Name: Análisis basado en Citometría Imaging- y flujo de Cell posición y el ciclo celular en 3D melanoma esferoides (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Aprende a analizar el ciclo celular en esferoides 3D de melanoma mediante citometría de flujo e imagen con FUCCI. Este método permite identificar, caracterizar y aislar células según su posición y fase del ciclo celular en tiempo real.

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Agradecemos a la Sra. Danae Sharp y a la Sra. Sheena Daignault por su asistencia técnica. Agradecemos al Dr. Atsushi Miyawaki, RIKEN, Wako-city, Japón, por proporcionar las construcciones FUCCI, al Dr. Meenhard Herlyn y la Sra. Patricia Brafford, The Wistar Institute, Filadelfia, por proporcionar líneas celulares, al Centro de Imágenes y Citometría de Flujo en el Centenary Institute por su excelente apoyo técnico. Agradecemos al Sr. Chris Johnson y al Dr. Andrew Barlow por el soporte técnico del software Volocity. N.K.H. es becario Cameron del Instituto de Investigación del Melanoma y el Cáncer de Piel, Australia. K.A.B. es miembro del Instituto del Cáncer de Nueva Gales del Sur (13/ECF/1-39). W.W. es miembro del Instituto del Cáncer de Nueva Gales del Sur (11/CDF/3-39). Este trabajo fue financiado por las subvenciones de proyecto RG 09-08 y RG 13-06 (Consejo del Cáncer de Nueva Gales del Sur), 570778 y 1051996 (Esquema de investigación colaborativa sobre el cáncer impulsado por prioridades/Cancer Australia/Fundación Cure Cancer Australia), 08/RFG/1-27 (Instituto del Cáncer de Nueva Gales del Sur) y APP1003637 y APP1084893 (Consejo Nacional de Investigación Médica y de Salud).

1. FUCCI Transducción y Cultivo Celular <ol><li> FUCCI transducción <ol><li> Crear líneas celulares que expresan establemente el FUCCI construye mKO2-hCdt1 (30-120) y MAG-hGem (1-100) 15 utilizando lentivirus co-transducción de lo descrito previamente 7. Nota: El sistema FUCCI ya está disponible comercialmente. </li><li> Generar sub-clones con fluorescencia brillante por la clasificación de una sola célula. Ordenar células individuales positivas tanto para AG y KO (amarillo) por fluorescencia de células activadas por la clasificación en una placa de 96 pocillos como se describió previamente 7,16. </li></ol></li><li> Cultivo de células de melanoma <ol><li> Células de melanoma humano Cultura C8161 previamente descritos 7,17. </li></ol></li></ol> 2. Esferoide Formación 3D (como se describió previamente 3,9) <ol><li> Preparación de la placa de agarosa <ol><li> Disolver 1,5% de agarosa (o agar noble) en 100 ml de solución de Hank salina equilibrada (HBSS) o Buffere fosfatod salino (PBS) por ebullición en el microondas durante 3-5 min con agitación. Asegúrese de que la agarosa se haya disuelto completamente. </li><li> Inmediatamente prescindir de 100 l de la solución de agarosa por pocillo a una placa de 96 pocillos de cultivo de tejidos de fondo plano usando una pipeta multicanal. Nota: La agarosa puede solidificarse en la punta después de un corto período de tiempo, para superar este problema consejos deben ser cambiados entre las placas si toma más de una placa de agarosa. </li><li> Deja placa de 96 pocillos sobre una superficie plana para endurecer agarosa durante al menos 1 hr. </li></ol></li><li> Preparación de células y superposición en agarosa <ol><li> Cultivan las células a aproximadamente el 80% de confluencia en un matraz T75. Lavar con 10 ml de HBSS. </li><li> Separar las células usando 1,5 ml de 0,05% de tripsina / ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y resuspender en 10 ml de medio normal. </li><li> Contar las células utilizando un hemocitómetro 18 u otro método de conteo automatizado. </li><li> Resuspender las células a una concentración final de 25.000 células / ml en normaal medio. </li><li> Superposición de pozos de agarosa con 200 l de la suspensión de células para un número final de 5.000 células por pocillo. </li><li> Placas de retorno a la incubadora de cultivo celular (5% de CO 2 y 37 C) para formar esferoides más de aproximadamente 3 días. Nota: El tiempo necesario para formar un esferoide varía entre las diferentes líneas celulares. Algunas líneas de células no forman esferoides utilizando este método en absoluto. </li><li> Image morfología esferoidal con un microscopio invertido usando un objetivo 4X y un filtro de contraste de fase. Una línea celular que se forma con éxito esferoides se producen compactos, agregados de células más o menos esféricas, y no debe haber sólo un esferoide por pocillo. Nota: Opcional: Una vez esferoides se han formado, se pueden trasplantar en colágeno u otra matriz para su posterior análisis del crecimiento y la invasión 3,7,17. Para eliminar esferoides a partir de colágeno, se trata con 500 l de 2 mg / ml de colagenasa a 37 ° C hasta que el colágeno se disuelve suficiente para que el spheroids que vienen gratis en los medios de comunicación (aproximadamente 30 minutos). Retire con cuidado esferoides utilizando una pipeta de 1 ml. </li><li> Para seccionar / formación de imágenes esferoides FIX (ya sea aisladas a partir de colágeno o cultivados durante 3-5 días en agarosa) en 10% de formalina tamponada neutra (PRECAUCIÓN: La formalina se debe utilizar en una campana de humos) durante al menos 2 horas a temperatura ambiente (RT) , o durante la noche (O / N) a 4 ° C. Esferoides pueden ser almacenados en HBSS a 4 ° C durante varios días. </li></ol></li></ol> 3. esferoide Vibratome Seccionamiento <ol><li> Disolver 5 g de agarosa de bajo punto de fusión en 100 ml de HBSS en una botella de vidrio de 500 ml en un microondas. Utilice un ajuste fuego medio con turbulencia. PRECAUCIÓN: Mantenga la tapa suelta al hervir la solución para que la presión se puede liberar. Utilice guantes protectores resistentes al calor para protegerse las manos de quemaduras al manipular la botella de vidrio caliente. </li><li> Espere hasta que la agarosa se enfría un poco - por lo que la botella se puede tocar sin quemarse las manos. </li><li> Vierta approximamadamente 2 ml de agarosa en el fondo de una taza contador Coulter o molde plástico similar. Aspirar inmediatamente a un esferoide fijo (véase la sección 2.2.8) utilizando una pipeta de 1 ml en el menor volumen de líquido posible. Añadir esferoide a la agarosa. A pocos esferoides (hasta 10) se pueden añadir por taza. </li><li> Cubrir los esferoides con 2 ml más de agarosa. Haga esto rápidamente para evitar el endurecimiento de agarosa antes de añadir la segunda capa. </li><li> Permitir que la agarosa se endurezca a temperatura ambiente en la oscuridad durante al menos 3 h. En este punto copas pueden ser almacenados durante un corto tiempo a 4 ° C con 2-3 ml de HBSS cubrió para evitar la deshidratación. </li><li> Retire agarosa de la copa. Recorte la agarosa que contiene los esferoides de forma que encaje en el bloque de metal vibratome, y esferoides están cerca de la parte superior de la agarosa. Los esferoides pueden ser vistos como pequeños objetos blancos dentro de la agarosa. Super Glue la agarosa al bloque. </li><li> Llene el vibratome con agua destilada y montar el bloque en el vibratome. Ajuste elvibratome para cortar 100 micras secciones usando baja velocidad (ajuste 2) y alta vibración (ajuste 8). Ajuste el ángulo de la hoja de corte a 16 °. Gire vibratome encendido, encender la luz vibratome y cortar secciones de la parte superior de la agarosa hasta 100 micras secciones esferoide se cortan. Coloque secciones esferoide cortadas en HBSS en una placa de 24 pocillos. </li><li> Elija secciones centrales para el análisis de imágenes. Mount secciones en las diapositivas mediante la transferencia de la sección plana sobre el portaobjetos con unas pinzas. Llene un cilindro de la jeringa de 10 ml con grasa de vacío; añadir una línea fina de grasa de vacío alrededor de los bordes de la sección con el fin de impedir que los medios de montaje se escurra de los bordes de la diapositiva y ayudar a sellar la sección bajo el cubreobjetos. Cubra la sección con medio de montaje y un cubreobjetos. Selle los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas. Tienda desliza a 4 ° C antes de la imagen. </li></ol> 4. confocal de adquisición de imágenes <ol><li> Tome una imagen z-rebanada de una sección esferoide FUCCI medio usando un 10Xu objetivo 20X a lo descrito previamente 7. Asegúrese de que no se solapan o diafonía se produce entre el Kusabira Orange2 y Azami Verde. Si la comparación de análisis de imagen entre varias secciones esferoide, mantenga la potencia del láser y otros ajustes de la misma entre las muestras. </li></ol> 5. Hoechst tinte ensayo de difusión para el flujo de Clasificación <ol><li> Transferencia esferoides vivos (3-5 días después de la siembra de agarosa) a un tubo de 15 ml. Deje esferoides gravedad depositan en el fondo del tubo. Varios esferoides pueden teñirse por tubo. Se necesitan aproximadamente 20 esferoides para obtener el número de células suficientes para citometría de flujo. </li><li> Retire el exceso de medio y agregar 1 ml de 10 mM Hoechst diluidas en medio normal. Incubar esferoides a 37 ° C durante aproximadamente 1 hr. Utilice parpadeo suave para resuspender las esferoides una o dos veces durante la incubación. Nota: El tiempo de incubación puede variarse para alterar hasta qué punto el colorante Hoechst penetra en los esferoides. Esto puede variar en funciónel tamaño esferoide, la densidad y la línea celular. Para algunas grandes esferoides / densos puede haber una máxima penetración de tinte que es menor que 100%. </li><li> Lavar los esferoides suavemente con 5 ml de HBSS utilizando sedimentación por gravedad. <ol><li> Opcional: Para imágenes de penetración del colorante: Fix esferoides con 10% de formalina tamponada neutra por lo menos durante 2 horas a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C. Preparar vibratome secciones, montar en portaobjetos y la imagen en la confocal como se describe en los pasos 3 y 4 anteriores. </li></ol></li><li> Para preparar células para la citometría de flujo, trypsinize esferoides con 1 ml de 0,05% de tripsina / EDTA a 37 ° C durante aproximadamente 30 min con parpadeo cada 10 min para romper los esferoides aparte. Nota: esferoides son difíciles de conseguir en suspensión de células individuales, pueden necesitar ser optimizado condiciones. Viabilidad de C8161 4 días de edad esferoides después de este proceso es de aproximadamente 95%. </li><li> Células mancha con un vivo en el infrarrojo cercano / mancha muertos según el protocolo de los fabricantes. Lavar con HBSS luego fijar con 1ml de 10% de formalina tamponada neutra durante aproximadamente 30 min. Las células pueden ser almacenados en HBSS a 4 ° C durante varios días antes del análisis de flujo. </li></ol> 6. Citometría de Flujo Análisis de Hoechst manchadas Fucci esferoides <ol><li> Asegurar que las células no están agrupadas haciéndolas pasar a través de un colador celular. Resuspender el Hoechst manchada esferoides Fucci en hielo frío de lavado FACS (PBS con 5% suero de ternero fetal) a una concentración de 1-5 x 10 6 células / ml. Transferir 200 l de muestra de 5 ml a tubos de fondo redondo. </li><li> Preparar las siguientes muestras individuales de control de color según se describe en 6.1: las células del melanoma un-manchado; las células del melanoma adherentes se tiñeron con 10 M Hoechst durante 1 hora; Azami verde solamente expresan las células de melanoma; y Kusabira Naranja solamente expresan las células de melanoma. Nota: Los controles individuales de color pueden ser fijados en formalina y se almacenan en FACS lavar con 0,1% azida sódica a 4 ° C durante semanas o incluso meses. </li><li> Suspensiones de células individuales Ejecutar oflujo na citometría analizador con láseres adecuados y de un solo color / controles no teñidas como anteriormente descrito 7,16. </li><li> Utilice software de citometría comercial como FlowJo para analizar el interior frente a las células esferoides exteriores de la siguiente manera: <ol><li> Retire los residuos por gating en la población de células principal de luz dispersada hacia adelante (FSC) vs. Light Side Dispersos (SSC). </li><li> Retire dobletes por gating en células individuales utilizando FSC (Zona) vs. FSC (Altura) </li><li> Puerta de células vivas por gating en la población de bajos vivo / muerto. </li><li> Definir Hoechst pilas de gran, Recinto base a la señal positiva por parte de las células adherentes se tiñeron con Hoechst, como células &quot;exteriores&quot;. </li><li> Definir las células bajas o negativas Hoechst, cerradas en base a la señal del mando a un-manchado, como células &quot;internos&quot;. </li><li> Después de compuerta para las poblaciones interiores y exteriores, las células pueden urbanización cerrada más para el rojo FUCCI (G1), amarillo (a principios de S), verde (S / G2 / M) o negativo (a principios de G1). Nota: COMPENSACIÓN utilizando los controles de un solo color puede ser necesario para definir adecuadamente las poblaciones de color rojo, amarillo, verde y negativos Fucci. </li></ol></li><li> Una vez que el ensayo ha sido optimizado y validado a través de la penetración de Hoechst microscopía confocal, las células funcionar sin la colocación sobre un clasificador de células de flujo como se describió previamente 7,16 para su posterior análisis de las sub-poblaciones de células en vivo. </li></ol> Análisis 7. Imagen de FUCCI Esferoide Secciones <ol><li> Software por ejemplo, en Abrir. Volocity, elija la configuración SÓLO cuantificación. </li><li> Crear una nueva biblioteca. Importe el archivo de imagen confocal FUCCI esferoide en el software arrastrando el archivo de datos brutos de la confocal en la biblioteca. También puede utilizar el comando Archivo&gt; Importar. </li><li> Ve a la pestaña mediciones para construir un protocolo de análisis de imágenes. El Protocolo se construye arrastrando y soltando los comandos apropiados en el orden correcto de la siguiente en la ventana de protocolo. </li><li> Encuentra objeja en el canal verde: Arrastre el hallazgo de comandos (que se encuentra en &#39;Buscando&#39;) en la ventana del protocolo de objetos, seleccione el canal correcto en los objetos hallazgo protocol.Add un comando abierto (que se encuentra en el «tratamiento»), entonces A tocar objetos separados comando (que se encuentra en &#39;Procesamiento&#39; - esto separar las células). Excluir objetos por tamaño &lt;50 micras (que se encuentra en el &#39;filtrado&#39; - esto va a excluir a los pequeños objetos no celulares). Nota: Variables como el umbral de encontrar objetos, el número de iteraciones abiertos, el tamaño de los objetos a separar y el tamaño de los objetos para excluir debe ser optimizado manualmente hasta que las máscaras de objeto coincide con la imagen. </li><li> Encuentra objetos en el canal rojo: Repetir encontrar los objetos que el anterior para el canal rojo. Protocolos verdes y rojas pueden necesitar ser ajustados por separado. Nota: Debido a los núcleos estar en G2, núcleos verdes son a menudo ligeramente más grande. </li><li> Confirme objetos encontrados son exactos Confirmar rojo y objetos verdes coinciden con elnúcleos rojos y verdes en la imagen apagando y en los canales verde y rojo (con la piel o mostrar comandos canal) mientras muestra las máscaras rojas y verdes que se encuentran por el protocolo. Opciones de comentarios (Medidas&gt; Opciones de comentarios) se pueden utilizar para modificar el aspecto de las máscaras de objetos. </li><li> Encuentra objetos amarillos (células en fase S temprana): Para encontrar celdas amarillas, añadir una intersección rojo con células verdes de comandos (que se encuentra en &quot;Combinar&quot;). Excluir objetos por tamaño (&lt;50 micras, que se encuentran en &#39;filtrado&#39;) para excluir a los pequeños objetos no celulares. </li><li> Encuentra objetos exclusivamente rojos (células en fase G1): Para encontrar núcleos exclusivamente rojos, restar las celdas amarillas de los glóbulos rojos (que se encuentran en el &#39;Combinando&#39;). Excluir objetos por tamaño &lt;50 m, (que se encuentra en el &#39;filtrado&#39;) para eliminar cualquier objeto pequeño no celulares creadas. </li><li> Encuentra objetos exclusivamente verdes (células en fase S / G2 / M): Repita el procedimiento para el canal verde para encontrar exclusivamente verde. Note: Si todavía hay objetos no celulares restantes, un comando población filtro puede ser añadido a los protocolos de rojo, verde o exclusivos exclusivos (que se encuentran en &#39;Filtrado&#39;) para retener sólo los objetos con un factor de forma mayor que 0,25. Esto eliminará los objetos no circulares. </li><li> Encuentra el contorno esferoide: Encuentra el contorno esferoide utilizando un hallazgo de comandos (que se encuentra en &#39;Buscando&#39;) con el canal verde o rojo (el que tiene más células alrededor del borde del esferoide) objetos. Un umbral mucho más bajo (que se encuentra en el hallazgo de objetos de variables) tendrá que ser utilizado para determinar el contorno esferoide comparación con las células individuales. <ol><li> Utilice un comando cerca de unirse a objetos (que se encuentran en «tratamiento»), luego rellenar agujeros en objetos (que se encuentran en «tratamiento»), a continuación, utilizar un filtro fino (que se encuentra en el &#39;filtrado&#39;) para eliminar el ruido de los objetos. Finalmente, excluir objetos por tamaño para eliminar los objetos más pequeños &lt;30,000 m (dependiendo del tamaño esferoide). Nota: Tendrá que ser optimizado manualmente hasta que el contorno esferoide es exacta Este protocolo. Una imagen de campo claro también se puede utilizar - sin embargo esto es generalmente menos preciso con una sección esferoide, y un comando invertido (que se encuentra en &#39;combinación&#39;) tendrá que ser utilizado. </li></ol></li><li> Mida las distancias de los núcleos de contorno esferoide: Medir distancias (que se encuentra en &#39;relativa&#39;) de las poblaciones de color amarillo, verde y exclusivamente exclusivamente rojos desde el centroide celular hasta el borde del esferoide outline.To visualizar las distancias mínimas, que debe ser de la celular al borde esferoide más cercano, encender muestran distancias en la pestaña de relaciones en las opciones de retroalimentación (Medidas&gt; Opciones&gt; Relaciones de votos). </li><li> Guarde el protocolo. Este protocolo se puede volver a aplicar a otras imágenes mediante las mediciones&gt; Restaurar comando de protocolo. </li><li> Crear un elemento de medición (Medidas&gt; Crear Medición de artículos). Los datos pueden ser analizados mediante el análisisfunciones. <ol><li> Ir a la ficha de análisis en el tema mediciones. Ir al menú Analysis (Análisis&gt; Analizar) y analizar la distancia mínima desde el centroide celular (rojo, verde o amarillo) al borde esferoide, resumida por el conde y organizada por la población. </li><li> Para contar el número de células que se encuentran a una cierta distancia desde el borde crear un filtro (Análisis&gt; Filter). El filtro para la distancia mínima en la Figura 2 se basa en la penetración de Hoechst (por ejemplo, la distancia mínima es de menos de 80 da la población &quot;externa&quot;). Por otra parte, la exportación de datos en bruto a una hoja de cálculo para su posterior análisis. </li></ol></li></ol>

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<li>Durand, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Hoechst+33342+for+cell+selection+from+multicell+systems%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Use of Hoechst 33342 for cell selection from multicell systems.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 30, 117-122 (1982).</li>
<li>Laurent, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroid+models+to+explore+cell+cycle+checkpoints+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+cancer%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroid models to explore cell cycle checkpoints in 3D.</a> BMC cancer. 13, 73(2013).</li>
<li>LaRue, K. E., Khalil, M., Freyer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulation+of+proliferation+in+multicellular+spheroids+is+mediated+through+differential+expression+of+cyclin-dependent+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulation of proliferation in multicellular spheroids is mediated through differential expression of cyclin-dependent kinase inhibitors.</a> Cancer research. 64, 1621-1631 (2004).</li>
<li>Kyle, A. H., Huxham, L. A., Baker, J. H., Burston, H. E., Minchinton, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+distribution+of+bromodeoxyuridine-labeled+cells+is+strongly+dose+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Tumor distribution of bromodeoxyuridine-labeled cells is strongly dose dependent.</a> Cancer research. 63, 5707-5711 (2003).</li>
<li>Minchinton, A. I., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+penetration+in+solid+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Drug penetration in solid tumours.</a> Nature reviews. Cancer. 6, 583-592 (2006).</li>
<li>Giesbrecht, J. L., Wilson, W. R., Hill, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiobiological+studies+of+cells+in+multicellular+spheroids+using+a+sequential+trypsinization+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+research%22%5BJournal%5D)">Radiobiological studies of cells in multicellular spheroids using a sequential trypsinization technique.</a> Radiation research. 86, 368-386 (1981).</li>
</ol>

PerkinElmer contribuyó a los costos de publicación.

Análisis de imágenes semi-automatizado identifica la región G1 arrestado interior esferoide, y la proliferación de las capas exteriores. Este método puede ser utilizado en esferoides en vivo usando una sección óptica, o en secciones esferoide fijos, para identificar los cambios en no sólo el ciclo celular, pero la expresión del marcador (a través de inmunofluorescencia), la muerte celular, o la morfología celular en estas diferentes regiones. Motilidad celular dentro de las diferentes regiones esferoide también puede se...

Esferoides multicelulares 3D se han conocido como un modelo de tumor durante décadas, sin embargo, es sólo recientemente que han llegado a ser de uso más común a medida un modelo in vitro para muchos cánceres sólidos. Ellos se utilizan cada vez en las pantallas de descubrimiento de fármacos de alto rendimiento como un intermediario entre el complejo, costoso y lento en modelos in vivo y el simple, el modelo de monocapa 2D bajo coste 6.1. Los estudios realizados en la cultura 2D a menudo no pueden ser replicados en vivo. Modelos Esferoide de muchos tipos de cáncer son capaces de imitar las características de crecimiento, sensibilidad a los fármacos, la penetración del fármaco, las interacciones célula-célula, la disponibilidad restringida de oxígeno y nutrientes y el desarrollo de la necrosis que se observa in vivo en tumores sólidos 6-11. Esferoides desarrollan un núcleo necrótico, una región de reposo detenido o G1 que rodea el núcleo, y las células que proliferan en la periferia del esferoide 7. El desarrollo de estas regionespuede variar dependiendo de la densidad celular, la tasa de proliferación y el tamaño del esferoide 12. Se ha planteado la hipótesis de que la heterogeneidad celular visto en estos diferentes sub-regiones puede contribuir a la resistencia a la terapia del cáncer 13,14. Por lo tanto la capacidad de analizar las células en estas regiones por separado es crucial para las respuestas de drogas comprensión tumorales. El sistema indicador de ciclo celular ubiquitinación de fluorescencia (FUCCI) se basa en el rojo (Kusabira Orange - KO) y verde (verde Azami - AG) marcación fluorescente de Cdt1 y geminin, que se degrada en diferentes fases del ciclo celular 15. Así núcleos celulares aparecen rojos en G1, amarillo a principios de S y verde en S / G2 / M fase. Se describe aquí dos métodos complementarios tanto usando FUCCI para identificar el ciclo celular, junto con el uso de software de formación de imágenes o un flujo de difusión de colorante ensayo de citometría para determinar si las células residen en el centro G1 detenida o el exterior proliferating anillo, y la distancia de las células individuales desde el borde del esferoide. Estos métodos se desarrollaron en nuestra publicación anterior, en el que demostraron que las células de melanoma en regiones hipóxicas en el centro del esferoide o / y en presencia de terapias dirigidas son capaces de permanecer en arresto G1 durante largos períodos de tiempo, y pueden re- entrar en el ciclo celular cuando se presentan condiciones más favorables 7.

<table><tbody><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>agarosa de bajo punto de fusión</td><td>Life Technologies</td><td>16520-050</td><td>Para el corte de</td></tr><tr><td>agar noble&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A5431</td><td>Para la fabricación de esferoides</td></tr><tr><td>agarosa para esferoides</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1356-100</td><td>Para la fabricación de esferoides</td></tr><tr><td>0,05% tripsina/EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14175-103</td><td></td></tr><tr><td>10% formalina</td><td>Sigma</td><td>HT5014-1CS</td><td>PRECAUCIÓN: Nocivo, corrosivo. Utilice equipo de protección personal, haga &nbsp; no respira humos (abierto en un armario de gases).</td></tr><tr><td>vivos/muertos cerca de IR</td><td>Life Technologies</td><td>L10119</td><td></td></tr><tr><td>vibratome</td> Technical <td>Products International, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>taza de coulture</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>SIE936</td><td>Molde para seccionar esferoides</td></tr><tr><td>hemocitómetro</td><td>Sigma Z359629</td><td></td><td></td></tr><tr><td>placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos</td><td>Invitro</td><td>FAL353072</td><td></td></tr><tr><td>colagenasa</td><td>Sigma</td><td>C5138&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>microscopio confocal</td><td>Leica</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>Analizador de citómetro de flujo</td><td>Becton Dickinson</td><td>LSRFortessa</td><td></td></tr><tr><td>volocity</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Software de imagen</td></tr><tr><td>flowjo</td><td>Tree Star</td><td></td><td>Software de citometría Flow</td></tr><tr><td>Grasa de vacío</td><td>Sigma</td><td>Z273554</td><td></td></tr><tr><td>Medios de montaje</td><td>Vector Laboratorios</td><td>H1000</td><td></td></tr><tr><td>FUCCI (construcciones comerciales)</td><td>Life Technologies</td><td>P36238</td><td>Solo transfección transitoria</td></tr><tr><td>Filtro de células 70 &#956; m</td><td>In Vitro</td><td>FAL352350</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de fondo redondo de 5 ml (estériles)</td><td>In Vitro</td><td>FAL352003</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de fondo redondo de 5 ml (no estériles)</td><td>In Vitro</td><td>FAL352008</td><td></td></tr></tbody></table>

análisis basado en citometría imaging- y flujo de cell posición y el ciclo celular en 3d melanoma esferoides

Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

< clase p='jove_content'>Los esferoides tumorales tridimensionales (3D) se utilizan en la investigación del cáncer como un modelo más preciso del microambiente tumoral in vivo, en comparación con el cultivo celular bidimensional (2D) tradicional. El modelo esferoide es capaz de imitar los efectos de la interacción célula-célula, la hipoxia y la privación de nutrientes, y la penetración de fármacos. Una característica de este modelo es el desarrollo de un núcleo necrótico, rodeado por un anillo de células detenidas G1, con células proliferantes en las capas externas del esferoide. De interés en el campo del cáncer es cómo las diferentes regiones del esferoide responden a las terapias farmacológicas, así como a la manipulación genética o ambiental. Describimos aquí el uso del sistema indicador de ciclo celular de ubiquitinación por fluorescencia (FUCCI) junto con la citometría y el análisis de imágenes utilizando software comercial para caracterizar el estado del ciclo celular de las células con respecto a su posición dentro de los esferoides de melanoma. Estos métodos se pueden utilizar para rastrear los cambios en el estado del ciclo celular, la expresión de genes/proteínas o la viabilidad celular en diferentes subregiones de esferoides tumorales a lo largo del tiempo y en diferentes condiciones.

Hay varios métodos de producción de esferoides tumorales, este protocolo utiliza el método de crecimiento no adherente, donde las células se cultivan en agar o agarosa 3,7,9. La figura 1 muestra un ejemplo de un esferoide melanoma C8161 después de 3 días en agar. Esferoides C8161 forman esferoides de tamaño regular con un diámetro de 500 a 600 m (media = 565, SD = 19, n = 3) después de 3 días. Otras líneas celulares de melanoma que formarán esferoides incluyen: WM793, WM983C, WM983B, WM164, 1...

Describimos dos métodos complementarios que utilizan el indicador de ciclo celular de ubiquitinación por fluorescencia (FUCCI) y el análisis de imágenes o citometría de flujo para identificar y aislar células en las regiones internas G1 detenidas y proliferantes externas de los esferoides 3D.

Análisis basado en Citometría Imaging- y flujo de Cell posición y el ciclo celular en 3D melanoma esferoides

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

El objetivo general de este método es identificar, caracterizar y aislar células procedentes de un esteroide multicelular según su estado en el ciclo celular y su posición dentro del esteroide, en comparación con el cultivo celular en 2D. El modelo OID en 3D reproduce la biología del cáncer in vivo, ya que imita la arquitectura del tumor y su microambiente. Al combinar esferoides con citometría de flujo y técnicas de imagen, este método puede responder preguntas clave en el campo del cáncer, como cómo el microambiente tumoral altera la sensibilidad a fármacos, la motilidad celular y la proliferación.La principal ventaja de este método es que permite la visualización en tiempo real del ciclo celular y posibilita la purificación de células vivas a partir de una región esteroide específica, demostrando que el procedimiento será realizado por A Sharp, un ayudante de investigación de nuestro laboratorio. Comience a prepararse para la formación esteroide tridimensional calentando en el microondas al 1,5 % de aros en 100 mililitros de solución salina balanceada de Hank o HBSS durante tres a cinco minutos, agitando intermitentemente el matraz para asegurar que el aros se disuelva completamente. A continuación, pipetee inmediatamente 100 microlitros de la solución de aros en cada pocillo de una placa de cultivo celular de 96 pocillos con fondo plano. Incube la placa a temperatura ambiente durante una hora para permitir que el aros se solidifique.A continuación, retire un cultivo celular de células de melanoma que expresan los constructos FCI con una confluencia del 80 % del incubador de cultivo celular. Lave las células con 10 mililitros de HBSS. Añada 1,5 mililitros de 0,05 % en EDTA y luego incube las células a 37 grados Celsius durante aproximadamente dos minutos.Una vez que las células se hayan desprendido, suspéndalas en 10 mililitros de medio de cultivo celular. Cuente manualmente las células utilizando un hemocitómetro y un microscopio invertido, y dilúyalas a 25.000 células por mililitro en medio de cultivo celular. Luego, pipete 200 microlitros de la suspensión celular para superponer cada pocillo de la placa de 96 pocillos.Incube la placa a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante aproximadamente tres días para formar esferoides celulares. Tras la incubación, observe los esferoides en un microscopio invertido utilizando un objetivo Forex y un filtro de contraste de fase. Los esferoides deben aparecer como agregados celulares compactos y aproximadamente esféricos para preparar el esteroide celular para su seccionado e imagen.Utilice una pipeta de un mililitro para transferirlos a un tubo falcón. A continuación, permita que el esteroide se sedimente en el fondo del tubo cónico. Luego, retire el medio por succión y fije los esferoides incubándolos en formalina tamponada al 10 % neutra durante al menos dos horas a temperatura ambiente.SP puede entonces almacenarse en HBSS a cuatro grados Celsius durante varios días tras el corte e imagen de la célula. Abra el software de análisis de imágenes y seleccione la configuración solo de cuantificación. A continuación, cree una nueva biblioteca e importe el archivo de imagen confocal del esferoide arrastrando el archivo de datos en bruto a la biblioteca.A continuación, vaya a la pestaña de mediciones para crear un protocolo de análisis de imágenes arrastrando y soltando comandos en el orden correcto dentro de la ventana de protocolo. Para encontrar objetos en el canal verde, arrastre y suelte el comando encontrar objetos desde la sección de búsqueda hacia la ventana de protocolo y seleccione el canal adecuado. Añada un comando de apertura ubicado bajo procesamiento y luego añada un comando separado de objetos en contacto para separar las células.Finalmente, desde la sección de filtrado, agregue y excluya objetos según su tamaño. Instruya la exclusión de objetos menores a 50 micrómetros para eliminar objetos pequeños no celulares. A continuación, arrastre y suelte un nuevo comando de búsqueda de objetos en la ventana del protocolo.Después de seguir los mismos pasos, seleccione el canal rojo y aplique todos los comandos subsiguientes. Una vez que se hayan encontrado los objetos, utilice los comandos ocultar canal o mostrar canal para asegurarse visualmente de que los objetos rojos y verdes correspondan a núcleos rojos y verdes. Si es necesario, haga clic en mediciones y luego en opciones de retroalimentación para modificar la apariencia de las máscaras de los objetos.Ahora, para encontrar objetos amarillos que correspondan a células en fase S temprana, utilice el comando de intersección ubicado en la sección de combinación y seleccione intersectar objetos rojos con objetos verdes. Nuevamente, excluya los objetos según tamaño menor a 50 micrómetros. Para identificar células en fase G1, use el comando de sustracción ubicado en la sección de combinación y seleccione sustraer el objeto amarillo de los objetos rojos para encontrar únicamente objetos rojos.De manera similar, reste los objetos amarillos de los objetos verdes para identificar exclusivamente los objetos verdes que se correlacionan con las células en fase SG dos y MPH para ambos, los objetos exclusivamente rojos y los objetos exclusivamente verdes. Elimine los objetos no celulares según sea necesario aplicando un comando de población de filtrado de la sección de filtrado con un factor de forma mayor que 0,25. Luego, encuentre el contorno del esferoide S.Utilice un comando de búsqueda de objetos de la sección de búsqueda en el canal verde o rojo. Utilice un comando de cierre de la sección de procesamiento para unir las células individuales en un solo objeto. Luego, agregue un comando de rellenado de huecos en objetos para llenar los huecos en la esfera.A continuación, utilice un filtro fino para eliminar el ruido del objeto Sphero. Termine de encontrar el contorno del esferoide seleccionando excluir objetos por tamaño para eliminar los objetos menores de 30.000 micrómetros. Una vez que todos los objetos hayan sido definidos, agregue medir distancias desde la sección correspondiente para determinar la distancia desde cada OID hasta el borde del contorno del esferoide S.Realice esto en cada una de las poblaciones amarillas, exclusivamente rojas y exclusivamente verdes. Para visualizar las distancias mínimas desde la célula hasta el borde más cercano del esferoide S, abra la pestaña de mediciones y seleccione opciones de retroalimentación seguidas de relaciones. Luego, elija mostrar distancias.Finalmente, guarde el protocolo para salvar los datos creados por el protocolo. Elija el elemento crear medición en la sección de medición. Luego, para interpretar los datos, seleccione el elemento de medición, vaya a la pestaña de análisis en la sección de medición y elija Analizar en el menú de análisis para contar las células encontradas a una determinada distancia del borde del esteroide.Cree un filtro seleccionando filtro en la pestaña de análisis. Por ejemplo, muestre solo los datos donde la distancia desde el borde de la esfera sea menor a 100 micrones. Para exportar los datos brutos, seleccione exportar en la pestaña de archivo y luego guarde los datos como texto separado por comas o por tabulaciones.Estos datos pueden abrirse en un programa de hoja de cálculo para su análisis posterior. Las esferas celulares generadas a partir de C 8 1 16 1. Células de melanoma humano que habían sido transducidas con el sistema Fuji se fijaron y seccionaron.Se realizó la imagen confocal para AZA verde, que marca las células en la fase M de la SG2 del ciclo celular, y Berra naranja, que marca las células en la fase G1. Cuando se superponen estas imágenes, pueden observarse características clave, como un núcleo necrótico, tal como se esperaba. Las células rojas arrestadas en G1 predominan más cerca de este núcleo necrótico, mientras que las células proliferantes rojas y verdes aumentan de forma gradiente hacia el borde externo, donde el acceso al oxígeno y a los nutrientes es mayor.Tras el análisis de imágenes semiautomatizado, se pueden definir las máscaras de células fucci y el contorno del esferoide S. Se utilizó software de imagen para cuantificar las células rojas y verdes en la región interna o externa del esferoide S. Este análisis mostró que las células detenidas en la fase G uno están enriquecidas en la región interna, mientras que las células proliferantes predominan más cerca del borde esteroideo.Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en una a dos semanas, un período que incluye el cultivo del esteroide, la obtención de imágenes y el análisis. Tras seguir este procedimiento, las células pueden implantarse en una matriz de colágeno y luego visualizarse mediante microscopía de lapso de tiempo. Posteriormente, pueden someterse a análisis de proteínas o ARN, lo que puede ayudarnos a responder preguntas como si la posición dentro del esteroide y el acceso a oxígeno y nutrientes pueden alterar los fenotipos de las células cancerosas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

La invasión de los tejidos normales circundantes es una característica definitoria de los tumores malignos. Proporcionamos aquí un ensayo de microplaca simple y semiautomatizado de invasión en una biomatriz 3D natural que se ha ejemplificado con una serie de modelos de cánceres humanos avanzados.

Tumor Ensayo tridimensional (3D) esferoide Invasion

Aquí, presentamos un protocolo para generar un modelo 3D organotypic melanoma esferoide piel que recapitula la arquitectura y complejidad multicelular de un órgano, tumor en vivo pero al mismo tiempo acomoda sistemático experimental intervención.

Un modelo de piel Organotypic Melanoma 3D esferoide

Tomografía de coherencia óptica (OCT), una tecnología de imagen tridimensional, fue utilizada para monitorear y caracterizar la cinética de crecimiento de esferoides multicelulares tumor. Cuantificación volumétrica precisa de esferoides tumorales usando un voxel contando el enfoque y la detección de tejido libre de etiqueta muerto en esferoides basado en contraste intrínseco atenuación óptica, fueron demostrados.

Longitudinal control morfológico y fisiológico de esferoides tumorales tridimensional mediante tomografía de coherencia óptica

Este protocolo describe la generación de esferoides derivados del paciente, y el análisis posterior, incluyendo la cuantificación de la proliferación, las pruebas de citotoxicidad, la citometría de flujo, la tinción de inmunofluorescencia y la toma de imágenes confocales, con el fin de evaluar la droga potencial de los candidatos como terapias antineoplásicas. Este protocolo apoya la medicina de precisión con la identificación de medicamentos específicos para cada paciente y etapa de la...

Paisidio Paciente Derivado Esferoides 3D para la detección de drogas antineoplásicas para apuntar a las células madre del cáncer

Aquí, presentamos varios métodos simples para evaluar la viabilidad y la muerte en esferoides de células cancerosas 3D, que imitan los gradientes fisicoquímicos de los tumores in vivo mucho mejor que el cultivo 2D. El modelo esferoide, por lo tanto, permite evaluar la eficacia del fármaco oncológico con una mejor traducción a condiciones in vivo.

Evaluación de la viabilidad celular y la muerte en cultivos esferoides 3D de células cancerosas

El objetivo de este protocolo es establecer un modelo 3D in vitro para estudiar la diferenciación de los fibroblastos asociados al cáncer (CAC) en un entorno tumoral a granel, que puede abordarse en diferentes sistemas de análisis, como la inmunofluorescencia, la transcripción análisis e imágenes de células salvavidas.

Un modelo de esferoides 3D como un sistema más fisiológico para la diferenciación de fibroblastos asociados al cáncer y estudios de invasión in Vitro

Se establece un novedoso modelo de esferoides tridimensional basado en la interacción heterotípica de células tumorales y fibroblastos estromales. Aquí, presentamos cocultivo de células tumorales y fibroblastos estromales, imágenes de lapso de tiempo y microscopía confocal para visualizar la formación de esferoides. Este modelo tridimensional ofrece una plataforma pertinente para estudiar las interacciones tumor-stroma y probar las terapias contra el cáncer.

Un novedoso modelo de esferoides de tumor 3D modulado por fibroblastos para el estudio de la interacción tumor-Stroma y el descubrimiento de fármacos

Aquí, describimos un ensayo de invasión fácil de usar para el glioblastoma. Este ensayo es adecuado para células similares al glioblastoma similares a un tallo. También se describe una macro de Fiji para cuantificar fácilmente la invasión, la migración y la proliferación.

Un modelo de esferoides 3D para Glioblastoma

Aquí se presenta un protocolo para la fabricación de un dispositivo de imágenes esferoides. Este dispositivo permite imágenes dinámicas o longitudinales de fluorescencia de esferoides de células cancerosas. El protocolo también ofrece un procedimiento simple de procesamiento de imágenes para el análisis de la invasión de células cancerosas.

Imágenes y análisis de fluorescencia resueltos en el tiempo de la invasión de células cancerosas en el modelo esferoide 3D

Los esferoides tumorales se utilizan cada vez más para evaluar las interacciones entre células tumorales y microambientes y la respuesta a la terapia. El presente protocolo describe un método robusto pero simple para imágenes de semi-alto rendimiento de esferoides tumorales 3D utilizando una limpieza óptica rápida.

Limpieza óptica rápida para el análisis de semi-alto rendimiento de esferoides tumorales

Aquí, presentamos un protocolo para investigar la interacción de macrófagos primarios derivados de monocitos humanos con un esferoide tumoral en una matriz tridimensional (3D) de colágeno I, con la posibilidad de comparar el impacto de las propiedades solubles y físicas del microambiente en la invasión celular.

Ensayo de coinvasión de esferoides macrófagos y tumores

Aprende a analizar el ciclo celular en esferoides 3D de melanoma mediante citometría de flujo e imagen con FUCCI. Este método permite identificar, caracterizar y aislar células según su posición y fase del ciclo celular en tiempo real.

Análisis basado en Citometría Imaging- y flujo de Cell posición y el ciclo celular en 3D melanoma esferoides

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