Capa por capa deposición de colágeno en dispositivos de microfluidos para microtejidos Estabilización
29 de septiembre de 2015
La creación de microtejidos funcionales dentro de dispositivos microfluídicos requiere la estabilización de los fenotipos celulares mediante la adaptación de las técnicas tradicionales de cultivo celular a las limitadas dimensiones espaciales de los microdispositivos. La modificación del colágeno permite la deposición capa por capa de ensamblajes de colágeno ultrafinos que pueden estabilizar las células primarias, como los hepatocitos, como modelos de tejido microfluídico.
El objetivo general de este procedimiento es depositar un ensamblaje delgado de colágeno sobre células en un dispositivo microfluídico. Esto se logra primero modificando el colágeno nativo acidificado mediante metilación para crear moléculas de colágeno con carga neta positiva. El segundo paso consiste en modificar el colágeno nativo acidificado mediante acilación para crear moléculas de colágeno con carga neta negativa.
A continuación, se preparan los dispositivos microfluídicos y se siembran con hepatocitos, los cuales se dejan adherir y extender durante la noche. El paso final consiste en depositar el ensamblaje de colágeno mediante exposiciones alternadas de las células a soluciones de colágeno con carga positiva y negativa, para crear 10 bicapas de colágeno encima de la capa celular. Finalmente, se utilizan microscopía de fase y microscopía de inmunofluorescencia, así como ensayos de albúmina y urea, para demostrar el desarrollo y mantenimiento de la polaridad celular y la función secretora.
Las principales ventajas de esta técnica son que permiten el cultivo de hepatocitos en dispositivos microfluídicos utilizando métodos similares a los empleados en cultivos en placas durante más de 20 años. No requiere diseños de dispositivos complejos y la matriz depositada es muy delgada, del orden de 100 nanómetros. Tuvimos por primera vez la idea de este método mientras estábamos discutiendo cómo traducir las técnicas de cultivo de células tipo Capy desde placas a dispositivos microfluídicos.
El método de sándwich de colágeno funciona en sistemas microscópicos de tapa abierta, pero los hidrogeles utilizados son incompatibles con dispositivos microfluídicos cerrados que tienen alturas de canal limitadas. Diluya 100 miligramos de una solución nativa acidificada de colágeno hasta una concentración de 0,5 miligramos por mililitro con agua estéril fría con hielo y coloque la solución en hielo para evitar la gelificación. A continuación, ajuste el pH de la solución de colágeno entre nueve y 10 con unas gotas de hidróxido de sodio 1 N y agite suavemente la solución a temperatura ambiente durante 30 minutos.
A medida que el colágeno precipita, la solución comenzará a enturbiarse; centrifugue la solución de colágeno precipitado a 3000 veces G durante 25 minutos. Posteriormente, debería ser visible un precipitado claro de aspecto gelatinoso en el fondo de los tubos; aspire el sobrenadante y luego resuspenda el colágeno precipitado en 200 mililitros de metanol con ácido clorhídrico 0,1 N. Permita que ocurra la reacción de metilación bajo agitación a temperatura ambiente durante cuatro días. Después de la metilación, centrifugue la solución a 3000 veces G durante 25 minutos para obtener el pellet de colágeno metilado, luego aspire y deseche el sobrenadante de metanol acidificado. A continuación, disuelva el colágeno metilado en 25 mililitros de PBS estéril y filtre la solución a través de un colador celular de 60 micrones.
Ajuste el pH de la solución a entre 7,3 y 7,4 utilizando incrementos de 20 microlitros de hidróxido de sodio 1 N. Evalúe la concentración de la solución de colágeno utilizando un kit comercial de ELIZA para colágeno de rata o un kit de ensayo de hidroxiprolina. Luego, diluya la solución hasta tres miligramos por mililitro con PBS estéril.
Esterilice la solución de colágeno metilado transfiriéndola a un frasco de vidrio con tapa roscada. Añada cuidadosamente tres mililitros de cloroformo en el fondo del frasco y deje el frasco reposando durante la noche a cuatro grados Celsius. A la mañana siguiente.
De forma aséptica, retire la capa superior de colágeno metilado. Almacene el colágeno metilado a cuatro grados Celsius y úselo dentro de un mes. Diluya otros 100 miligramos de solución nativa de colágeno acidificado hasta una concentración de 0,5 miligramos por mililitro con agua estéril fría con hielo y coloque la solución en hielo para prevenir la desnaturalización; como se mostró previamente, ajuste el pH de la solución de colágeno con hidróxido de sodio y agite la solución a temperatura ambiente para precipitar el colágeno.
A continuación, disuelva 40 miligramos de anhídrido hexametilénico en 10 mililitros de acetona. Añada lentamente esta mezcla a la solución de colágeno en incrementos de 0,5 mililitros, agitando y monitoreando continuamente el pH de la solución. Mantenga el pH por encima de 9,0 añadiendo una o dos gotas de hidróxido de sodio 1 N cuando el pH se acerque a 9,0, con agitación continua a temperatura ambiente durante 120 minutos.
Después de agregar todas las seis soluciones de cianuro e hidruro, observe que la mezcla se vuelve clara a medida que el colágeno succinato se disuelve; continúe verificando periódicamente el pH para asegurarse de que permanezca por encima de 9,0. Cuando todo el colágeno succinato se haya disuelto, ajuste el pH de la solución a 4,0 utilizando incrementos de 20 microlitros de ácido clorhídrico normal. Observe que la solución se enturbia nuevamente cuando el colágeno succinato precipita.
A continuación, centrifugue la solución a 3000 × g durante 25 minutos. Para obtener el sedimento de colágeno succinilado y desechar el sobrenadante acidificado, disuelva el colágeno succinilado con pipeteo repetido en 25 mililitros de PBS estéril, obteniendo una concentración final de aproximadamente 3 miligramos por mililitro. Luego, filtre la solución a través de un tamiz celular de 60 micrones y ajuste el pH de la solución entre 7,3 y 7,4.
Usando incrementos de 20 microlitros de hidróxido de sodio 1 N, evalúe la concentración de la solución mediante un kit comercial de ELISA para colágeno de rata o un kit de ensayo de hidroxiprolina. Luego, diluya la solución hasta tres miligramos por mililitro. Esterilice esta solución de colágeno con PBS estéril del mismo modo que la solución de colágeno metilado.
Comience fabricando un dispositivo microfluídico mediante una técnica estándar que tenga cámaras para cultivo celular con canales de 100 micrones de altura, 0,4 a 1,5 milímetros de ancho y de uno a 10 milímetros de largo para el crecimiento celular. Utilice un limpiador de plasma para oxidar las superficies del dispositivo y una portaobjetos de vidrio. Luego, presione ambos juntos para formar un enlace.
Después de esterilizar el dispositivo mediante exposición a luz UV durante al menos 30 minutos, llene la cámara con 15 microgramos por mililitro de fibronectina en PBS estéril e incube a 37 grados Celsius durante 45 minutos. A continuación, siembre el dispositivo con células según se describe en el protocolo de texto adjunto.
En una cabina de flujo laminar para cultivo de tejidos, prepare volúmenes suficientes de soluciones de colágeno metilado y colágeno sin metilar para 10 aplicaciones de cada solución por dispositivo, así como unos pocos mililitros adicionales de medio. Mantenga las soluciones en hielo. Lave alternativamente los dispositivos con 20 microlitros de la solución de colágeno metilado y luego con la solución de colágeno sin metilar.
Esperar un minuto entre cada aplicación. Lavar el dispositivo un total de 10 veces por cada solución. Trabajar rápidamente para minimizar el tiempo que las células permanecen sin medio durante el crecimiento de las capas de colágeno; es posible observar cómo el colágeno se acumula lentamente en la entrada y salida del dispositivo microfluídico.
Si la resistencia al flujo de líquido aumenta, enjuague el dispositivo una o dos veces con medio y luego continúe con la formación de capas. Después de aplicar todas las capas, enjuague el dispositivo dos veces con medio fresco y devuélvalo al incubador. La metilación y la acetilación alteran las características de carga de las moléculas de colágeno.
La acetilación elimina grupos con carga positiva y los reemplaza por grupos con carga negativa, mientras que la metilación elimina grupos con carga negativa, generando moléculas con carga neta positiva, lo que permite la deposición capa por capa de las dos variantes de colágeno sobre superficies cargadas, como las células. Los hepatocitos primarios sembrados sobre vidrio recubierto con fibronectina dentro de un dispositivo microfluídico pueden recubrirse mediante este método capa por capa. El ensamblaje de la matriz de colágeno, con la deposición de 10 bicapas sobre las células, crea un espesor de capa de colágeno de aproximadamente 140 nanómetros en hepatocitos sin una capa superior de colágeno capa por capa.
Las matrices pierden su fenotipo diferenciado, se contraen y se desprenden de la superficie de los dispositivos microfluídicos con el tiempo. En contraste, los hepatocitos recubiertos con un ensamblaje de colágeno ultradelgado mantienen su morfología diferenciada, una viabilidad mayor al 90 % y su polarización durante más de 14 días. Además de la viabilidad celular, la morfología y la polarización, la técnica de deposición por capas también recupera y estabiliza la función de los hepatocitos primarios, como se indica aquí. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo metilar y succinilar el colágeno para crear soluciones de colágeno con carga neta positiva y negativa, y cómo utilizarlas en la deposición por capas para crear ensamblajes delgados de colágeno encima de las células en dispositivos microfluídicos.
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Resumen
Este estudio se centra en la deposición de un ensamblaje delgado de colágeno sobre células dentro de un dispositivo microfluídico para estabilizar los fenotipos celulares. El método implica modificar el colágeno para crear moléculas con carga positiva y negativa, que se depositan alternativamente para formar una estructura multicapa.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Microfluídica
- Cultivo celular
- Ingeniería de tejidos
Antecedentes
- Los microtejidos son esenciales para imitar las funciones de los órganos.
- La estabilización de los fenotipos celulares es crucial en aplicaciones microfluídicas.
- El colágeno es un componente clave en la ingeniería de tejidos.
- Las técnicas de deposición capa por capa mejoran la funcionalidad celular.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método para la deposición de ensamblaje de colágeno en dispositivos microfluídicos.
- Estabilizar células primarias como hepatocitos para la modelización de tejidos.
- Evaluar la polaridad celular y las funciones secretoras tras la deposición.
Métodos Utilizados
- Modificación del colágeno nativo mediante metilación y aminación.
- Preparación de dispositivos microfluídicos y siembra con hepatocitos.
- Depósito estratificado de colágeno mediante la exposición alternada de las células a soluciones cargadas.
- Uso de microscopía de fase e inmunofluorescencia, junto con ensayos de albúmina y urea.
Resultados principales
- Deposición exitosa de 10 bicapas de colágeno sobre hepatocitos.
- Se demostró el mantenimiento de la polaridad celular.
- Se confirmó la función secretora de los hepatocitos mediante ensayos.
- Se visualizó la integridad estructural mediante técnicas de microscopía.
Conclusiones
- El método estabiliza eficazmente los fenotipos celulares en microdispositivos.
- La deposición de colágeno capa por capa mejora la funcionalidad del modelo de tejido.
- Este enfoque puede aplicarse a otros tipos celulares para diversas aplicaciones.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Estabilizar la morfología y función de hepatocitos primarios en dispositivos microfluídicos sigue siendo un desafío crítico para la modelización del tejido hepático y los estudios de metabolismo de fármacos. Esta técnica de deposición de colágeno capa por capa permite el cultivo a largo plazo de microtejidos mediante la creación de matrices ultradelgadas y biocompatibles que reproducen aspectos clave de la matriz extracelular nativa. Al mantener fenotipos diferenciados durante más de 14 días, el método mejora la confiabilidad predictiva de los ensayos preclínicos basados en hepatocitos, reduciendo la variabilidad biológica que podría comprometer la identificación de compuestos prometedores y los resultados del cribado de seguridad.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la exploración de vías específicas de los hepatocitos al mantener la morfología polarizada y la función secretora esenciales para la validación de dianas en modelos de enfermedades hepáticas.
- Valor operativo: Reduce la deriva fenotípica durante el cultivo, aumentando la reproducibilidad de las mediciones funcionales utilizadas para minimizar riesgos en hipótesis mecanicistas.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Produce plataformas microfluídicas estandarizadas recubiertas con colágeno que permiten ensayos cuantitativos de albúmina y urea para cribados consistentes de compuestos.
- Valor operativo: Compatible con los flujos de trabajo existentes de fabricación microfluídica, lo que permite una integración escalable en sistemas automatizados de cribado sin necesidad de rediseñar dispositivos complejos.
Investigación Translacional y Preclínica
- Valor científico: Mantiene la diferenciación y función de los hepatocitos durante dos semanas, lo que favorece la continuidad preclínica desde los estudios de descubrimiento hasta los de toxicología.
- Valor operativo: Amplía la ventana útil para la evaluación longitudinal de biomarcadores de lesión hepática inducida por fármacos (DILI) en modelos de tejido microfluídicos.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento al permitir cultivos estables de hepatocitos que apoyan el desarrollo temprano de ensayos y la validación preclínica de terapéuticos dirigidos al hígado.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la preservación de la polaridad y función de los hepatocitos, que son fundamentales para evaluar la interacción con el blanco en las vías metabólicas.
- Selección: Proporciona lecturas cuantitativas y reproducibles mediante la secreción de albúmina y urea, facilitando la evaluación confiable de compuestos en formatos de microtejidos.
- Análisis: Genera parámetros funcionales que permiten la comparación entre diferentes condiciones de la salud de los hepatocitos y su actividad metabólica.
- Investigación Traducional: Conecta las fases de descubrimiento y preclínica al estabilizar los fenotipos necesarios para la modelización relevante a enfermedades.
- Reutilización Empresarial: Representa una técnica adaptable de modificación de superficies aplicable en múltiples plataformas microfluídicas y tipos celulares.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva mediante el mantenimiento del fenotipo y la función de hepatocitos diferenciados durante períodos prolongados de cultivo.
- Valor operativo: Normalización y reproducibilidad mediante capas ultradelgadas de colágeno depositadas con precisión que minimizan la variabilidad entre lotes.
- Valor estratégico: Mejora en las decisiones de avance o interrupción al reducir los falsos negativos derivados de células desdiferenciadas en ensayos de toxicidad hepática.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo de candidatos basada en lecturas funcionales estables y a largo plazo provenientes de modelos hepáticos microfluídicos.
Consideraciones de Implementación
- Se requiere experiencia en química del colágeno y preparación de dispositivos microfluídicos para los pasos de metilación y sucinación.
- Es necesario tener acceso a infraestructura para centrifugación, control de pH y filtración estéril para la modificación del colágeno.
- La estandarización entre equipos depende de un tiempo de estratificación y manejo de soluciones consistentes para garantizar un depósito uniforme de película delgada.
- La adaptación a otros tipos celulares requiere la validación de la compatibilidad del colágeno y su impacto en la estabilidad del fenotipo.
- Las limitaciones prácticas incluyen la incompatibilidad de los hidrogeles con dispositivos microfluídicos cerrados que tienen alturas de canal limitadas, como se indica en la fuente.
