Imágenes y análisis de fluorescencia resueltos en el tiempo de la invasión de células cancerosas en el modelo esferoide 3D

Este protocolo se puede utilizar para estudiar los mecanismos que rigen la invasión de las células cancerosas en la matriz extracelular en tiempo real. La principal ventaja de esta técnica es que utiliza un simple dispositivo de imágenes esferoides, lo que hace que el ensayo de invasión esferoide sea más fácil de configurar y mejora su eficiencia y costo. Si bien demostramos el uso del ensayo de invasión esferoide para modelar el carcinoma mamario, este ensayo es un excelente modelo para la invasión de cualquier tumor sólido en el tejido sano circundante.

Después de la impresión 3D del espaciador, pondere una relación de 10:1 de polímero base a enlazador cruzado en una taza de plástico y utilice una pipeta desechable para mezclar a fondo la solución PDMS resultante en la taza. Coloque la taza en una cámara de vacío y suelte rápidamente la presión de vacío para eliminar cualquier aire atrapado en la superficie de la mezcla y disipar las burbujas de aire restantes. Incubar el espaciador impreso en 3D a 100 grados Celsius durante cinco minutos para aumentar su flexibilidad y limpiar dos placas de vidrio con 100% isopropanol.

Coloque el espaciador de modo que esté al ras entre las dos placas limpiadas y coloque dos clips de aglutinante grandes en el borde inferior y uno en la esquina superior para sellar el molde en los bordes exteriores de las placas. Inspeccione la parte superior del molde para asegurarse de que el espaciador esté al ras con las placas de vidrio y utilice una pipeta desechable con aproximadamente dos centímetros cortados de la punta para añadir lenta pero continuamente la mezcla PDMS a la esquina superior izquierda del molde. Cuando se haya llenado todo el molde, coloque el molde en la cámara de vacío para eliminar las burbujas de aire que se hayan formado, antes de curar el PDMS durante una hora a 100 grados Centígrados.

Al final de la incubación, coloque el molde a temperatura ambiente. Cuando esté fresco al tacto, retire los clips de aglutinante y las placas de vidrio del espaciador que contiene el PDMS curado y utilice una cuchilla de afeitar para cortar a través del sello que se creó en los cuatro lados del molde entre el espaciador y la placa de vidrio. Tire del molde para revelar la hoja PDMS en el espaciador y utilice pinzas para pelar cuidadosamente la hoja PDMS del espaciador.

Coloque la hoja en una alfombra de corte y utilice un punzón de biopsia para perforar un disco PDMS de 17,5 milímetros de diámetro, luego perforar tres agujeros de 5,5 milímetros distribuidos uniformemente en el disco. Utilice cinta adhesiva para eliminar las partículas de polvo de cada plaquita y pegue las plaquitas limpias en un trozo de cinta a doble cara. Envuelva la cinta alrededor de la tapa de una placa Petri de 10 centímetros y coloque la tapa en una máquina de plasma junto con platos inferiores de vidrio abiertos de 35 milímetros.

Active las plaquitas y el vidrio con un minuto de tratamiento plasmático a 300 mililitros y utilice pinzas para fijar rápidamente el lado tratado de cada plaquita a la parte de vidrio de un plato inferior de vidrio tratado por plaquita. Cuando se hayan aplicado todas las plaquitas, utilice el dedo del puntero y el pulgar para aplicar presión uniforme a cada plaquita mientras gira el plato para fijar de forma segura los insertos a los platos. Cuando todas las plaquitas hayan sido aseguradas, incuba los dispositivos de imágenes esferoides resultantes durante 20 minutos a 60 grados Celsius, antes de realizar una segunda ronda de tratamiento plasmático como se demostró.

Después del segundo tratamiento, agregue 35 microlitros de solución de recubrimiento recién preparada a cada orificio de plaquita. Después de una hora a temperatura ambiente, retire la solución de recubrimiento y enjuague el dispositivo tres veces con agua destilada. Después del último lavado, agregue 35 microlitros de solución de enlace cruzado a cada orificio para una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente.

Al final de la incubación, enjuague el dispositivo tres veces con agua destilada como se ha demostrado, antes de llenar cada dispositivo con 70% de etanol para una incubación de 30 minutos bajo luz UV. Al final de la esterilización, enjuague los dispositivos tres veces con agua destilada y agregue 2,5 mililitros de solución de almacenamiento a cada dispositivo. Para incrustar los esferoides en colágeno, lave los dispositivos tres veces con tres mililitros de PBS por lavado.

Después del último lavado, deje que los dispositivos se sequen por completo, antes de agregar un esferoide en 30 microlitros de solución universitaria recién preparada en un agujero de la plaquita y comenzar un temporizador. Después de confirmar la presencia del esferoide en el agujero, agregue esferoides a los otros dos agujeros como se ha demostrado. Utilice una punta de pipeta de 10 microlitros para más reciente cualquier esferoide que se encuentre cerca del borde PDMS, o para separar los esferoides si se dispensan múltiples esferoides y detener el temporizador.

Para centrar verticalmente el esferoide en la capa de colágeno, después de la siembra, voltear el dispositivo boca abajo e incubar el dispositivo a 37 grados hasta que el colágeno polimerice, invirtiendo la orientación del dispositivo cada dos minutos durante un total de 30 minutos, luego añadir 2,5 mililitros de medio por dispositivo y adquirir una imagen de los esferoides en el punto de tiempo de cero horas. El uso de un dispositivo de imagen esferoide facilita la incrustación eficiente y la grabación de lapso de tiempo de invasión celular del cáncer dentro del colágeno o a través de imágenes longitudinales. Mientras que este esferoide se imaginó longitudinalmente en el transcurso de seis días que requieren la expresión estable de proteínas fluorescentes citoplasmáticas y/o nucleares, imágenes longitudinales similares se pueden realizar durante un período de tiempo más corto utilizando etiquetado de tinte.

Los esferoides también se pueden fijar e inmunoetiquetados. Por ejemplo, estos esferoides fueron inmunoetiquetados para epitelial-cadherina, cortactina y F-actin. En estas imágenes, se puede observar una ilustración paso a paso del procedimiento de procesamiento de imágenes utilizando la macro de Fiji para medir el área del esferoide a lo largo del tiempo.

Asegúrese de dispensar un solo esferoide en cada orificio del dispositivo de imágenes esferoides y de colocar el esferoide en el centro del agujero en direcciones XY y Z. El diseño del dispositivo se puede modificar fácilmente cambiando el tamaño y la disposición de los agujeros, plaquitas y platos inferiores de vidrio para acomodar un mayor rendimiento esferoide.