Análisis basado en Citometría Imaging- y flujo de Cell posición y el ciclo celular en 3D melanoma esferoides
28 de diciembre de 2015
Describimos dos métodos complementarios que utilizan el indicador de ciclo celular de ubiquitinación por fluorescencia (FUCCI) y el análisis de imágenes o citometría de flujo para identificar y aislar células en las regiones internas G1 detenidas y proliferantes externas de los esferoides 3D.
El objetivo general de este método es identificar, caracterizar y aislar células procedentes de un esteroide multicelular según su estado en el ciclo celular y su posición dentro del esteroide, en comparación con el cultivo celular en 2D. El modelo OID en 3D reproduce la biología del cáncer in vivo, ya que imita la arquitectura del tumor y su microambiente. Al combinar esferoides con citometría de flujo y técnicas de imagen, este método puede responder preguntas clave en el campo del cáncer, como cómo el microambiente tumoral altera la sensibilidad a fármacos, la motilidad celular y la proliferación.
La principal ventaja de este método es que permite la visualización en tiempo real del ciclo celular y posibilita la purificación de células vivas a partir de una región esteroide específica, demostrando que el procedimiento será realizado por A Sharp, un ayudante de investigación de nuestro laboratorio. Comience a prepararse para la formación esteroide tridimensional calentando en el microondas al 1,5 % de aros en 100 mililitros de solución salina balanceada de Hank o HBSS durante tres a cinco minutos, agitando intermitentemente el matraz para asegurar que el aros se disuelva completamente. A continuación, pipetee inmediatamente 100 microlitros de la solución de aros en cada pocillo de una placa de cultivo celular de 96 pocillos con fondo plano. Incube la placa a temperatura ambiente durante una hora para permitir que el aros se solidifique.
A continuación, retire un cultivo celular de células de melanoma que expresan los constructos FCI con una confluencia del 80 % del incubador de cultivo celular. Lave las células con 10 mililitros de HBSS. Añada 1,5 mililitros de 0,05 % en EDTA y luego incube las células a 37 grados Celsius durante aproximadamente dos minutos.
Una vez que las células se hayan desprendido, suspéndalas en 10 mililitros de medio de cultivo celular. Cuente manualmente las células utilizando un hemocitómetro y un microscopio invertido, y dilúyalas a 25.000 células por mililitro en medio de cultivo celular. Luego, pipete 200 microlitros de la suspensión celular para superponer cada pocillo de la placa de 96 pocillos.
Incube la placa a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante aproximadamente tres días para formar esferoides celulares. Tras la incubación, observe los esferoides en un microscopio invertido utilizando un objetivo Forex y un filtro de contraste de fase. Los esferoides deben aparecer como agregados celulares compactos y aproximadamente esféricos para preparar el esteroide celular para su seccionado e imagen.
Utilice una pipeta de un mililitro para transferirlos a un tubo falcón. A continuación, permita que el esteroide se sedimente en el fondo del tubo cónico. Luego, retire el medio por succión y fije los esferoides incubándolos en formalina tamponada al 10 % neutra durante al menos dos horas a temperatura ambiente.
SP puede entonces almacenarse en HBSS a cuatro grados Celsius durante varios días tras el corte e imagen de la célula. Abra el software de análisis de imágenes y seleccione la configuración solo de cuantificación. A continuación, cree una nueva biblioteca e importe el archivo de imagen confocal del esferoide arrastrando el archivo de datos en bruto a la biblioteca.
A continuación, vaya a la pestaña de mediciones para crear un protocolo de análisis de imágenes arrastrando y soltando comandos en el orden correcto dentro de la ventana de protocolo. Para encontrar objetos en el canal verde, arrastre y suelte el comando encontrar objetos desde la sección de búsqueda hacia la ventana de protocolo y seleccione el canal adecuado. Añada un comando de apertura ubicado bajo procesamiento y luego añada un comando separado de objetos en contacto para separar las células.
Finalmente, desde la sección de filtrado, agregue y excluya objetos según su tamaño. Instruya la exclusión de objetos menores a 50 micrómetros para eliminar objetos pequeños no celulares. A continuación, arrastre y suelte un nuevo comando de búsqueda de objetos en la ventana del protocolo.
Después de seguir los mismos pasos, seleccione el canal rojo y aplique todos los comandos subsiguientes. Una vez que se hayan encontrado los objetos, utilice los comandos ocultar canal o mostrar canal para asegurarse visualmente de que los objetos rojos y verdes correspondan a núcleos rojos y verdes. Si es necesario, haga clic en mediciones y luego en opciones de retroalimentación para modificar la apariencia de las máscaras de los objetos.
Ahora, para encontrar objetos amarillos que correspondan a células en fase S temprana, utilice el comando de intersección ubicado en la sección de combinación y seleccione intersectar objetos rojos con objetos verdes. Nuevamente, excluya los objetos según tamaño menor a 50 micrómetros. Para identificar células en fase G1, use el comando de sustracción ubicado en la sección de combinación y seleccione sustraer el objeto amarillo de los objetos rojos para encontrar únicamente objetos rojos.
De manera similar, reste los objetos amarillos de los objetos verdes para identificar exclusivamente los objetos verdes que se correlacionan con las células en fase SG dos y MPH para ambos, los objetos exclusivamente rojos y los objetos exclusivamente verdes. Elimine los objetos no celulares según sea necesario aplicando un comando de población de filtrado de la sección de filtrado con un factor de forma mayor que 0,25. Luego, encuentre el contorno del esferoide S.
Utilice un comando de búsqueda de objetos de la sección de búsqueda en el canal verde o rojo. Utilice un comando de cierre de la sección de procesamiento para unir las células individuales en un solo objeto. Luego, agregue un comando de rellenado de huecos en objetos para llenar los huecos en la esfera.
A continuación, utilice un filtro fino para eliminar el ruido del objeto Sphero. Termine de encontrar el contorno del esferoide seleccionando excluir objetos por tamaño para eliminar los objetos menores de 30.000 micrómetros. Una vez que todos los objetos hayan sido definidos, agregue medir distancias desde la sección correspondiente para determinar la distancia desde cada OID hasta el borde del contorno del esferoide S.
Realice esto en cada una de las poblaciones amarillas, exclusivamente rojas y exclusivamente verdes. Para visualizar las distancias mínimas desde la célula hasta el borde más cercano del esferoide S, abra la pestaña de mediciones y seleccione opciones de retroalimentación seguidas de relaciones. Luego, elija mostrar distancias.
Finalmente, guarde el protocolo para salvar los datos creados por el protocolo. Elija el elemento crear medición en la sección de medición. Luego, para interpretar los datos, seleccione el elemento de medición, vaya a la pestaña de análisis en la sección de medición y elija Analizar en el menú de análisis para contar las células encontradas a una determinada distancia del borde del esteroide.
Cree un filtro seleccionando filtro en la pestaña de análisis. Por ejemplo, muestre solo los datos donde la distancia desde el borde de la esfera sea menor a 100 micrones. Para exportar los datos brutos, seleccione exportar en la pestaña de archivo y luego guarde los datos como texto separado por comas o por tabulaciones.
Estos datos pueden abrirse en un programa de hoja de cálculo para su análisis posterior. Las esferas celulares generadas a partir de C 8 1 16 1. Células de melanoma humano que habían sido transducidas con el sistema Fuji se fijaron y seccionaron.
Se realizó la imagen confocal para AZA verde, que marca las células en la fase M de la SG2 del ciclo celular, y Berra naranja, que marca las células en la fase G1. Cuando se superponen estas imágenes, pueden observarse características clave, como un núcleo necrótico, tal como se esperaba. Las células rojas arrestadas en G1 predominan más cerca de este núcleo necrótico, mientras que las células proliferantes rojas y verdes aumentan de forma gradiente hacia el borde externo, donde el acceso al oxígeno y a los nutrientes es mayor.
Tras el análisis de imágenes semiautomatizado, se pueden definir las máscaras de células fucci y el contorno del esferoide S. Se utilizó software de imagen para cuantificar las células rojas y verdes en la región interna o externa del esferoide S. Este análisis mostró que las células detenidas en la fase G uno están enriquecidas en la región interna, mientras que las células proliferantes predominan más cerca del borde esteroideo.
Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en una a dos semanas, un período que incluye el cultivo del esteroide, la obtención de imágenes y el análisis. Tras seguir este procedimiento, las células pueden implantarse en una matriz de colágeno y luego visualizarse mediante microscopía de lapso de tiempo. Posteriormente, pueden someterse a análisis de proteínas o ARN, lo que puede ayudarnos a responder preguntas como si la posición dentro del esteroide y el acceso a oxígeno y nutrientes pueden alterar los fenotipos de las células cancerosas.
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Descripción general
Este artículo presenta dos métodos complementarios que utilizan el indicador fluorescente de ubiquitinación del ciclo celular (FUCCI) junto con análisis de imágenes y citometría de flujo. Estas técnicas están diseñadas para identificar y aislar células según su estado en el ciclo celular dentro de esferoides tridimensionales.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Biología celular
- Investigación del cáncer
- Cultivo celular tridimensional
Antecedentes
- Los esferoides 3D imitan la arquitectura y el microambiente tumorales.
- Comprender el estado del ciclo celular es crucial para la investigación del cáncer.
- Los cultivos tradicionales en 2D no representan con precisión las condiciones in vivo.
- La citometría de flujo y las técnicas de imagen mejoran las capacidades de análisis.
Objetivo del estudio
- Identificar y caracterizar células en diferentes fases del ciclo celular.
- Aislar poblaciones celulares específicas de esferoides tridimensionales.
- Investigar el impacto del microambiente tumoral en el comportamiento celular.
Métodos Utilizados
- Indicador de ciclo celular por ubiquitinación con fluorescencia (FUCCI) para visualización.
- Análisis de imágenes para evaluar el estado del ciclo celular.
- Citometría de flujo para aislamiento celular.
- Preparación de esferoides tridimensionales utilizando aros en placas de cultivo de tejidos.
Resultados principales
- Identificación exitosa de células internas arrestadas en G1 y células externas en proliferación.
- Visualización en tiempo real de la dinámica del ciclo celular lograda.
- Aislamiento de células vivas de regiones específicas de esferoides demostrado.
- Conocimientos sobre cómo el microambiente tumoral afecta la sensibilidad a fármacos y la proliferación.
Conclusiones
- Los métodos proporcionan un enfoque robusto para estudiar la biología del cáncer.
- El análisis en tiempo real mejora la comprensión del comportamiento celular en modelos tridimensionales.
- Estas técnicas pueden orientar estrategias terapéuticas en el tratamiento del cáncer.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Comprender la heterogeneidad espacial en esferoides tumorales permite reducir mecanicistamente los riesgos en la validación de dianas al vincular el estado del ciclo celular con señales del microambiente. Este enfoque respalda la confianza predictiva en modelos preclínicos mediante la cuantificación de gradientes de proliferación y nichos quiescentes relevantes para la penetración de fármacos y la resistencia. Informa la selección de carteras al identificar subpoblaciones con mayor probabilidad de impulsar la recurrencia o el escape terapéutico.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Examina hipótesis terapéuticas mediante la correlación del arresto en G1 y la proliferación con regiones del esferoide, aclarando las dependencias de las vías en zonas hipóxicas frente a zonas ricas en nutrientes.
- Valor operativo: Permite el aislamiento de células viables de zonas definidas para ensayos funcionales posteriores, reduciendo la ambigüedad mecanicista en estudios de interacción con el blanco.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados con lecturas cuantificables del ciclo celular para la selección de compuestos, asegurando la relevancia del ensayo en relación con la arquitectura tridimensional.
- Valor operativo: Estandariza las respuestas espaciales y fenotípicas mediante análisis de imágenes, mejorando la reproducibilidad entre campañas de cribado.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Se alinea con sistemas relevantes para la enfermedad al modelar gradientes de necrosis, quiescencia y proliferación observados in vivo.
- Valor operativo: Facilita decisiones de avance ajustadas al riesgo mediante la vinculación de fenotipos dependientes de la posición con factores de estrés microambientales.
Integración de la Línea de Proceso y Flujo de Trabajo
El método se integra en la biología del descubrimiento al permitir la comprobación de hipótesis sobre los efectos del microentorno en el ciclo celular, avanza hacia el cribado mediante ensayos estandarizados basados en esferoides y apoya la investigación traslacional mediante la alineación de biomarcadores con resolución espacial.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la correlación de la posición celular con las fases del ciclo celular para aclarar los mecanismos de respuesta a fármacos.
- Cribado: Proporciona disponibilidad para ensayos mediante relaciones cuantificables de células rojas/verdes en las regiones interna y externa de los esferoides, permitiendo el seguimiento de los efectos de compuestos.
- Análisis: Ofrece mediciones de la distancia desde el borde y máscaras específicas por fase como resultados cuantitativos para comparar condiciones.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica mediante la modelización de gradientes de oxígeno y nutrientes que influyen en los fenotipos de las células cancerosas.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para el seguimiento longitudinal de la viabilidad celular, la expresión génica o la respuesta a fármacos a través de múltiples generaciones de esferoides.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva mediante la resolución espacial de la proliferación y la quiescencia, reduciendo los falsos positivos en la validación de dianas.
- Valor operativo: Normalización y escalabilidad mediante análisis de imágenes semiautomatizado y aislamiento por citometría de flujo.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción del desarrollo al reducir los riesgos de las dianas basándose en la respuesta al microentorno.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo de compuestos que penetran en nichos quiescentes o que dirigen su acción a células en ciclo.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la transducción FUCCI, el cultivo de esferoides y la microscopía confocal.
- Depende de microscopía de fluorescencia y software de análisis de imágenes capaz de segmentación de canales y filtrado morfométrico.
- Necesita estandarización entre líneas celulares y condiciones de matriz para lograr una formación reproducible de esferoides.
- Implica consideraciones de adaptación al aplicarse a sistemas de co-cultivo de no melanoma o estromales.
- Se encuentra limitado por la profundidad de corte y la penetración de la señal en esferoides más grandes, lo que afecta la resolución de las regiones centrales.
