Columna posterior derivatización usando la reacción en columnas de flujo Cromatografía Líquida de Alta

El objetivo general de este método es mejorar la eficiencia y la sensibilidad de la derivatización posterior a la columna de cromatografía líquida de alta resolución, o método PCD, mediante el uso de una columna de flujo de reacción. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en campos como las ciencias farmacéuticas, biomédicas y ambientales, donde se analizan compuestos que tienen una baja respuesta a los detectores de HPLC. La principal ventaja de esta técnica es que no se necesitan bobinas de reacción.

Como la mezcla del efluente de la columna y el reactivo derivatizante se produce de manera más eficiente que los métodos convencionales. Este método se ha utilizado para proporcionar información sobre antioxidantes, aminoácidos y fenoles. También se puede aplicar a otros compuestos de clase, como tioles, metales, antibióticos y toxinas.

Aunque toda la muestra no se derivatiza, debido al ensanchamiento de la banda más baja, la concentración de analito dentro de la corriente de flujo del efluente es mayor que en el análisis convencional de derivatización posterior a la columna. Para comenzar este procedimiento, prepare el instrumento de HPLC con 100% de agua en la línea A y 100% de metanol en la línea B como fase móvil, purgando las bombas según los requisitos del fabricante. Configure los componentes instrumentales de HPLC y la bomba de derivatización adicional.

A continuación, configure el detector UV/VIS para analizar a una longitud de onda de 520 nanómetros. Conecte la entrada de la columna de flujo de reacción, o RF, al instrumento de HPLC. Conecte un puerto periférico de salida al detector UV/VIS mediante un tubo de 15 centímetros de longitud y 0,13 milímetros de diámetro interior.

A continuación, conecte la línea de bomba DPPH a un puerto periférico en la salida de la columna de RF. Bloquee el puerto periférico no utilizado en la salida de la columna de RF con un tope de columna. Conecte un tubo de 15 centímetros de diámetro interior de 0,13 milímetros de longitud al puerto central de salida de la columna de RF.

Lleve el caudal de la bomba de HPLC a un milímetro por minuto al 100% de metanol. A continuación, equilibre la columna con metanol al 100% durante 10 minutos. En este punto, prepare una solución de 0,1 miligramos por mililitro de DPPH y metanol.

Sonicar el matraz que contiene el reactivo DPPH durante 10 minutos. Purgue la bomba DPPH con el reactivo DPPH preparado según los requisitos del fabricante. Después de esto, tome dos recipientes secos y limpios y etiquete uno como central y el otro como periférico.

Recoja el efluente que sale del puerto central hacia el recipiente etiquetado como "central" durante un minuto. Después de volver a pesar el buque del puerto central, calcule el peso del flujo desde el puerto central. Repita los pasos anteriores para el efluente que sale del UV/VIS que está conectado al puerto periférico de la columna de RF.

Calcule el peso del buque portuario periférico. A continuación, calcule el porcentaje del flujo que proviene de los puertos central y periférico. Repita los pasos anteriores hasta que la relación de flujo sea correcta, luego ajuste el caudal de la bomba DPPH a 0,5 mililitros por minuto.

Una vez finalizada la ejecución, detenga el flujo de la bomba de reactivo de derivatización. Retire la línea de la bomba de reactivo DPPH del puerto periférico y tape el puerto. Equilibrar la columna con la fase móvil en la que se va a almacenar, permitiendo que la fase móvil pase a través de la columna a un milímetro por minuto durante 10 minutos.

Luego, detenga el flujo de la bomba de fase de burbujas en el instrumento de HPLC. Por último, sustituya el reactivo DPPH por metanol y purgue la bomba adicional. Aquí se muestran dos cromatogramas de una muestra de café ristretto, derivatizada con un radical DPPH utilizando instrumentación convencional de PCD y RF-PCD.

A continuación se enumeran los límites calculados de cuantificación y detección para cada uno de los aminoácidos analizados tanto en el modo RF-PCD como en el modo PCD convencional. Aquí se muestra un cromatograma de los cuatro aminoácidos analizados utilizando el método convencional de PCD, el método RF-PCD y el flujo no derivatizado del método RF-PCD. Aquí se muestra una comparación de las señales obtenidas para los picos debidos a la glicina y la leucina utilizando los métodos convencionales de PCD y RF-PCD.

Aquí se muestra una comparación del ancho de pico del pico de triptófano cuando se analiza utilizando el método PCD convencional, el método RF-PCD y el flujo no derivatizado del método RF-PCD. Se separó, derivizó y detectó una muestra de prueba de 21 componentes que contenía algunos componentes que muestran una respuesta al esquema de derivatización y otros que no. La misma mezcla también se separó y se detectó sin derivatizar para la comparación.

Aquí se muestra una comparación de la forma del pico del para-Cresol, tanto derivatizado utilizando la columna RF-PCD como no derivatizado. Una vez dominada, esta técnica se puede configurar al mismo tiempo que el análisis convencional de derivatización posterior a la columna. Al realizar este procedimiento, es importante recordar estar lo más cerca posible de las relaciones de flujo prescritas.

Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar otros reactivos de derivatización posterior a la columna, como OPA, ninhidrina o halógenos para analizar otros compuestos. Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo configurar y ajustar una columna de flujo de reacción.