiado alta, disminuir la proporción mediante la adición de añadir una sección de 15 cm de tubo de 0,13 mm ID a la salida del detector de UV-Vis. A continuación, repita los pasos 5.1 a 5.5. </li></ol> 6. Condiciones de instalación Finales <ol><li> Ajuste el caudal de la bomba de DPPH • reactivo a la misma velocidad de flujo que sale del puerto de salida conectado al detector DPPH •. Nota: La columna PSF multiplexado con UV-Vis, DPPH • y MS ahora está listo para su análisis. </li></ol>

<ol><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+of+a+new+concept+chromatography+column%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">The design of a new concept chromatography column.</a> Analyst. 136 (24), 5127-5130 (2011).</li>
<li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+separation+performance+using+a+new+column+technology%3A+Parallel+segmented+outlet+flow%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr%2C+A%22%5BJournal%5D)">Enhanced separation performance using a new column technology: Parallel segmented outlet flow.</a> J. Chromatogr, A. 1232, 47-51 (2012).</li>
<li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+flow+management+in+preparative+chromatographic+separations%3A+A+preliminary+investigation+into+enhanced+separation+using+a+curtain+flow+inlet+fitting+and+segmented+flow+outlet%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Active flow management in preparative chromatographic separations: A preliminary investigation into enhanced separation using a curtain flow inlet fitting and segmented flow outlet.</a> 35 (3), 410-415 (2012).</li>
<li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradient+elution+chromatography+with+segmented+parallel+flow+column+technology%3A+A+study+on+4.6mm+analytical+scale+columns%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.%2C+A%22%5BJournal%5D)">Gradient elution chromatography with segmented parallel flow column technology: A study on 4.6mm analytical scale columns.</a> J. Chromatogr., A. 1270, 204-211 (2012).</li>
<li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+HPLC+separation+performance+using+parallel+segmented+flow+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Microchem.+J%22%5BJournal%5D)">Improving HPLC separation performance using parallel segmented flow chromatography.</a> Microchem. J. 111, 3-7 (2013).</li>
<li>Shalliker, R. A., Ritchie, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmented+flow+and+curtain+flow+chromatography%3A+Overcoming+the+wall+effect+and+heterogeneous+bed+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr%2C+A%22%5BJournal%5D)">Segmented flow and curtain flow chromatography: Overcoming the wall effect and heterogeneous bed structures.</a> J. Chromatogr, A. 1335, 122-135 (2014).</li>
<li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+active+flow+technology+HPLC+columns+as+a+platform+for+multiplexed+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Microchem.+J%22%5BJournal%5D)">Evaluating active flow technology HPLC columns as a platform for multiplexed detection.</a> Microchem. J. 110, 473-479 (2013).</li>
<li>Camenzuli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+segmented+outlet+flow+high+performance+liquid+chromatography+with+multiplexed+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Parallel segmented outlet flow high performance liquid chromatography with multiplexed detection.</a> Anal. Chim. Acta. 803, 154-159 (2013).</li>
<li>Shalliker, R. A., Camenzuli, M., Pereira, L., Ritchie, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+segmented+flow+chromatography+columns%3A+Conventional+analytical+scale+column+formats+presenting+as+a+%27virtual%27+narrow+bore+column%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.%2C+A%22%5BJournal%5D)">Parallel segmented flow chromatography columns: Conventional analytical scale column formats presenting as a 'virtual' narrow bore column.</a> J. Chromatogr., A. 1262, 64-69 (2012).</li>
<li>Soliven, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+performance+of+narrow-bore+HPLC+columns+using+active+flow+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Microchem.+J%22%5BJournal%5D)">Improving the performance of narrow-bore HPLC columns using active flow technology.</a> Microchem. J. 116, 230-234 (2014).</li>
<li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+segmented+flow+chromatography+columns+with+multiplexed+detection%3A+An+illustration+using+antioxidant+screening+of+natural+products%5BTitle%5D)+AND+%22Microchem.+J%22%5BJournal%5D)">Parallel segmented flow chromatography columns with multiplexed detection: An illustration using antioxidant screening of natural products.</a> Microchem. J. 110, 726-730 (2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este estudio consiste en la caracterización y perfiles de café usando HPLC con detección multiplexado empleando una columna paralela flujo segmentado (PSF). Multiplexado HPLC utilizando columnas de PSF permite la caracterización y la identificación de entidades químicas clave mediante la reducción de la complejidad de los datos de la muestra, mientras que la obtención de un mayor grado de información molécula específica dentro de una fracción del tiempo que tarda el uso de procesos convencionales multi-detección. La col...

Columnas Tecnología Flow Activo Tecnología de flujo activo (AFT) columnas de cromatografía fueron desarrollados recientemente para superar la ineficiencia en las separaciones asociados a la heterogeneidad del flujo 1-6 y también para permitir la detección de multiplexado. En esta comunicación detalle que en particular el proceso operativo del paralelo segmentado flujo (PSF) columna con detección de multiplexado. Las ventajas funcionales clave de la columna de la PSF son: (1) el flujo desde la región central radial del lecho de la columna está aislada de la región periférica o la pared del flujo, (2) el volumen de fase móvil que debe ser procesada por una detección fuente se reduce, y las fuentes (3) de detección puede ser multiplexada para expandir información de la muestra sin infundir retrasos de detección a través de cada proceso de detección, o posteriormente que requiere la división de una corriente de flujo post-columna 7,8. La característica clave en el diseño de la columna de fibras discontinuas de poliéster que permite que la unaVentaja de la detección multiplexada es la novela de salida montaje de empalme y frita. La figura 1 es una fotografía de la columna AFT en comparación con una columna convencional. Es importante entender que el proceso de división obtuvo utilizando columnas de flujo segmentado paralelo no es la misma que la división de corriente de flujo post-columna. En una corriente de flujo post-columna dividir toda la banda de muestra desde el borde de ataque a las extremidades de la cola es igualmente incluidos en la muestra (es decir, axialmente), de ese modo, cada corriente de flujo es igual con respecto a la eficiencia y sensibilidad; la magnitud de la sensibilidad de este modo se divide por las divisiones de números. En PSF, sin embargo, las muestras de proceso de división de la banda radialmente, no axialmente. Como tal, las muestras de puertos centrales del vértice del pico - la región más concentrada del pico. Por lo tanto, la sensibilidad es más alta aquí como el pico no se diluye por la región difusa tizón. La muestra se eluye de los puertos periféricos no es tan eficiente como en el Centrazona l, pero, ya que la banda se muestrea radialmente, en lugar de axialmente, la anchura del pico es más estrecha que sería el caso para un proceso de muestreo que divide el pico en la dirección axial, es decir, una fracción de post-columna. Por lo tanto la sensibilidad de un detector dependiente de la concentración no se reduce. En la columna de la PSF, el racor de salida comprende múltiples puertos de salida y en el interior de esta final apropiado se aloja una frita anular. La porción interior de este anulares canales de frita fluya hacia fuera de la columna a través del puerto de salida radial central, mientras que la porción radial exterior de los canales de frita de salida fluya hacia fuera de la columna a través de los puertos de flujo de salida periféricas o región de la pared. Las porciones interior y exterior de la frita de salida están separados por una barrera impermeable que impide el flujo transversal entre estas regiones de flujo 2. Como consecuencia de este diseño, la corriente de flujo radial central a través del lecho de la columna se separa de los ins de flujo región de paredide la columna. La porción relativa de flujo de estas dos regiones puede ser variada para casi cualquier relación deseada mediante la gestión de la presión con el fin de optimizar varios aspectos funcionales de la tecnología de la columna, como la eficiencia de separación o sensibilidad de detección. En esencia, este diseño establece con eficacia dentro de la columna de la mayor formato de una columna &quot;virtual&quot;, que tiene un diámetro interno más estrecho, y por lo tanto las funciones de columna como una columna verdadera pared de menos, la superación de la columna heterogeneidad de cama y los efectos de pared 9,10. Los principales beneficios de columnas PSF son mejoras en la eficiencia de la columna, la minimización del procesamiento disolvente para la fuente (s) de detección y que permite la detección multiplexada. Sin embargo, una ventaja añadida es que desde el tizón y regiones al frente de cualquier banda se eliminan de la elución global perfil del soluto en la elución o detección está presente en una concentración mayor que de lo contrario se observa para los mismos solute inyección y la carga de la concentración en una columna convencional, dependiendo de la relación de segmentación empleada. Como consecuencia de ello, se observa a menudo una ganancia en la intensidad de la señal para separaciones realizadas en columnas PSF 2. De hecho, si la relación de segmentación se ajusta de tal manera que 25% de las salidas de flujo de cada uno de los cuatro puertos de salida, la intensidad de la señal que se observa usando violeta (UV) de detección Ultra muestra prácticamente la misma intensidad de la señal exacta como aparente utilizando una convencional columna donde se analiza la totalidad (100%) de la fase móvil 7. Por otra parte, el ajuste fino de la relación entre la toma de las regiones del centro y de la pared de flujo permite que la eficiencia de la columna que se ha optimizado. Las ganancias en eficiencia de la columna observaron utilizando columnas AFT no se puede afirmar a un solo valor, ya que estos aumentos de la eficiencia son una función de tres factores: (1) la velocidad de flujo, (2) la relación de segmentación, y (3) el factor de retención de soluto . Sin embargo, las ganancias en eficiencia en comparación con convcolumnas entional casi siempre se observaron, y, a veces estas ganancias son más de 100% en el número de platos teóricos 1,2. La capacidad de ajustar la relación de segmentación permite que el analista para adaptar efectivamente el diámetro de la columna &quot;virtual&quot;, y esto es un factor importante en relación con el proceso de detección. Por ejemplo, un 2,1 mm de diámetro (id) la columna virtual interna se establece a partir de una columna ID física 4,6 mm cuando la relación de segmentación es 21% de la fase móvil, eluyendo desde el puerto de salida radial central. En estas condiciones, la columna ID de 2,1 mm virtual realiza con una eficiencia que puede ser más de 70% mayor que la columna ID de 2,1 mm convencional, dependiendo de la tasa de flujo, y el factor de retención de soluto 10. El diseño de la columna PSF actual que se utiliza para la detección multiplexada incorpora un 4-puerto de salida apropiado, pero la columna se puede equipar con un 2-puerto de herraje final también, sin embargo, esto limita la detección to sólo dos detectores. El funcionamiento básico de estas columnas es, sin embargo, la misma, excepto que los cuatro detectores se pueden acoplar simultáneamente a la columna de fibras discontinuas de poliéster de 4 orificio de salida de ampliar el alcance para la detección multiplexada. Aparte de tubo conectivo columna antes y después, los únicos requisitos adicionales para operar una columna de fibras discontinuas de poliéster se tubería que se puede conectar a los puertos de salida periféricos, y un medio por el cual la cantidad de fase móvil pasa a través de cada tubo se puede medir, típicamente una medición de la masa o una medición volumétrica. Para facilitar la afinación, el diámetro interno de todos los tubos de flujo de salida debe ser el mismo. La relación de flujo entre los puertos de salida centrales periféricas y radiales se varía entonces a través de la utilización de gestión de la presión, simplemente cambiando la longitud de la tubería se encuentra en la salida periférica ajustada, o la longitud del detector de post tubo en el puerto radial salida central. Detección multiplexado utilizando columnas PSF </strong&gt; Una ventaja importante de columnas PSF es que cada uno de los puertos de salida de salida se puede conectar directamente a una fuente de detección, permitiendo así la detección multiplexada. En un sistema de detección bien diseñado un solo análisis con detección multiplexada puede proporcionar información sustancial en lo que respecta a la naturaleza de los componentes dentro de la muestra. Es importante destacar que, ensayos destructivos y no destructivos pueden llevarse a cabo exactamente en el mismo momento, sin retardo de detección. Esto permite la asignación absoluta de, por ejemplo, anti-oxidantes utilizando DPPH • reactivo, con componentes observaron para eluir con UV y / o espectrometría de masas (MS) las respuestas de detección de 7,11. Por lo tanto, cuatro detectores independientes pueden ser operados simultáneamente con porciones apropiadas de flujo dirigido a cada detector a través de cualquiera de los cuatro puertos de salida. Puesto que el flujo a través de estos puertos se puede ajustar fácilmente la cantidad de soluto de alcanzar cualquiera de los detectores se pueden ajustar para adaptarsela sensibilidad del detector de fuente dada. Cabe señalar, sin embargo, que la migración de soluto más eficiente se observa a través del puerto de salida radial central. Cada uno de los puertos periféricos ofrecen eficiencia de separación equivalente, que cuando se establece en 25% a través de cada puerto, es sólo ligeramente menos eficiente que una columna convencional. Como tal, es importante que el detector cuantitativo configurarse para analizar la muestra desde el puerto de salida radial central. Cuando la creación de una columna de fibras discontinuas de poliéster con el propósito de detección de multiplexado hay un número de consideraciones que deben hacerse para lograr resultados eficientes y de alta calidad; es decir dimensiones de los tubos para cada puerto, la elección de qué puerto para un tipo de detector y el ajuste de flujo. Tubo Dimensiones para cada puerto En la cromatografía de la longitud del tubo de la columna posterior juega un papel crucial en la eficiencia y el rendimiento de la separación. Gran dead-volumen como resultado de un largo o ancho tubo de salida de la columna ID de detector se traducirá en una pérdida de eficiencia, resolución y sensibilidad. Por lo tanto, las dimensiones de tubos apropiados deben ser utilizados al configurar la columna de la PSF para alcanzar el máximo potencial en el suministro de separación eficiente al tiempo que proporciona los beneficios de multiplexación. Puerto de detector La figura 2 es una ilustración de una configuración de ejemplo de detección de multiplexado (Violet-Visible Ultra (U-Vis), espectrómetro de masas (MS) y 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH •) de detección). La ilustración muestra el puerto central está unido al detector MS, mientras que el DPPH • y detectores de UV-Vis se adjuntan a los puertos periféricos. Puesto que la MS es el detector más sensible de los tres, fluir a este detector fue dirigido desde el orificio de salida central. Como DPPH • Detección es selectivo a la presence de antioxidantes, y la menos sensible y más tolerante al ensanchamiento de las bandas, el flujo a este detector fue dirigido desde un puerto periférico. El UV-Vis era un detector secundario &quot;genérico&quot;, por lo que fluya a este detector fue dirigido desde un segundo puerto de periféricos. Ajuste de Flujo Una vez que el tubo apropiado se ha unido desde un puerto de detector, el flujo que sale de cada uno de los detectores se puede ajustar a la cantidad requerida. Una forma sencilla de medir la cantidad de la salida de cada detector de flujo es pesar la cantidad de fase móvil que eluye a través de cada puerto durante un período determinado de tiempo. El flujo de porcentaje de este modo se puede determinar, y las relaciones de flujo se puede ajustar por cualquiera acortando o alargando el tubo conectado a la línea de toma de corriente de los detectores en consecuencia para adaptarse a los requisitos de los detectores de elección. Diferentes detectores tienen diferentes requisitos de flujo, por ejemplo, la celda de flujo deun detector de fluorescencia (FLD) no es la tasa de flujo limitada, pero se debe tener cuidado para evitar la sobre-presurización de la celda de flujo. Por lo tanto el control de flujo a través del FLD generalmente se logra mediante el ajuste de la caída de presión a través de los otros detectores y el resto del flujo entonces pasa a través de la FLD. Un detector que es sensible a la cantidad de flujo que se entrega es la MS. Generalmente, espectrómetros de masas actuales de gama alta pueden procesar fácilmente alrededor de 1 a 1,5 ml / min de fase móvil acuosa moderadamente. Por encima de esta velocidad de flujo, inundación de la fuente puede hacer que los MS inoperable. Sin embargo, la sensibilidad de detección en la mayoría de los espectrómetros de masas se benefició con caudales inferiores; por lo tanto, la capacidad de división de flujo PSF son extremadamente útiles para aplicaciones que implican la detección MS. Caudales volumétricos de alta de la columna se pueden utilizar, pero con cargas de bajo volumen transportado al detector MS. Afinación del flujo al detector MS, sin embargo, se debe hacer mediante el ajuste de la caída de presión antes de laDetector de MS, en lugar de colocar la EM. Aquí, el uso de mangueras de diámetro interior estrecho (0,1 mm id) es muy útil, ya que la presión se puede ajustar fácilmente sin añadir volumen muerto apropiado. Dependiendo del tipo de detector el ajuste de la relación de segmentación puede hacerse detector ya sea pre o post. Si un detector no destructivo, como se usa UV-Vis, el porcentaje de flujo sería medido y ajustado detector de correos. Si un solo detector destructiva se utiliza en el multiplex establecer el porcentaje de flujo se determina por el cálculo de la espalda con respecto a otros porcentajes de flujo de puerto. Si un detector basado reactivo se utiliza como DPPH •, el porcentaje de flujo se mide detector puesto de trabajo sin la adición de reactivo; y si se utilizan dos o más destructivas detectores, entonces la relación de flujo se mide pre-detector. Sistemas que pueden requerir instrumentación adicional, tales DPPH • Detección, tendrá la presión del sistema adicional que puede alterar el flujoporcentaje una vez conectado al sistema de detección. Por lo tanto, la consideración cuidadosa se debe prestar a la presión del sistema de un detector destructiva, al ajustar el porcentaje de flujo pre-detector. Independientemente de la relación de flujo que se establece a través de cualquiera de los puertos, la información cuantitativa se debe obtener mediante la normalización adecuada. Una vez que las relaciones de flujo se establecen, sin embargo, son robustos, y no cambian incluso bajo condiciones de elución de gradiente de 7, El protocolo de vídeo detallado que acompaña este manuscrito tiene la intención de mostrar cómo usar y ajustar un funcionamiento columna de fibras discontinuas de poliéster en un modo multiplexado de detección.

<table><tbody><tr><td>Instrumento</td><td></td><td></td> de HPLC <td>Múltiples detectores de elección para la detección multiplexada. Los detectores elegidos pueden requerir instrumentación adicional, p. ej., , bomba.</td></tr><tr><td>Columna de HPLC de flujo segmentado paralelo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>No definido</td><td>Pronto se comercializará</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Cualquier marca</td><td></td> Tubo de PEEK <td>de grado HPLC</td></tr><tr><td></td><td>Cualquier marca</td><td></td><td>Varias longitudes y diámetro interior.</td></tr><tr><td>Topes de columna</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td>Para bloquear puertos periféricos no utilizados.</td></tr><tr><td>Cortador de tubos de PEEK</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balanza de báscula analítica</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cronómetro</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Recipientes de recolección de eluyentes</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td>Los viales de muestra de 1-2 ml se pueden utilizar como recipientes de recolección de eluyentes</td></tr></tbody></table>

puesta a punto del paralelo columna de flujo segmentado y habilitación de detección de multiplexado

Tuning a Parallel Segmented Flow Column and Enabling Multiplexed Detection

Tecnología de flujo activo (AFT) es una nueva forma de tecnología de columna que fue diseñada para superar la heterogeneidad del flujo para aumentar el rendimiento de la separación en términos de eficiencia y sensibilidad, y para permitir la detección multiplexada. Esta forma de AFT utiliza una columna de flujo segmentado paralelo (PSF). Un accesorio de extremo de salida de columna PSF consta de 2 o 4 puertos, que se pueden multiplexar para conectar hasta 4 detectores. La columna PSF no solo permite una plataforma para la detección multiplexada, sino también la combinación de detectores destructivos y no destructivos, sin tubos de volumen muerto adicionales, simultáneamente. La cantidad de flujo a través de cada puerto también se puede ajustar a través de la gestión de la presión para adaptarse a los requisitos de un detector o detectores específicos. Para lograr la detección multiplexada utilizando una columna PSF, hay una serie de parámetros que se pueden controlar para garantizar un rendimiento de separación óptimo y la calidad de los resultados; es decir, las dimensiones del tubo para cada puerto, la elección del puerto para cada tipo de detector y el ajuste del flujo. Este protocolo está destinado a mostrar cómo usar y ajustar una columna PSF que funciona en un modo de detección multiplexado.

Un análisis de HPLC multiplexada se llevó a cabo utilizando una columna de AFT en el modo de PSF (Figura 1) y configurar como se ilustra en la Figura 2. Este tipo de configuración permite una muestra de café que va a analizarse simultáneamente usando UV-Vis, DPPH • y MS en total Contador de Ion modo (TIC). Los compuestos de la muestra de café que respondió a DPPH • podrían entonces ser fácilmente emparejados a los UV-Vis y MS - respuestas TIC basad...

Aquí, presentamos un protocolo para el funcionamiento y ajuste de columnas de cromatografía de flujo segmentadas paralelas para permitir la detección multiplexada.

Puesta a punto del paralelo Columna de flujo segmentado y habilitación de detección de multiplexado

Active flow technology (AFT) is new form of column technology that was designed to overcome flow heterogeneity to increase separation performance in terms ...

El objetivo general de este procedimiento de HPLC consiste en ajustar una columna de flujo segmentado paralelo para permitir la detección multiplex. Este método responde preguntas clave en las áreas de salud y bienestar, ciencias ambientales, ciencias forenses, y cualquier área que requiera el análisis de muestras complejas, como el descubrimiento biológico. Esta técnica permite un análisis integral de la muestra y, al mismo tiempo, proporciona información sobre las características químicas y bioactivas de las sustancias presentes en mezclas complejas.Los protocolos de detección múltiple también permiten un análisis rápido. Este método posibilita el desarrollo de estrategias para definir la huella química de mezclas complejas, como el café y el vino, lo que permite a los fabricantes distinguir entre sus productos y variedades falsificadas más baratas. Inicialmente, podría parecer poco convencional no enviar la muestra completa a un único detector para un análisis preciso.Sin embargo, la concentración del analito dentro de cada corriente de flujo es mayor que la corriente de flujo total de una columna convencional. Para comenzar, configure el instrumento de HPLC con agua al 100 % UE

tuning-parallel-segmented-flow-column-enabling-multiplexed

Research

Investigación

JoVE Journal

Chemistry

Química

Un método automático para la identificación adecuados cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) medios para ser utilizados en el proceso de purificación de proteínas se presenta. El método utiliza un sistema de líquido de presión media, incluyendo cromatografía de buffer blending automatizado, la inyección de la muestra dinámica de bucle, la selección secuencial de columna, el análisis de múltiples longitudes de onda, y la recolección dividida fracción del eluato.

La interacción hidrofóbica automatizada cromatografía en columna de selección para uso en la purificación de proteínas

Se presenta un protocolo para el uso de columnas de cromatografía líquida de alto rendimiento de flujo de reacción para métodos que emplean derivatización posterior a la columna (PCD).

Columna posterior derivatización usando la reacción en columnas de flujo Cromatografía Líquida de Alta

Aquí, presentamos un protocolo para el funcionamiento y la optimización de la columna de Tecnología de Flujo Activo (AFT) en modo de flujo de cortina (CF) para mejorar el rendimiento de la separación.

Cortina Columna de flujo: optimización de la eficiencia y sensibilidad

Se presenta un protocolo rápido para la digestión proteolítica con un microrreactor tríptico de flujo continuo construido internamente acoplado a un espectrómetro de masas de ionización por electrospray (ESI). Se describe la fabricación del microrreactor, la configuración experimental y el proceso de adquisición de datos.

Tratamiento enzimático rápido de proteínas para la detección MS con un microrreactor de flujo continuo

La detección de fluorescencia multicolor en microfluídica de gotas suele implicar sistemas de detección basados en microscopio de epifluorescencia voluminosos y complejos. Aquí describimos un esquema de detección multicolor compacto y modular que utiliza una matriz de fibras ópticas para codificar temporalmente los datos multicolor recopilados por un solo fotodetector.

Multicolor detección por fluorescencia de la gotita de microfluídica el uso de fibras ópticas

Demostramos una plataforma de microfluidos con una red de electrodo de superficie integrado que combina detección de pulso resistivo (RPS) con división de código de acceso múltiple (CDMA), para multiplexar la detección y el tamaño de las partículas en múltiples canales de microfluidos.

Plataforma de microfluidos con multiplexado de detección electrónica para el seguimiento espacial de las partículas

Este protocolo describe la implementación de un sistema de microscopía óptica de estiramiento-tiempo de detección asimétrica para la obtención de imágenes de una sola célula en el flujo microfluídico ultrarrápido y sus aplicaciones en citometría de flujo por imágenes.

Microfluidic Imaging Cytometría de flujo por Asimétrica de detección de tiempo de estiramiento Microscopía óptica (ATOM)

Este protocolo muestra un ensayo de extensión de flujo simple, robusto y alto rendimiento sola molécula para estudiar la difusión unidimensional de (1D) de moléculas de ADN.

Una sola molécula Simple, robusto y alto rendimiento flujo estiramiento aplicación de análisis para el estudio de transporte de moléculas a lo largo de la DNA

Detallados en este documento son los protocolos de montaje y funcionamiento de una plataforma de proyección modular de microfluidos para la caracterización sistemática de síntesis de nanocristales de semiconductor coloidal. A través de acuerdos de sistema completamente ajustable, colección de espectros muy eficiente puede llevarse a cabo a través de escalas de tiempo de reacción de 4 órdenes de magnitud dentro de un espacio de muestreo controlado por transferencia de masa.

Una tecnología de microfluidos Modular para estudios sistemáticos de nanocristales de Semiconductor coloidal

Aquí presentamos un protocolo para el procedimiento optimizado de empaquetado de columna capilar FlashPack. La aplicación de un protocolo optimizado a una configuración común de bomba de presión de 100 bar permite un embalaje y una fabricación 10 veces más rápidos de columnas capilares largas y de ultra alto rendimiento.

Fabricación interna sencilla de columnas capilares de ultra alto rendimiento con el enfoque FlashPack

La bioquímica visual de una sola molécula estudiada a través de cámaras microfluídicas se facilita enormemente utilizando barriles de vidrio, jeringas herméticas al gas, conexiones estables de tubos a células de flujo y eliminación de burbujas mediante la colocación de válvulas de conmutación entre las jeringas y el tubo. El protocolo describe trampas ópticas duales que permiten la visualización de transacciones de ADN e interacciones intermoleculares.

Uso de pinzas ópticas duales y microfluídica para estudios de moléculas individuales

Aprende a ajustar columnas de cromatografía de flujo segmentado paralelo para habilitar la detección multiplexada en muestras complejas. Este método HPLC permite el análisis rápido de mezclas como café y vino.

Puesta a punto del paralelo Columna de flujo segmentado y habilitación de detección de multiplexado

Explorar más videos