Capa por capa deposición de colágeno en dispositivos de microfluidos para microtejidos Estabilización

El objetivo general de este procedimiento es depositar un ensamblaje delgado de colágeno en las células en un dispositivo microfluídico. Esto se logra modificando primero el colágeno nativo acidificado a través de la metilación para crear moléculas de colágeno netas cargadas positivamente. El segundo paso es modificar el colágeno nativo acidificado a través de la ación para crear moléculas de colágeno netas cargadas negativamente.

A continuación, se preparan los dispositivos microfluídicos y se siembran con hepatocitos, que se dejan adherir y propagarse durante la noche. El paso final es depositar el ensamblaje de colágeno exponiendo alternativamente las células a las soluciones de colágeno cargadas positiva y negativamente para crear 10 bicapas de colágeno en la parte superior de la capa celular. En última instancia, la microscopía de fase e inmunofluorescencia y los ensayos de albúmina y urea se utilizan para mostrar el desarrollo y el mantenimiento de la polaridad celular y la función secretora.

Las principales ventajas de esta técnica son que permite el cultivo de hepatocitos en microdispositivos utilizando técnicas similares a las aplicadas en cultivos en placa durante más de 20 años. No requiere diseños complejos de dispositivos y la matriz depositada es muy delgada del orden de 100 nanómetros. Primero tuvimos la idea de este método mientras hacíamos una lluvia de ideas sobre cómo traducir las técnicas de cultivo de células Capy de placas a dispositivos microfluídicos.

Los métodos de sándwich de colágeno funcionan en sistemas microscópicos abiertos, pero los hidrogeles utilizados son incompatibles con microdispositivos cerrados con alturas de canal limitadas. Diluya 100 miligramos de una solución de colágeno acidificado nativo a una concentración de 0,5 miligramos por mililitro con hielo, agua fría y estéril, y coloque la solución en hielo para evitar la alación. A continuación, ajuste el pH de la solución de colágeno entre nueve y 10 con unas gotas de un hidróxido de sodio normal y agite suavemente la solución a temperatura ambiente durante 30 minutos.

A medida que el colágeno precipita, la solución comenzará a volverse turbia, gire la solución de colágeno precipitada que 3000 veces G durante 25 minutos. Luego, debe ser visible un precipitado transparente similar a un gel en el fondo de los tubos, aspirar el snat y luego resuspender el colágeno precipitado en 200 mililitros de metanol con ácido clorhídrico normal 0.1 permitir que ocurra la reacción de metilación mientras se agita a temperatura ambiente durante cuatro días después de la centrífuga de metilación, la solución a 3000 veces G durante 25 minutos para pellet el colágeno metilado, A continuación, aspire y deseche el supinato de metanol acidificado. A continuación, disuelva el colágeno metilado en 25 mililitros de PBS estéril y filtre la solución a través de un colador de células de 60 micras.

Ajuste el pH de la solución a 7.3 a 7.4 usando incrementos de 20 microlitros de un hidróxido de sodio normal. Evalúe la concentración de la solución de colágeno utilizando un kit comercial de colágeno para ratas ELIZA o un kit de ensayo de hidroxiprolina. Luego diluya la solución a tres miligramos por mililitro con PBS estéril.

Esterilice la solución de colágeno metilado transfiriéndola a un frasco de vidrio con tapón de rosca. Coloque cuidadosamente tres mililitros de cloroformo en el fondo de la botella y deje que la botella se asiente durante la noche a cuatro grados centígrados. A la mañana siguiente.

Asépticamente, elimine la capa superior de colágeno metilado. Almacene el colágeno metilado a cuatro grados centígrados y utilícelo en el plazo de un mes. Diluir otros 100 miligramos de solución de colágeno acidificado nativo a una concentración de 0,5 miligramos por mililitro con hielo, agua fría y estéril, y colocar la solución en hielo para evitar la dación como se mostró anteriormente, ajustar el pH de la solución de colágeno con hidróxido de sodio y agitar la solución a temperatura ambiente para precipitar el colágeno.

A continuación, disuelva 40 miligramos de anhídrido seis cínicos en 10 mililitros de acetona. Agregue lentamente esta mezcla en incrementos de 0,5 mililitros a la solución de colágeno mientras revuelve y monitorea continuamente el pH de la solución. Mantenga el pH por encima de 9.0 agregando una o dos gotas de un hidróxido de sodio normal a medida que el pH se acerque a 9.0, agitando continuamente a temperatura ambiente durante 120 minutos.

Después de agregar las seis soluciones de cínico e hidruro, observe que la mezcla se aclara a medida que el colágeno succinato se disuelve, continúe revisando periódicamente el pH para asegurarse de que permanezca por encima de 9.0. Cuando todo el colágeno succinato se haya disuelto, ajuste el pH de la solución a 4.0 usando incrementos de 20 microlitros de un ácido clorhídrico normal. Observe la solución, se vuelve turbia nuevamente a medida que precipita el colágeno succinato.

A continuación, centrifugar la solución a 3000 veces G durante 25 minutos. Para pelletizar el colágeno de succinato asbury y eliminar el snat acidificado con anhídrido snic no reactivo, disolver el colágeno de succinato con pipeteo repetido en 25 mililitros de PBS estéril, dando una concentración final de aproximadamente tres miligramos por mililitro. A continuación, filtre la solución a través de un colador de células de 60 micras y, a continuación, ajuste el pH de la solución a entre 7,3 y 7,4.

Usando incrementos de 20 microlitros de un hidróxido de sodio normal, evalúe la concentración de la solución usando un kit comercial de colágeno para ratas ELIZA o un kit de ensayo de hidroxiprolina. Luego diluya la solución a tres miligramos por mililitro. El uso de PBS estéril esteriliza esta solución de colágeno alterado de la misma manera que la solución de colágeno metilado.

Comience fabricando un dispositivo microfluídico utilizando una técnica estándar que tenga cámaras de cultivo celular con canales de 100 micras de alto, 0,4 a 1,5 milímetros de ancho y de uno a 10 milímetros de largo para el crecimiento celular. Use un limpiador de plasma para oxidar las superficies del dispositivo y un portaobjetos de vidrio. A continuación, presione los dos juntos para formar una unión.

Después de esterilizar el dispositivo mediante la exposición a la luz ultravioleta durante al menos 30 minutos. Llene la cámara con 15 microgramos por mililitro, fibronectina en PBS estéril e incube a 37 grados centígrados durante 45 minutos. A continuación, consulte el dispositivo con celdas como se describe en el protocolo de texto adjunto.

En una campana de cultivo de tejidos de flujo laminar, prepare volúmenes suficientes de soluciones de colágeno metilado y alado para 10 aplicaciones de cada solución por dispositivo, así como unos pocos mililitros extremos de medio. Mantén las soluciones en hielo. Alterne el lavado de los dispositivos con 20 microlitros de soluciones de colágeno metiladas y luego alteradas.

Esperando un minuto entre cada aplicación. Enjuague el dispositivo un total de 10 veces por solución. Trabaje rápidamente para minimizar la cantidad de tiempo que las células están sin medios mientras crecen las capas de colágeno, es posible observar que el colágeno se acumula lentamente en la entrada y salida del dispositivo microfluídico.

Si la resistencia al flujo de fluido aumenta, enjuague el dispositivo una o dos veces con medios y luego continúe con las capas. Después de aplicar todas las capas, enjuague el dispositivo dos veces con medios nuevos y devuélvalo a la incubadora. La metilación y la ación alteran las características de carga de las moléculas de colágeno.

La ación elimina los grupos cargados positivamente y los reemplaza con grupos cargados negativamente, y la metilación elimina los grupos cargados negativamente, creando moléculas netas cargadas positivamente, lo que permite la deposición capa por capa de las dos variantes de colágeno sobre superficies cargadas como las células. Los hepatocitos primarios sembrados en vidrio recubierto de fibronectina dentro de un dispositivo microfluídico se pueden recubrir con esto capa por capa. El ensamblaje de la matriz de colágeno, la deposición de 10 bicapas en las células crea un espesor de capa de colágeno de aproximadamente 140 nanómetros de hepatocitos sin una capa superior de colágeno capa por capa.

Las matrices pierden su fenotipo diferenciado, se contraen y se levantan de la superficie de los dispositivos microfluídicos con el tiempo. Por el contrario, los hepatocitos recubiertos con un ensamblaje de colágeno ultrafino mantienen su morfología diferenciada, una viabilidad superior al 90% y una polarización a lo largo de 14 días. Además de la morfología y polarización de la viabilidad celular, la técnica de colágeno capa por capa también recupera y estabiliza la función de los hepatocitos primarios como se indica aquí, Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo metilar y succinar colágeno para crear soluciones netas de colágeno cargadas positiva y negativamente y cómo usarlas en la deposición capa por capa para crear ensamblajes delgados de colágeno encima de las células en dispositivos microfluídicos.