Columna posterior derivatización usando la reacción en columnas de flujo Cromatografía Líquida de Alta
26 de abril de 2016
Se presenta un protocolo para el uso de columnas de cromatografía líquida de alto rendimiento de flujo de reacción para métodos que emplean derivatización posterior a la columna (PCD).
El objetivo general de este método es mejorar la eficiencia y la sensibilidad de la derivatización posterior a la columna de cromatografía líquida de alta resolución, o método PCD, mediante el uso de una columna de flujo de reacción. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en campos como las ciencias farmacéuticas, biomédicas y ambientales, donde se analizan compuestos que tienen una baja respuesta a los detectores de HPLC. La principal ventaja de esta técnica es que no se necesitan bobinas de reacción.
Como la mezcla del efluente de la columna y el reactivo derivatizante se produce de manera más eficiente que los métodos convencionales. Este método se ha utilizado para proporcionar información sobre antioxidantes, aminoácidos y fenoles. También se puede aplicar a otros compuestos de clase, como tioles, metales, antibióticos y toxinas.
Aunque toda la muestra no se derivatiza, debido al ensanchamiento de la banda más baja, la concentración de analito dentro de la corriente de flujo del efluente es mayor que en el análisis convencional de derivatización posterior a la columna. Para comenzar este procedimiento, prepare el instrumento de HPLC con 100% de agua en la línea A y 100% de metanol en la línea B como fase móvil, purgando las bombas según los requisitos del fabricante. Configure los componentes instrumentales de HPLC y la bomba de derivatización adicional.
A continuación, configure el detector UV/VIS para analizar a una longitud de onda de 520 nanómetros. Conecte la entrada de la columna de flujo de reacción, o RF, al instrumento de HPLC. Conecte un puerto periférico de salida al detector UV/VIS mediante un tubo de 15 centímetros de longitud y 0,13 milímetros de diámetro interior.
A continuación, conecte la línea de bomba DPPH a un puerto periférico en la salida de la columna de RF. Bloquee el puerto periférico no utilizado en la salida de la columna de RF con un tope de columna. Conecte un tubo de 15 centímetros de diámetro interior de 0,13 milímetros de longitud al puerto central de salida de la columna de RF.
Lleve el caudal de la bomba de HPLC a un milímetro por minuto al 100% de metanol. A continuación, equilibre la columna con metanol al 100% durante 10 minutos. En este punto, prepare una solución de 0,1 miligramos por mililitro de DPPH y metanol.
Sonicar el matraz que contiene el reactivo DPPH durante 10 minutos. Purgue la bomba DPPH con el reactivo DPPH preparado según los requisitos del fabricante. Después de esto, tome dos recipientes secos y limpios y etiquete uno como central y el otro como periférico.
Recoja el efluente que sale del puerto central hacia el recipiente etiquetado como "central" durante un minuto. Después de volver a pesar el buque del puerto central, calcule el peso del flujo desde el puerto central. Repita los pasos anteriores para el efluente que sale del UV/VIS que está conectado al puerto periférico de la columna de RF.
Calcule el peso del buque portuario periférico. A continuación, calcule el porcentaje del flujo que proviene de los puertos central y periférico. Repita los pasos anteriores hasta que la relación de flujo sea correcta, luego ajuste el caudal de la bomba DPPH a 0,5 mililitros por minuto.
Una vez finalizada la ejecución, detenga el flujo de la bomba de reactivo de derivatización. Retire la línea de la bomba de reactivo DPPH del puerto periférico y tape el puerto. Equilibrar la columna con la fase móvil en la que se va a almacenar, permitiendo que la fase móvil pase a través de la columna a un milímetro por minuto durante 10 minutos.
Luego, detenga el flujo de la bomba de fase de burbujas en el instrumento de HPLC. Por último, sustituya el reactivo DPPH por metanol y purgue la bomba adicional. Aquí se muestran dos cromatogramas de una muestra de café ristretto, derivatizada con un radical DPPH utilizando instrumentación convencional de PCD y RF-PCD.
A continuación se enumeran los límites calculados de cuantificación y detección para cada uno de los aminoácidos analizados tanto en el modo RF-PCD como en el modo PCD convencional. Aquí se muestra un cromatograma de los cuatro aminoácidos analizados utilizando el método convencional de PCD, el método RF-PCD y el flujo no derivatizado del método RF-PCD. Aquí se muestra una comparación de las señales obtenidas para los picos debidos a la glicina y la leucina utilizando los métodos convencionales de PCD y RF-PCD.
Aquí se muestra una comparación del ancho de pico del pico de triptófano cuando se analiza utilizando el método PCD convencional, el método RF-PCD y el flujo no derivatizado del método RF-PCD. Se separó, derivizó y detectó una muestra de prueba de 21 componentes que contenía algunos componentes que muestran una respuesta al esquema de derivatización y otros que no. La misma mezcla también se separó y se detectó sin derivatizar para la comparación.
Aquí se muestra una comparación de la forma del pico del para-Cresol, tanto derivatizado utilizando la columna RF-PCD como no derivatizado. Una vez dominada, esta técnica se puede configurar al mismo tiempo que el análisis convencional de derivatización posterior a la columna. Al realizar este procedimiento, es importante recordar estar lo más cerca posible de las relaciones de flujo prescritas.
Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar otros reactivos de derivatización posterior a la columna, como OPA, ninhidrina o halógenos para analizar otros compuestos. Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo configurar y ajustar una columna de flujo de reacción.
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Descripción general
Este artículo presenta un protocolo para mejorar la eficiencia y sensibilidad de la derivatización posterior a la columna en cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) mediante el uso de columnas de flujo reaccionante. Este método es particularmente útil para analizar compuestos con baja respuesta a los detectores de HPLC en diversos campos científicos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Ciencias Farmacéuticas
- Ciencias Biomédicas
- Ciencias Ambientales
Antecedentes
- La cromatografía líquida de alta eficacia se utiliza ampliamente para el análisis de compuestos.
- La derivatización posterior a la columna mejora la sensibilidad de detección.
- Los métodos convencionales a menudo requieren bobinas de reacción, que este método elimina.
- Se logra una mezcla eficiente del eluyente de la columna y los reactivos.
Objetivo del estudio
- Mejorar la eficiencia de los métodos de PCD por HPLC.
- Analizar compuestos con respuestas bajas en el detector.
- Proporcionar información sobre diversas clases de compuestos.
Métodos Utilizados
- Uso de columnas de cromatografía líquida de alto rendimiento por flujo de reacción.
- Técnicas de derivatización posterior a la columna.
- Análisis de antioxidantes, aminoácidos y fenoles.
- Aplicación a tiolos, metales, antibióticos y toxinas.
Resultados Principales
- Mayor eficiencia y sensibilidad en la detección de compuestos.
- La eliminación de las bobinas de reacción mejora el rendimiento del método.
- Aplicación exitosa en múltiples clases de compuestos.
- Conocimientos obtenidos sobre interacciones bioquímicas complejas.
Conclusiones
- El método de columna de flujo de reacción mejora significativamente la DCP por HPLC.
- Esta técnica es versátil para diversas aplicaciones científicas.
- Estudios futuros pueden ampliar su uso en otros campos analíticos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La derivatización posterior a la columna (PCD) mejora la sensibilidad de detección para analitos de baja respuesta en investigaciones farmacéuticas y biomédicas, pero los métodos convencionales presentan ensanchamiento de bandas debido a las grandes bobinas de reacción. La PCD con flujo de reacción (RF-PCD) elimina esta limitación al permitir una mezcla eficiente dentro de la columna, mejorando la eficiencia de separación y la relación señal-ruido. Este avance permite la cuantificación confiable de compuestos como aminoácidos, antioxidantes y fenoles, afectando directamente la sensibilidad del ensayo en flujos de trabajo de descubrimiento temprano.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la detección de analitos no derivatizados desde el puerto central, posibilitando el monitoreo paralelo de especies nativas y modificadas para obtener información mecanicista.
- Valor operativo: Elimina las bobinas de reacción, reduciendo el volumen muerto del sistema y minimizando la ampliación de bandas para preservar la resolución cromatográfica.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Mejora la relación señal-ruido para compuestos de baja abundancia, aumentando los límites de detección en ensayos de antioxidantes, aminoácidos y fenoles.
- Valor operativo: Utiliza componentes estándar de HPLC con una bomba de derivatización, permitiendo una integración sencilla en plataformas analíticas existentes.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Apoya el análisis de diversas clases de compuestos, incluyendo tiolos, metales, antibióticos y toxinas, ampliando su aplicabilidad en estudios de seguridad y perfilado de metabolitos.
- Valor operativo: Mantiene compatibilidad con la detección UV/VIS a 520 nm, permitiendo su adopción inmediata sin necesidad de instrumentación nueva.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
RF-PCD se integra en el continuo de descubrimiento al mejorar la fiabilidad de la detección en la fase inicial de cribado, donde la cuantificación sensible de compuestos bioactivos orienta la identificación y priorización de candidatos prometedores.
- Biología del Descubrimiento: Mejora la confianza en la detección de metabolitos y biomarcadores de baja respuesta al aumentar la sensibilidad analítica sin las ineficiencias de la derivatización.
- Screening: Proporciona resultados cuantitativos y reproducibles mediante la reducción del volumen de reacción y una mezcla eficiente, lo que favorece la evaluación de alto rendimiento de compuestos.
- Análisis: Permite la comparación directa entre flujos derivatizados y no derivatizados, ofreciendo controles internos para la validación del ensayo y la normalización de datos.
- Investigación Traducional: Facilita el monitoreo continuo de analitos desde el descubrimiento hasta los estudios preclínicos, preservando la integridad del analito y la fidelidad de la detección.
- Reutilización Empresarial: Aprovecha la infraestructura existente de HPLC con complejidad mínima adicional, promoviendo la estandarización entre departamentos y la portabilidad de métodos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la detección del analito al reducir los falsos negativos derivados de la insensibilidad y mejorar la claridad de la señal.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y escalabilidad al eliminar la variabilidad asociada con la preparación del reactor en espiral y la eficiencia de mezclado.
- Valor estratégico: Apoya decisiones más sólidas de avance o descarte en la optimización de compuestos activos al proporcionar datos más precisos sobre las relaciones estructura-actividad mediante una detección sensible.
- Impacto en la cartera: Permite el avance de candidatos ajustado al riesgo al mejorar la calidad de los datos en ensayos tempranos de cribado de ADME y toxicidad.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el desarrollo de métodos de HPLC y en la optimización del flujo para equilibrar los flujos del reactivo de derivatización y de la fase móvil.
- Necesita una bomba de derivatización dedicada y tubos compatibles (diámetro interno de 0,13 mm) para una entrega precisa del reactivo a los puertos periféricos.
- Exige la estandarización de las relaciones de flujo entre los puertos central y periféricos para garantizar una eficiencia de derivatización constante entre corridas.
- Incluye mantenimiento rutinario, como pasos de purga y equilibrio, para prevenir la retención de reactivos y asegurar la estabilidad de la columna.
- Se limita a reacciones de derivatización de un solo componente o de dos componentes, en las que ambos reactivos puedan introducirse simultáneamente a través de puertos periféricos.
