Puesta a punto del paralelo Columna de flujo segmentado y habilitación de detección de multiplexado

El objetivo general de este procedimiento de HPLC consiste en ajustar una columna de flujo segmentado paralelo para permitir la detección multiplex. Este método responde preguntas clave en las áreas de salud y bienestar, ciencias ambientales, ciencias forenses, y cualquier área que requiera el análisis de muestras complejas, como el descubrimiento biológico. Esta técnica permite un análisis integral de la muestra y, al mismo tiempo, proporciona información sobre las características químicas y bioactivas de las sustancias presentes en mezclas complejas.

Los protocolos de detección múltiple también permiten un análisis rápido. Este método posibilita el desarrollo de estrategias para definir la huella química de mezclas complejas, como el café y el vino, lo que permite a los fabricantes distinguir entre sus productos y variedades falsificadas más baratas. Inicialmente, podría parecer poco convencional no enviar la muestra completa a un único detector para un análisis preciso.

Sin embargo, la concentración del analito dentro de cada corriente de flujo es mayor que la corriente de flujo total de una columna convencional. Para comenzar, configure el instrumento de HPLC con agua al 100 % UE y metanol puro como fases móviles A y B, respectivamente. Si se va a utilizar un detector de MS, agregue 0,1 % de ácido fórmico a ambas fases móviles y luego purgue las bombas de HPLC según las instrucciones del fabricante.

Monte los detectores MS UV VS. y DPPH. Según las instrucciones del fabricante. Asegúrese de que los componentes estén dispuestos adecuadamente, de modo que el volumen muerto en las líneas de los detectores sea mínimo.

Luego configure la longitud de onda del detector UV VISTA a la longitud de onda específica para la muestra aquí. 280 nanómetros para el detector MS. Utilice el modo positivo para el recuento total de iones o análisis TIC con el método de detección por escaneo completo.

Equilibre la temperatura y el flujo de gas del detector de espectrometría de masas (MS) a los siguientes valores: temperatura del vaporizador de 500 grados Celsius, temperatura del capilar de 350 grados Celsius, flujo de gas auxiliar de 40 unidades, flujo de gas de barrido de cinco unidades, velocidad del gas de envoltura de 60 unidades y voltaje de pulverización de 3,5 kilovoltios. Para preparar el reactivo del radical DPPH, comience por disolver 25 miligramos de radical DPPH en 250 mililitros de metanol en un matraz aforado.

Agregue 250 microlitros de ácido fórmico a la solución y someta la solución a sonicación durante 10 minutos. Luego, cubra el matraz con papel de aluminio para evitar la exposición a la luz. A continuación, purgue la bomba con la solución del radical DPPH según lo indicado por el fabricante para configurar el sistema de radical DPPH.

Asegúrese de que la línea de la bomba esté sujeta a la entrada de una pieza en T y luego conecte la bobina de reacción de 100 microlitros a la salida de la pieza en T. Conecte el detector al otro extremo de la carcasa ENC de la bobina de reacción, la bobina de reacción y un calentador de columna. Finalmente, ajuste el detector UV de radicales DPPH a 520 nanómetros.

Para construir la columna de flujo segmentado en paralelo o columna PSF, primero conecte la entrada de la columna al instrumento de HPLC. A continuación, use un tramo de tubo para conectar el puerto central al detector de MS. Use tubo de las mismas dimensiones para conectar un puerto periférico de la columna al detector UV VS y otro al accesorio en T del sistema de detección del radical DPPH.

Bloquee cualquier puerto periférico no utilizado con tapones de columna. Ajuste el flujo de la HPLC a un mililitro por minuto de fase móvil B al 100% para una columna de 4.6 milímetros de diámetro interno y 250 milímetros de longitud. Equilibre durante 20 minutos.

Para comenzar a ajustar el sistema PSF, primero deseche el contenido de los recipientes de recolección. Utilice estos viales para recolectar por separado la fase móvil procedente de los puertos UV VS y DPPH radical. Anote el período de recolección y recoja al menos 500 miligramos de disolvente en cada recipiente.

A continuación, pese los recipientes de recolección para determinar la masa de la fase móvil y divida la masa por la densidad del metanol para calcular el volumen de la fase móvil recolectada de cada puerto. Finalmente, determine el caudal hacia el detector de MS y calcule las proporciones de flujo de todos los detectores como porcentaje del flujo total según se indica en el protocolo del texto. Si las proporciones de flujo se desvían considerablemente de los valores ideales, agregue tubos adicionales según sea necesario para ajustar la presión de contrapresión y repita el proceso de recolección y cálculo.

Finalmente, ajuste el caudal de la bomba del reactivo radical DPPH para que coincida con el caudal del puerto de salida conectado al detector. Se realizó un análisis HPLC multiplexado en una muestra de café. La capacidad de registrar cromatogramas UV y MS del radical DPPH simultáneamente permite que los compuestos en la muestra que respondieron positivamente al radical DPPH se puedan asociar fácilmente al UV frente a.

Y las respuestas de MS basadas en la alineación del tiempo de retención, en las que se observó una respuesta positiva del detector TIC de MSS, se registró la masa molecular del pico. La facilidad para comparar picos entre diferentes procesos de detección permite una forma más rápida y eficiente de cribado y caracterización de una muestra compleja como el café. Una vez dominada, esta técnica puede configurarse en aproximadamente una hora y estar lista para el análisis de muestras siguiendo este procedimiento. Otros detectores, como el índice de refracción, fluorescencia, y detecciones basadas en reacciones químicas, como la quimioluminiscencia, pueden utilizarse para obtener información adicional sobre la muestra.

Después de ver este video, debería reconocer la importancia de la detección multiplex para obtener una comprensión más amplia de una muestra compleja. Además, la detección multiplex mediante columnas de flujo segmentado en paralelo es una forma extremadamente eficiente de realizar la exploración biológica.