Name: Columna posterior derivatización usando la reacción en columnas de flujo Cromatografía Líquida de Alta (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: Aprende a mejorar la eficiencia y sensibilidad de la cromatografía líquida de alta resolución con derivatización post-columna usando columnas de flujo reactivo. Este método elimina las bobinas de reacción convencionales y permite analizar compuestos con baja respuesta en detectores HPLC en ciencias farmacéuticas, biomédicas y ambientales.

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Este trabajo fue apoyado por UWS y ThermoFisher Scientific. Uno de los autores (DK) acusa recibo de un Premio Australiano de Posgrado.

Precaución: Por favor, consulte las hojas de datos de seguridad del material (MSDS) para todos los materiales y reactivos antes de su uso (es decir, Pedidos de metanol). Asegurar el uso de todas las prácticas apropiadas de seguridad al manipular disolventes y cromatografía líquida de eluyente alta resolución (HPLC). Asegurar el uso apropiado de los controles de ingeniería de HPLC, balanza analítica y un detector de instrumentación, y asegurar el uso de equipo de protección personal (gafas de seguridad, guantes, bata de laboratorio, pantalones largos y zapatos cerrados). Nota: Este protocolo describe 3 métodos de flujo de reacción de derivatización post-columna (RF-PCD) técnicas, cada uno con un reactivo diferente específica a la naturaleza de un compuesto químico de interés. Para el análisis de ROS vaya a la sección &quot;1. La detección de ROS mediante DPPH •&quot;, para el análisis de aminas primarias véase la sección &quot;2. Detección de aminas primarias usando fluorescamina&quot;, y para el análisis de compuestos fenólicos vaya a la sección &quot;3 . La detección de fenolesutilizando 4-aminoantipireno y ferricianuro de potasio &quot;. Use agua ultra pura (por ejemplo, agua Milli-Q) en todas partes. Nota: La conexión de la columna de RF se consigue en casi la misma forma que una columna de HPLC convencional con la principal diferencia es el número de accesorios de los extremos en una columna de RF. Accesorios utilizados para conectar una columna de HPLC estándar para el sistema de HPLC son capaces de ser utilizado para conectar una columna de RF al sistema de HPLC. 1. Detección de ROS Utilizando DPPH • <ol><li> Puesta en marcha de instrumento de HPLC <ol><li> Preparación del instrumento HPLC con 100% de agua en la línea A y 100% de metanol en la línea B como la fase móvil. Purgar las bombas de acuerdo con los requisitos del fabricante. </li><li> Configurar los componentes instrumentales de HPLC y la bomba de derivatización adicional como se ilustra en la Figura 4A. </li><li> Ajuste el detector de UV-Vis para analizar a una longitud de onda de 520 nm. </li></ol></li><li> Puesta en marcha decolumna de RF <ol><li> Conectar la entrada de la columna de RF al instrumento HPLC. </li><li> Conectar una longitud de 15 cm de tubo de 0,13 mm ID para el puerto de salida central de la columna de la RF. </li><li> Conectar un puerto de periféricos de salida al detector UV-Vis utilizando una longitud de 15 cm de tubo Identificación del 0,13 mm. </li><li> Conecte la línea de bomba de DPPH • a un puerto de periféricos de la salida de la columna de RF. </li><li> Bloquear el puerto de periféricos sin utilizar en la salida de la columna de RF usando un tapón de columna. </li><li> Llevar la velocidad de flujo de la bomba de HPLC a 1 ml min -1 a 100% de la línea B - 100% de metanol. </li><li> Equilibrar la columna con la fase móvil metanol 100% durante 10 min para una columna mm de longitud 4,6 mm ID x 100. Este tiempo debe hacerse a escala de acuerdo a las dimensiones de otras columnas, el usuario puede emplear. </li></ol></li><li> Preparación de DPPH • Reactivo <ol><li> Preparar una solución / ml 0,1 mg de DPPH • en metanol. </li&gt; <li> Sonicar el matraz que contiene el DPPH • reactivo para 10 min. </li><li> Tapar el matraz en papel de aluminio para evitar la exposición a la luz. </li><li> Purgar el DPPH • bomba con el preparado de DPPH • Reactivo de acuerdo con los requisitos del fabricante. </li></ol></li><li> Sintonizar la salida de la columna de RF <ol><li> Se pesan exactamente dos recipientes limpios y secos. Etiquetar un recipiente como un elemento central y el otro como periférico. </li><li> Recoger el efluente que sale del puerto central en el recipiente de marcado central para 1,0 min. </li><li> Volver a pesar el recipiente de puerto central y calcular el peso del flujo desde el puerto central de la siguiente manera: Peso del puerto central (g) = peso final del puerto central del buque (g) - Peso inicial del puerto central del buque (g) </li><li> Repetir los pasos 1.4.2 y 1.4.3 para el efluente que sale de la UV-Vis que está unido al puerto de periféricos de la columna de RF y calcular el peso de la embarcación puerto de periféricos comosiguiente: Peso del puerto de periféricos (g) = peso final del puerto de periféricos de buques (g) - Peso inicial del puerto de periféricos de buques (g) </li><li> Calcular el porcentaje de la corriente procedente de los puertos centrales y periféricas de la siguiente manera: % Puerto central = Peso del puerto central (g) / (Peso del puerto central (g) + Peso del puerto de periféricos (g)) x 100 % De puerto de periféricos = Peso del puerto de periféricos (g) / (Peso del puerto central (g) + Peso del puerto de periféricos (g)) x 100 </li><li> Asegúrese de que la relación de segmentación entre el flujo central y el flujo periférico es 30:70 (central: periférica). Si el flujo central está por encima de 30%, disminuir la cantidad de salida de flujo mediante la adición de una longitud de tubo de id 0,13 mm a la salida del puerto central. Si el flujo central está por debajo de 30% de disminución de la longitud de la tubería mm 0,13 desde el puerto central. </li><li> Repita el paso 1.4.1 a la 1.4.6 hasta que una relación de segmentación de 30:70 (central: periférica) se logra. </li><li> Ajuste el caudal de la DPPH • bomba de reactivo de 0,5 ml min-1. Nota: La columna de RF configurado con DPPH • reactivo está listo para su análisis. Ahora se pueden inyectar las muestras. </li></ol></li><li> Pon ejecutar condiciones de parada <ol><li> Una vez que todas las muestras se han inyectado, lo que indica que la carrera ha terminado, detener el flujo de la bomba del reactivo de derivatización. </li><li> Retire la línea de DPPH • bomba de reactivo desde el puerto de periféricos y el tapón del puerto. </li><li> Equilibrar la columna con la fase móvil en la que se va a guardar, permitiendo la fase móvil para pasar a través de la columna a 1 ml min -1 para 10 min. </li><li> Detener el flujo de la bomba de la fase móvil en el instrumento de HPLC. </li><li> Vuelva a colocar el DPPH • reactivo con metanol y purgar la bomba adicional. Nota: El sistema HPLC puede ahora ser apagado. </li></ol></li></ol> 2. Detección de aminas primarias Uso de FLUORESCamina <ol><li> Preparación de la fase móvil <ol><li> Preparar 1 L de una solución de acetato de amonio 10 mM, ajustando el pH de la solución a 9,0 con hidróxido de amonio 5 M antes de la dilución al volumen. </li><li> Añadir 52,6 ml de acetonitrilo (ACN) al tampón de acetato de amonio para obtener una fase móvil premezclada de 95:05 (tampón: ACN). </li></ol></li><li> Puesta en marcha de instrumento de HPLC <ol><li> Preparación del instrumento HPLC con el tampón preparado pre-mezclado de la línea A como fase móvil. Purgar la bomba de acuerdo con los requisitos del fabricante. </li><li> Configurar los componentes instrumentales de HPLC y la bomba de derivatización adicional como se ilustra en la Figura 4A. </li><li> Adjuntar una bobina amortiguador de impulsos a la bomba de derivación. </li><li> Puesta en marcha del detector de fluorescencia (FLD) con una longitud de onda de excitación de longitud de onda de 390 nm y emisión de 475 nm. </li></ol></li><li> Puesta en marcha de la columna de RF <ol><li> Conectar THe entrada de la columna de RF al instrumento HPLC. </li><li> Conectar una longitud de 15 cm de tubo de 0,13 mm ID para el puerto de salida central de la columna de la RF. </li><li> Conectar un puerto de periféricos de salida de la columna de RF al detector FLD utilizando una longitud de 15 cm de tubo de Identificación del 0,13 mm. </li><li> Conecte la línea de bomba de derivación a un puerto de periféricos de la salida de la columna de RF. </li><li> Bloquear el puerto de periféricos sin utilizar en la salida de la columna de RF usando un tapón de columna. </li><li> Llevar la velocidad de flujo de la bomba de HPLC a 1 ml min -1 a 100% de la línea A - 10 mM acetato de amonio tampón de pH 9, premezclado con 5% de ACN. </li><li> Equilibrar la columna con la línea de una fase móvil 100% durante 10 min para una columna mm de longitud 4,6 mm ID x 100. Este tiempo puede hacerse a escala de acuerdo a las dimensiones de otras columnas, el usuario puede emplear. </li></ol></li><li> Preparación de reactivo de fluorescamina <ol><li> Hacer 100 ml de un reactivo de 0,1 mg ml -1 fluorescamina. </li> &lt;li&gt; Someter a ultrasonidos durante 1 minuto. </li><li> Cubrir con papel de aluminio para evitar la exposición a la luz. </li><li> Purgar la bomba de reactivo con el reactivo fluorescamina preparados de acuerdo con los requisitos del fabricante. </li></ol></li><li> Sintonizar la salida de la columna de RF <ol><li> Se pesan exactamente dos recipientes limpios y secos. Etiquetar un recipiente como un elemento central y el otro como periférico. </li><li> Recoger el efluente que sale del puerto central en el recipiente de marcado central para 1,0 min. </li><li> Volver a pesar el recipiente central y calcular el peso de la corriente desde el puerto central de la siguiente manera en el paso 1.4.3. </li><li> Repetir los pasos 2.5.2 a 2.5.3 para el efluente que sale de la FLD que está conectado al puerto de periféricos de la columna de RF y calcular el peso para periférica de la siguiente manera en el paso 1.4.4. </li><li> Calcular el porcentaje de la corriente procedente de los puertos centrales y periféricas de la siguiente manera en el paso 1.4.5. </li><li> Asegúrese de que la relación de segmentación entre el flujo central y el periféricoflujo es 43:57 (central: periférica). Si el flujo central está por encima de 43%, disminuir la cantidad de salida de flujo mediante la adición de una longitud de tubo de id 0,13 mm a la salida del puerto central. Si el flujo central está por debajo de 43%, disminuir la longitud de la tubería mm 0,13 desde el puerto central. </li><li> Repita el paso 2.5.1 a 2.5.6 hasta una proporción de 43:57 segmentación (central: periférica) se logra. </li><li> Ajuste el caudal de la bomba de fase móvil a 0,7 ml min-1. </li><li> Ajuste la bomba de derivación a fluir a 0,1 ml min-1. Nota: La columna RF configurar con el reactivo de fluorescamina está ahora lista para el análisis. Ahora se pueden inyectar las muestras. </li></ol></li><li> Pon ejecutar condiciones de parada <ol><li> Una vez que todas las muestras se han inyectado, lo que indica que la carrera ha terminado, parar la bomba derivatización. </li><li> Retire la línea de la bomba de derivación desde el puerto de periféricos y el tapón. </li><li> Equilibrar la columna con la fase móvil enque se va a guardar, permitiendo la fase móvil para pasar a través de la columna a 1 ml min -1 para 10 min. </li><li> Detener el flujo de la bomba de la fase móvil. </li><li> Vuelva a colocar el reactivo fluorescamina con acetonitrilo y purgar la bomba de derivación. Nota: El sistema HPLC puede ahora ser apagado. </li></ol></li></ol> 3. La detección de fenoles utilizando 4-aminoantipireno y ferricianuro potásico <ol><li> Preparación de la fase móvil <ol><li> Preparar 1 L de una solución de acetato de amonio 100 mM, ajustando el pH de la solución a 9,0 con hidróxido de amonio 5 M antes de la dilución al volumen. </li><li> Añadir 52,6 ml de metanol a la solución tampón de acetato de amonio para obtener una fase móvil premezclada de 95: 5 (tampón: metanol). </li></ol></li><li> Puesta en marcha de instrumento de HPLC <ol><li> Preparación del instrumento HPLC con el tampón preparado pre-mezclado de la línea A como fase móvil. Purgar la bomba de acuerdo con el fabricante; S requisitos. </li><li> Configurar los componentes instrumentales de HPLC y las dos bombas de reactivos adicionales, como se ilustra en la Figura 4B. </li><li> Adjuntar una bobina amortiguador de impulsos a cada una de las bombas de reactivos. </li><li> Ajuste el detector de UV-Vis para analizar a una longitud de onda de 500 nm. </li></ol></li><li> Puesta en marcha de la columna de RF <ol><li> Conectar la entrada de la columna de RF al instrumento HPLC. </li><li> Conectar una longitud de 15 cm de tubo de 0,13 mm ID para el puerto de salida central de la columna de la RF. </li><li> Conectar un puerto de periféricos de salida de la columna de RF al detector de UV-Vis usando una longitud de 15 cm de tubo de Identificación del 0,13 mm. </li><li> Conectar cada reactivo (es decir, 4-aminoantipireno y ferricianuro de potasio) de la línea de la bomba a un puerto de periféricos en la salida de la columna de RF. </li><li> Llevar la velocidad de flujo de la bomba de HPLC a 1 ml min -1 a 100% de la línea A - 100 mM acetato de amonio tampón de pH 9, premezclado con 5% de metanol. </li><li> Equilibrar la columna won la línea A de la fase móvil 100% durante 10 minutos para una columna mm de longitud de 4,6 mm de diámetro x 100. Este tiempo puede hacerse a escala de acuerdo a las dimensiones de otras columnas, el usuario puede emplear. </li></ol></li><li> Preparación de reactivo de 4-aminoantipireno <ol><li> Preparar un tampón de acetato de amonio con un pH de 9 siguiendo el paso 3.1.1. </li><li> Pesar 150 mg 4-aminoantipireno y disolver en 100 ml de tampón de acetato de amonio preparada (pH 9). </li><li> Sonicar durante 1 min. </li><li> Cubrir con papel de aluminio para evitar la exposición a la luz. </li><li> Purgar la primera bomba de reactivo con el reactivo 4-aminoantipireno preparados de acuerdo con los requisitos del fabricante. </li></ol></li><li> Preparación de reactivo de ferricianuro de potasio <ol><li> Pesar 150 mg de ferricianuro de potasio y disolver en 100 ml de tampón de acetato de amonio (pH 9) preparado como en la etapa 3.1.1. </li><li> Sonicar durante 1 min. </li><li> Cubrir con papel de para evitar la exposición a la luz. </li><li> Purge la segunda bomba de reactivo con el reactivo de ferricianuro de potasio preparada de acuerdo con los requisitos del fabricante. </li></ol></li><li> Sintonización de la columna de RF <ol><li> Se pesan exactamente dos recipientes limpios y secos. Etiquetar un recipiente como un elemento central y el otro como periférico. </li><li> Recoger el efluente que sale del puerto central en el recipiente de marcado central para 1,0 min. </li><li> Volver a pesar el recipiente central y calcular el peso de la corriente desde el puerto central de la siguiente manera en el paso 1.4.3. </li><li> Repetir los pasos 3.6.2 a 3.6.3 para el efluente que sale de la UV-Vis que está unido al puerto de periféricos de la columna de RF y calcular el peso para periférica de la siguiente manera en el paso 1.4.4. </li><li> Calcular el porcentaje de la corriente procedente de los puertos centrales y periféricas de la siguiente manera en el paso 1.4.5. </li><li> Asegúrese de que la relación de segmentación entre el flujo central y el flujo periférico es 50:50 (central: periférica). Si el flujo central está por encima de 50%, disminuir elcantidad de flujo que sale por la adición de una longitud de tubo de id 0,13 mm para el puerto central de salida. Si el flujo central está por debajo de 50%, disminuir la longitud de la tubería mm 0,13 desde el puerto central. </li><li> Repita el paso 3.6.1 a la 3.6.6 hasta que una relación de segmentación de 50:50 (central: periférica) se logra. </li><li> Ajuste el caudal de la bomba 4-aminoantipireno a 0,5 ml min-1. </li><li> Ajuste el caudal de la bomba de ferricianuro de potasio y 0,25 ml min-1. Nota: La columna de RF establecido con los reactivos de dos componentes está ahora listo para su análisis. Ahora se pueden inyectar las muestras. </li></ol></li><li> Pon ejecutar condiciones de parada <ol><li> Una vez que todas las muestras se han inyectado la carrera ha terminado, lo que indica que la carrera ha terminado, deje de ambas bombas de reactivos. </li><li> Retire las líneas de la bomba de reactivo de los puertos periféricos y reemplazarlos con una pieza de 15 cm de tubo de 0,13 mm. </li><li> Equilibrar la columna con la fase móvil en which que se va a guardar, permitiendo la fase móvil para pasar a través de la columna a 1 ml min -1 para 10 min. </li><li> Detener el flujo de la bomba de la fase móvil en el instrumento de HPLC. </li><li> Reemplazan tanto los reactivos en el reactivo de bombas con metanol y se purgan las bombas adicionales según el requisito del fabricante. Nota: El sistema HPLC puede ahora ser apagado. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

RF-PCD permite la mezcla eficiente del reactivo de derivatización con el efluente después de la columna de HPLC sin el uso de bobinas de reacción, reduciendo al mínimo los efectos de ensanchamiento de las bandas y la mejora de rendimiento de la separación. métodos RF-PCD también han demostrado mejoras en la respuesta de la señal con respecto al método de detección. Camenzuli et al. 28 fue el primero en reportar el uso de columnas de flujo de reacción con DPPH • para la detección de ROS en ...

cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) acoplada con la columna posterior derivatización (DCP) es una poderosa herramienta que es útil para resolver una serie de problemas en el laboratorio de análisis. Se puede utilizar para detectar compuestos que son de otro modo indetectable con la suite de detectores disponibles 1,2, aumentar la señal del analito diana, lo que permite límites inferiores de detección y cuantificación 3-5 o selectivamente derivatizar un analito diana a fin de evitar 6 efectos de la matriz. Reacciones de PCD comúnmente usados ​​incluyen la reacción de aminas, tales como aminoácidos, con orto-phthaladehyde 7-9, ninhidrina 9,10 o fluorescamina 11,12, la derivatización de las especies reactivas de oxígeno (ROS) con el 2,2-difenil- 1-picrylhydrazil radicales DPPH (•) o 13,14 2,2&#39;-azino-bis (ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico (ABTS) 15,16, y el uso del reactivo de yoduro-azida para derivatizar azufre ccompuestos ontaining 17,18. Hay, sin embargo, numerosos inconvenientes a la utilización de reacciones de PCD con sistemas de HPLC 6. Principalmente entre estos es el uso de bobinas de reacción entre el punto de adición del reactivo de derivatización (s) y el detector, que permiten tiempo para la mezcla y la reacción se produzca 8. Estos bucles de reacción a menudo tienen volúmenes de 500 l o más, lo que es significativo en comparación con el volumen del resto del sistema de HPLC 19. El uso de estos reacción alto volumen bucles de resultados en el aumento ensanchamiento de los picos en comparación con lo que se observaría sin la presencia del bucle de reacción. Esto se traduce en más cortos picos más amplios, que tienen límites más altos de cuantificación y detección y negativamente los efectos que la resolución cromatográfica. Las figuras 1 y 2 destacan el deterioro de la forma de los picos que resultan de la adición de varios volúmenes de bucle de reacción post columna. Este análisisse realizó con una composición de fase móvil de 94% de metanol y 6% de agua Milli-Q. La velocidad de flujo de la fase móvil fue de 1 ml / min, el volumen de inyección fue de 20 l y la longitud de onda análisis fue 265 nm. Las bobinas de diferentes volúmenes muertos de 20 l a 1000 l se insertaron entre la columna y el detector para simular los efectos de bucle de reacción volumen muerto en los métodos de PCD. Estos bucles se prepararon a partir de tubo de acero inoxidable de diámetro interno 0,5 mm. El experimento se realizó en un sistema HPLC que consta de un controlador (SCL-10AVP), una baja presión del gradiente de la válvula (FCL-10ALVP), una bomba (LC-20AD), un inyector (SIL-10ADvp), y un detector de PDA ( SPD-M10ADVP). La fase móvil se bombea a través de un desgasificador antes de la introducción en el sistema de HPLC. La separación se realizó usando un identificador de 5 micras columna de 250 mm x 4,6 mm. Las condiciones experimentales fueron elegidos para ser típica de las reacciones de PCD que recientemente han sido publicados en la literatura. losmás simple, la configuración más común de post reactor de columna se denomina un reactor tubular no segmentado que es efectivamente un tubo largo y delgado a través del cual el líquido puede fluir y la reacción puede tener lugar. En este pico del sistema ensanchamiento depende no sólo el volumen muerto añadido al sistema, sino también el diámetro interior del tubo como se destaca por Iijima et al. 8. Por otra parte, la geometría de la bobina juega un papel importante en la ampliación de la marca observada. Stewart 20 declaró que bobinado del reactor cambia los perfiles de flujo secundarias, lo que resulta en un mejor mezclado, lo que significa que el volumen muerto puede ser minimizado. Se ha dicho que ensanchamiento de los picos no es significativa cuando se utiliza un punto tubular abierta bobina 21. Cuando el ensanchamiento de los picos es excesivamente grande, otros tipos de reactores también pueden ser considerados 20,22. Estos pueden incluir reactores de lecho o reactores de flujo segmentados. Estos reactores son particularmente útiles para reacciones lentas que de otro modo requirbucles e gran reacción. Como reactores tubulares no segmentados son los tipos más comunes de los reactores utilizados en aplicaciones de PCD, el resto de este artículo trata con este tipo de configuración del reactor. El diseño de la columna de flujo de reacción (RF) incorpora un accesorio en el extremo de varios puertos que permite a la fase móvil para salir (o entrar) la columna a través de un puerto único situado en la región central radial de la columna o tres puertos situados en el exterior región de la pared de la columna (véase la Figura 3). Estas dos corrientes se separan usando un accesorio en el extremo que contiene una frita porosa central que está rodeado por un anillo impermeable que está a su vez rodeado por una frita de vidrio poroso exterior que se extiende a la pared de la columna. Debido al flujo transversal anillo impermeable central no es posible entre las dos regiones porosas. Durante cromatografía de flujo de reacción, el reactivo (s) de derivatización se bombea contra la dirección de flujo de la fase móvil en una o two de los puertos exteriores de la columna el flujo de reacción. El eluyente de la columna se mezcla con el reactivo (s) de derivatización en la frita exterior y se pasa al detector a través de un puerto exterior libre. flujo de reacción se puede utilizar ya sea para una derivatización solo reactivo (1 puerto para el reactivo de derivatización, 1 puerto para pasar el eluyente de la columna al detector y 1 puerto bloqueado) o un sistema de reactivos dual (2 puertos para los reactivos de derivatización y 1 puerto para pasar el eluyente de la columna al detector). El flujo de la corriente central o bien se puede utilizar para detectar el eluyente de la columna no derivatizado, con eficacia de detección de multiplexación 23, o pasado a los residuos. Una de las principales técnica de sintonización que está disponible cuando se ejecuta la cromatografía de RF-PCD es la relación de los flujos central y periférico. La relación óptima para cada derivatización depende de una serie de factores tales como si se detecta o se pasa a perder el flujo central. Por lo tanto una vez que la relación óptima se ha determinado, Se debe asegurar que la relación de flujo correcta se consigue antes de cada carrera se realiza. Se ha encontrado que el uso de una frita para mezclar la corriente de la columna de eluyente y el reactivo de derivatización en los resultados de RF-PCD en una mezcla más eficiente en comparación con técnicas de mezcla tradicionales que emplean típicamente un volumen muerto cero pieza en T o de bajo volumen muerto W- pieza a mezclar las dos corrientes. Esto ha permitido el uso de bucles de reacción relativamente pequeñas, o incluso la eliminación de la del circuito de reacción en conjunto. La reducción de los resultados de la reacción de tamaño de bucle en picos más agudos en comparación con los métodos tradicionales de derivatización post-columna. Esto significa que, a pesar del hecho de que no todo el eluyente de la columna se derivatiza, una mayor relación señal-ruido se observan y por lo tanto los límites inferiores de detección y cuantificación se puede lograr. cromatografía de flujo de reacción se ha desarrollado para superar las dificultades con la adaptación de la reacción PCDs a modernas columnas de HPLC y los sistemas, en particular la pérdida de eficacia provocada por banda ensanchamiento debido a las grandes columnas poste volúmenes muertos causados ​​por la necesidad de emplear bucles de reacción de gran volumen. Los procesos de mezcla más eficientes en RF-PCD en comparación con PCD convencionales significan que los volúmenes de bucle de reacción más pequeño se pueden emplear conduce a un aumento de la eficacia de separación observada. Además cromatografía RF-PCD muestra tanto el aumento de la señal y el ruido disminuyó en comparación con las técnicas convencionales de PCD que resulta en límites inferiores de detección y cuantificación en comparación con los métodos convencionales de PCD. Una ventaja adicional de RF-PCD comparación con los métodos convencionales de PCD es la capacidad de controlar la corriente no derivatizado que eluye desde el puerto central de la columna de la RF, así como la corriente de derivatizado que eluye de la región periférica de la columna. RF-PCD es una forma relativamente nueva pero prometedora técnica que muestra muchas ventajas sobre los métodos tradicionales de PCD. <p class="jove_content"&gt; Conexión de la columna de RF se consigue en casi la misma forma que una columna de HPLC convencional con la principal diferencia es el número de accesorios de los extremos en una columna de RF. Accesorios utilizados para conectar una columna de HPLC estándar para el sistema de HPLC son capaces de ser utilizado para conectar una columna de RF al sistema de HPLC.

<table><tbody><tr><td>Instrumento de HPLC</td><td>Agilent</td><td>serie 1290 Bomba</td>(s) adicional(es) de HPLC <td></td></tr><tr><td>para el sistema de derivatización</td><td>Shimadzu</td><td>LC-20A</td><td></td></tr><tr><td>Columna</td><td></td><td></td> RF <td>Tubo de</td></tr><tr><td>PEEK</td> no comercial <td>Sigma Aldrich</td><td>Z227307</td><td></td></tr><tr><td>Tapones de</td><td></td><td></td> columna <td>Provistos de cortador</td></tr> de <tr><td>tubo de PEEK</td><td>de columna Sigma Balanza</td><td></td> de báscula analítica Z290882 <td></td>Aldrich</tr><tr><td>Balanza</td><td></td><td></td><td>analítica de 4 puntos</td></tr><tr><td>Cronómetro</td><td></td><td></td><td>Equipo no científico</td></tr><tr><td>Viales de recolección de</td><td></td><td></td> eluyentes <td>Cualquier vial pequeño con un fondo plano servirá, p. ej., viales de HPLC Viales</td></tr><tr><td>de</td><td></td><td></td> HPLC <td>Dependerá del instrumento utilizado</td></tr><tr><td>Recipientes para fase móvil y solución(es) de derivatizaciónSigma</td> <td>Aldrich Z232211</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cristalería</td><td></td><td></td> de laboratorio general <td>Matraces volumétricos, pipetas, etc. La cantidad y los volúmenes dependerán del método de preparación de la muestra.</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>DPPH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9132</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de amonio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>17836</td><td></td></tr><tr><td>Amoníaco</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>320145 Acetonitrilo corrosivo</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>34998</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F9015</td><td></td></tr><tr><td>4- aminoantipireno&nbsp;</td><td>Acros Organics BVBA AC103151000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ferricianuro de potasio&nbsp;</td><td>AnalaR</td><td>B10204-30</td><td></td></tr></tbody></table>

columna posterior derivatización usando la reacción en columnas de flujo cromatografía líquida de alta

Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns

Se presenta un protocolo para el uso de columnas de cromatografía líquida de alta resolución de flujo de reacción para métodos que emplean derivatización posterior a la columna (PCD). Una dificultad importante en la adaptación de PCD a los sistemas y columnas modernos de HPLC es la necesidad de bobinas de reacción de gran volumen que permitan la mezcla de reactivos y luego la reacción de derivatización. Este gran volumen muerto posterior a la columna conduce a un ensanchamiento de la banda, lo que resulta en una pérdida de la eficiencia de separación observada y, de hecho, en la detección de la sensibilidad. En la derivatización posterior a la columna de flujo de reacción (RF-PCD), los reactivos de derivatización se bombean contra el flujo de la fase móvil a uno o dos de los puertos exteriores de la columna de flujo de reacción, donde se mezclan con el efluente de la columna dentro de una frita alojada dentro del accesorio del extremo de la columna. Esta técnica permite una mezcla más eficiente del efluente de la columna y los reactivos de derivatización, lo que significa que el volumen de los bucles de reacción se puede minimizar o incluso eliminar por completo. Se ha encontrado que los métodos RF-PCD funcionan mejor que los métodos convencionales de PCD en términos de eficiencia de separación observada y relación señal-ruido. Otra ventaja de las técnicas de RF-PCD es la capacidad de monitorear el efluente proveniente del puerto central en su estado no derivatizado. RF-PCD se ha probado actualmente en un rango relativamente pequeño de reacciones posteriores a la columna, sin embargo, actualmente no hay razón para sugerir que RF-PCD no pueda adaptarse a cualquier reacción de derivatización posterior a la columna de uno o dos componentes existentes (siempre que se agreguen ambos reactivos al mismo tiempo).

El primer método PCD que fue adaptado para su uso por RF-PCD fue la derivación de antioxidantes utilizando el radical 2,2-difenil-1-picrylhydrazil (DPPH •) 24. Esta reacción se introdujo por Koleva et al. 25 y se ha utilizado ampliamente desde entonces. La detección se basa en la decoloración del DPPH • radical en presencia de especies reactivas del oxígeno, por lo tanto, la presencia de los resultados de los antioxidantes en una caída en la absorbancia observado. El ...

Se presenta un protocolo para el uso de columnas de cromatografía líquida de alto rendimiento de flujo de reacción para métodos que emplean derivatización posterior a la columna (PCD).

Columna posterior derivatización usando la reacción en columnas de flujo Cromatografía Líquida de Alta

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is ...

El objetivo general de este método es mejorar la eficiencia y sensibilidad de la derivatización posterior a la columna por cromatografía líquida de alta resolución, o método PCD, mediante el uso de una columna de flujo para reacción. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en campos como las ciencias farmacéuticas, biomédicas y ambientales, donde se analizan compuestos con baja respuesta a los detectores de HPLC. La principal ventaja de esta técnica es que no se necesitan bobinas de reacción.Dado que la mezcla del efluente de la columna y el reactivo derivatizante ocurre de manera más eficiente que con los métodos convencionales. Este método se ha utilizado para obtener información sobre antioxidantes, aminoácidos y fenoles. También puede aplicarse a otras clases de compuestos, como tiolos, metales, antibióticos y toxinas.Aunque no se realiza la derivatización de toda la muestra, debido a una menor ampliación de banda, la concentración del analito dentro del flujo de efluente es más alta que en el análisis convencional de derivatización posterior a la columna. Para comenzar este procedimiento, prepare el instrumento de HPLC con agua al 100 % en la Línea A y metanol al 100 % en la Línea B como fase móvil, purgando las bombas según los requisitos del fabricante. Configure los componentes instrumentales del HPLC y la bomba adicional de derivatización.A continuación, configure el detector UV/VIS para analizar a una longitud de onda de 520 nanómetros. Conecte la entrada de la columna de flujo de reacción, o RF, al instrumento de HPLC. Conecte un puerto periférico de salida al detector UV/VIS utilizando un tubo de 15 centímetros de longitud y 0.13 milímetros de diámetro interno.A continuación, conecte la línea de la bomba DPPH a un puerto periférico en la salida de la columna RF. Bloquee el puerto periférico no utilizado en la salida de la columna RF utilizando un tapón para columna. Conecte un tramo de 15 centímetros de longitud de tubo con diámetro interno de 0,13 milímetros al puerto central de salida de la columna RF.Lleve el caudal de la bomba de HPLC a un milímetro por minuto con metanol al 100 %. Luego, equilibre la columna con metanol al 100 % durante 10 minutos. En este momento, prepare una solución de 0,1 miligramo por mililitro de DPPH en metanol.Sonicar el matraz que contiene el reactivo DPPH durante 10 minutos. Purificar la bomba de DPPH con el reactivo DPPH preparado según los requisitos del fabricante. A continuación, tome dos recipientes secos y limpios y etiquete uno como central y el otro como periférico. Pese con precisión los dos recipientes.Recoger el efluente que sale por el puerto central en el recipiente etiquetado como «central» durante un minuto. Después de volver a pesar el recipiente del puerto central, calcule el peso del flujo proveniente del puerto central. Repita los pasos anteriores para el efluente que sale del UV/VIS conectado al puerto periférico de la columna RF.Calcule el peso para el vaso del puerto periférico. A continuación, calcule el porcentaje del flujo proveniente de los puertos central y periféricos. Repita los pasos anteriores hasta que la relación de flujo sea correcta, luego ajuste la velocidad de flujo de la bomba DPPH a 0.5 mililitros por minuto.Una vez finalizada la corrida, detenga el flujo de la bomba del reactivo de derivatización. Retire la línea de la bomba del reactivo DPPH del puerto periférico y tape el puerto. Equilibre la columna con la fase móvil en la que se almacenará, haciendo pasar la fase móvil a través de la columna a una velocidad de un milímetro por minuto durante 10 minutos.Luego, detenga el flujo de la bomba de la fase con burbujas en el instrumento de HPLC. Finalmente, reemplace el reactivo DPPH con metanol y purgue la bomba adicional. Aquí se muestran dos cromatogramas de una muestra de café ristretto, derivatizada con un radical DPPH utilizando instrumentación PCD convencional y RF-PCD.Aquí se enumeran los límites calculados de cuantificación y detección para cada uno de los aminoácidos analizados en los modos RF-PCD y PCD convencional. Se muestra un cromatograma de los cuatro aminoácidos analizados mediante el método PCD convencional, el método RF-PCD y la corriente no derivatizada del método RF-PCD. Aquí se presenta una comparación de las señales obtenidas para los picos debidos a la glicina y la leucina utilizando ambos métodos, PCD convencional y RF-PCD.Se muestra aquí una comparación del ancho del pico del triptófano al analizarlo mediante el método convencional de PCD, el método de RF-PCD y la corriente no derivatizada del método de RF-PCD. Se separó, derivatizó y detectó una muestra de prueba de 21 componentes que contenía algunos componentes que presentan respuesta al esquema de derivatización y otros que no. La misma mezcla también se separó y detectó sin derivatizar para su comparación.Se muestra aquí una comparación de la forma del pico del p-cresol, tanto derivatizado mediante la columna RF-PCD como sin derivatizar. Una vez dominada, esta técnica puede configurarse en el mismo tiempo que un análisis de derivatización posterior a la columna convencional. Al realizar este procedimiento, es importante recordar mantenerse lo más cercano posible a las relaciones de flujo prescritas.Tras seguir este procedimiento, se pueden utilizar otros reactantes de derivatización posteriores a la columna, como OPA, ninhidrina o halógenos, con el fin de analizar otros compuestos. Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo configurar y ajustar una columna de reacción por flujo.

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