Análisis basado en Citometría Imaging- y flujo de Cell posición y el ciclo celular en 3D melanoma esferoides

El objetivo general de este método es identificar, caracterizar y aislar células de un esteroide multicelular con respecto a su estado del ciclo celular y su posición dentro del esteroide en comparación con el cultivo celular 2D. El modelo OID 3D recapitula la biología del cáncer in vivo, ya que imita la arquitectura del tumor y su microentorno mediante el emparejamiento de esferos con citometría de flujo y técnicas de imagen. Este método puede responder a preguntas clave en el campo del cáncer, como la forma en que el microambiente tumoral altera la sensibilidad a los fármacos, la motilidad celular y la proliferación.

La principal ventaja de este método es que permite la visualización en tiempo real del ciclo celular y permite la purificación de células vivas de una región específica de esteroides, lo que demuestra que el procedimiento se realizará Un agudo, un asistente de investigación de nuestro laboratorio Comience a prepararse para la formación de esteroides en 3D en el microondas 1.5%aros en 100 mililitros de la solución de sal de equilibrio de Hank o HBSS o de tres a cinco minutos agite intermitentemente el matraz para asegurarse de que que el aros se disuelve por completo. A continuación, pipetee inmediatamente 100 microlitros de la solución de aros en cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos de fondo plano. Incube la placa a temperatura ambiente durante una hora para permitir que los aros se solidifiquen.

A continuación, extraiga un cultivo celular de confluencia del 80% de células de melanoma que expresen las construcciones FCI de la incubadora de cultivo celular. Lavar las células con 10 mililitros de HBSS. Agregue 1,5 mililitros de 0,05% en EDTA y luego incube las células a 37 grados centígrados durante aproximadamente dos minutos.

Una vez que las células se hayan desprendido, suspenderlas en 10 mililitros de cultivo celular. Medio. Cuente manualmente las células utilizando un hemo, un citómetro y un microscopio invertido y dilúyalas a 25.000 células por mililitro en medio de cultivo celular. A continuación, pipetee 200 microlitros de la suspensión celular para superponer cada pocillo de la placa aros de 96 pocillos.

Incubar la placa a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante aproximadamente tres días para formar esferoides celulares. Después de la incubación, visualice los esferoides en un microscopio invertido utilizando un objetivo Forex y un filtro de contraste de fase. Los esferoides deben aparecer como agregados celulares compactos, más o menos esféricos, para preparar el esteroide celular para la sección y la obtención de imágenes.

Use una pipeta de un mililitro para moverlos a un tubo de halcón. Luego deje que el esteroide se asiente en la parte inferior del cónico. A continuación, retire la bisucción del medio y luego fije los esferoides incubándolos en formina tamponada neutra al 10% durante al menos dos horas a temperatura ambiente.

A continuación, la SP puede almacenarse en HBSS a cuatro grados centígrados durante varios días después de la sección y la obtención de imágenes de la célula. Abra el software de análisis de imágenes y elija la configuración de solo cuantificación. A continuación, cree una nueva biblioteca e importe el archivo de imagen confocal esferoide arrastrando el archivo de datos sin procesar a la biblioteca.

A continuación, vaya a la pestaña de mediciones para crear un protocolo de análisis de imágenes arrastrando y soltando comandos en el orden correcto en la ventana del protocolo. Para buscar objetos en el canal verde, arrastre y suelte el comando buscar objetos de la sección de búsqueda a la ventana de protocolo y seleccione el canal apropiado. Agregue un comando de apertura que se encuentre en procesamiento y, a continuación, agregue un comando de objetos táctiles independiente para separar las celdas.

Por último, desde la sección de filtrado, agregue y excluya objetos por tamaño. Comando para objetos de menos de 50 micrómetros para excluir objetos pequeños no celulares. A continuación, arrastre y suelte un nuevo comando de búsqueda de objetos en la ventana del protocolo.

Siguiendo los mismos pasos, seleccione el canal rojo y aplique todos los comandos posteriores. Una vez que se hayan encontrado los objetos, utilice los comandos ocultar canal o mostrar canal para asegurarse visualmente de que los objetos rojo y verde corresponden a los núcleos rojo y verde. Si es necesario, haga clic en las opciones de medidas y luego en las opciones de retroalimentación para modificar la apariencia de las máscaras de objeto.

Ahora, para encontrar objetos amarillos que correspondan a celdas de fase S tempranas, use el comando de intersección que se encuentra en la sección de combinación y elija intersecar objetos rojos con objetos verdes. De nuevo, excluya los objetos por tamaño inferior a 50 micrómetros. Para identificar las celdas G de una fase, use el comando de resta que se encuentra en la sección de combinación y elija restar objeto amarillo de objetos rojos para encontrar exclusivamente objetos rojos.

De manera similar, reste los objetos amarillos de los objetos verdes para identificar exclusivamente los objetos verdes que se correlacionan con las celdas de fase SG dos y MPH tanto para los objetos exclusivamente rojos como para los exclusivamente verdes. Elimine los objetos no celulares según sea necesario aplicando un comando de llenado de filtro de la sección de filtrado con un factor de forma superior a 0,25. A continuación, busca el contorno del esferoide S.

Usando un comando de búsqueda de objetos de la sección de búsqueda en el canal verde o rojo. Utilice un comando cerrado de la sección de procesamiento para unir las celdas individuales en un objeto. A continuación, añada un comando de relleno de agujeros en objetos para rellenar los agujeros de la esférica.

A continuación, utilice un filtro fino para eliminar el ruido del objeto Sphero. Termine de encontrar el contorno del esferoide eligiendo excluir objetos por tamaño para eliminar objetos de menos de 30.000 micrómetros. Una vez que se hayan definido todos los objetos, agregue distancias de medición desde la sección relacionada para determinar la distancia desde cada OID hasta el borde del contorno del esferoide S.

Hazlo en cada una de las poblaciones amarillas, exclusivamente rojas y exclusivamente verdes. Para visualizar las distancias mínimas desde la celda hasta el borde del esferoide S más cercano, abra la pestaña de mediciones y seleccione las opciones de retroalimentación seguidas de relaciones. A continuación, elija Mostrar distancias.

Por último, guarde el protocolo para guardar los datos creados por el protocolo. Elija el elemento de medición make en la sección de medición. Luego, para interpretar los datos, seleccione el elemento de medición, vaya a la pestaña de análisis en la sección de medición y elija Analizar en el menú de análisis para contar las celdas que se encuentran a una cierta distancia del borde del esteroide.

Cree un filtro seleccionando filtro en la pestaña de análisis. Por ejemplo, muestre solo los datos en los que la distancia desde el borde de la esfera sea inferior a 100 micras. Para exportar los datos sin procesar, seleccione exportar en la pestaña de archivo y, a continuación, guarde los datos como texto separado por comas o limitado por tabulaciones.

Estos datos pueden abrirse en un programa de hoja de cálculo para su posterior análisis. Espa de célula generada a partir de C 8 1 16 1. Las células de melanoma humano que habían sido transducidas con el sistema Fuji se fijaron y seccionaron.

Se realizaron imágenes confocales para AZA verde, que marca las células en la fase SG dos M del ciclo celular y naranja Berra, que marca las células en la fase G uno. Cuando estas imágenes se superponen, se pueden observar características clave como un núcleo necrótico como se esperaba. Las células rojas G una detenidas predominan más cerca de este núcleo necrótico, mientras que las células proliferantes rojas y verdes aumentan de manera gradiente hacia el borde exterior del esteroide o el acceso al oxígeno y los nutrientes es mayor.

Después del análisis semiautomatizado de la imagen, se pueden definir las máscaras celulares fucci y el contorno del esferoide S. Se utilizó un software de imagen para cuantificar las células rojas y verdes en la región interna o externa del esferoide S. Este análisis mostró que las células detenidas de fase G se enriquecen en la región interna, mientras que las células proliferantes predominan más cerca del borde del esteroide.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en una o dos semanas, un período de tiempo que incluye el crecimiento del esteroide, las imágenes y el análisis. Siguiendo este procedimiento, los rads se pueden implantar en la matriz de colágeno y luego obtener imágenes a través de un microscopio TimeLapse. Luego pueden ser sometidos a análisis de proteínas o ARN, y esto puede ayudarnos a responder preguntas como si la posición en el esteroide y el acceso al oxígeno y los nutrientes pueden alterar los fenotipos de las células cancerosas.