Cuantificación de Cerebral Vascular Arquitectura utilizando microscopía de dos fotones en un modelo de ratón de la neuroinflamación inducida por el VIH

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar los cambios en las redes capilares corticales tras una exposición prolongada a la virotoxina del VIH, tat. Este método puede ayudar a examinar cambios clave en la morfología capilar cortical que podrían contribuir a la patogénesis de los trastornos neurocognitivos asociados al VIH. La principal ventaja de esta técnica es que permite una cuantificación fisiológicamente precisa de múltiples parámetros morfológicos capilares.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la patogénesis de los trastornos neurocognitivos asociados al VIH, también puede aplicarse a otras enfermedades en las que ocurren cambios vasculares, como la enfermedad de Alzheimer. Comience este procedimiento aplicando gel de lágrima artificial en los ojos de un ratón anestesiado.

A continuación, afeite la cabeza utilizando una afeitadora eléctrica. Luego, aplique solución de povidona yodo para esterilizar el cuero cabelludo y déjela secar. Bajo un microscopio de luz, retire el cuero cabelludo del animal para exponer completamente los huesos parietales, los huesos frontales caudales y el punto bregmático.

Aplique una pequeña cantidad de una solución al diez por ciento de cloruro férrico sobre el cráneo, con el fin de secar la membrana para facilitar su eliminación. Posteriormente, retire la membrana seca raspando suavemente el cráneo con la pinza. Luego, aplique una capa delgada de pegamento alrededor de la ventana de la placa craneal.

Presione suavemente la placa craneal contra el cráneo del ratón para mantener el área de interés en el centro de la ventana. Posteriormente, aplique una gota de cemento dental sobre la placa craneal para polimerizar el pegamento. A continuación, aplique una capa delgada de pegamento a lo largo del borde de la ventana de la placa craneal para crear un reservorio que contenga la solución salina.

Una vez que el pegamento se haya secado, atornille la placa craneal en el arnés de la placa craneal del ratón. Retire cualquier residuo de pegamento de la ventana de la placa craneal utilizando una broca conectada a un taladro micro-torp, ajustado a 6.000 rpm. Deténgase cada 10 a 15 segundos para evitar el sobrecalentamiento del cráneo del ratón.

Después de eso, utilizando una broca nueva, comience a adelgazar el cráneo usando una fresa microtorp ajustada a 4.000 rpm. Mueva la fresa suavemente sobre el cráneo sin aplicar presión directa hacia abajo. Una vez que el cráneo esté completamente adelgazado, despegue al ratón del soporte y colóquelo sobre su espalda.

Sujete suavemente ambas extremidades traseras para exponer claramente los muslos mediales. Luego, retire el vello de ambos muslos mediales y desinfecte el sitio quirúrgico cubriendo los muslos con yodopovidona. A continuación, retire suavemente la piel del muslo medial derecho, por encima de la vena y la arteria femorales.

Aplique aproximadamente de tres a cinco gotas de solución salina al 0,9 % en el sitio quirúrgico. Luego, separe la vena femoral de la arteria mediante disección romo del paquete neurovascular femoral. A continuación, coloque dos trozos de hilo quirúrgico de tres centímetros de longitud debajo de la arteria femoral, a aproximadamente un centímetro de distancia entre sí.

Gire la sutura superior en sentido horario para crear un torniquete vascular que ayudará a prevenir la pérdida excesiva de sangre durante la cateterización. Posteriormente, realice una pequeña incisión en la arteria femoral utilizando tijeras de resorte, lugar por donde más adelante se insertará el catéter para monitorear los parámetros fisiológicos del ratón. En este procedimiento, retire la piel del muslo izquierdo medial del ratón.

A continuación, localice la vena femoral. Utilizando una jeringa de un mililitro y una aguja de calibre 30, aspire 130 microlitros de la solución de colorante fluorescente. Inyecte lentamente 100 microlitros del colorante en la vena femoral.

Después de retirar la aguja, aplique presión suave y constante sobre el sitio de inyección para detener cualquier sangrado y permita que el colorante circule durante cinco minutos. Luego, cierre el sitio quirúrgico con puntos de sutura. Gire cuidadosamente al ratón sobre su estómago y colóquelo en el arnés de la placa para la cabeza del ratón.

Para la imagenología in vivo con dos fotones, mueva el aparato quirúrgico al microscopio de dos fotones y asegúrese de mantener el nivel de anestesia del animal. A continuación, coloque una pequeña cantidad de solución salina al 0,9 % en el depósito de la placa craneal y baje el objetivo del microscopio hasta que entre en contacto con la solución salina. Luego, localice el área de interés utilizando el objetivo de observación en campo claro.

Posteriormente, inicie la imagenología con dos fotones. Localice un lecho capilar en la pantalla de visualización y aumente esta área utilizando también el zoom óptico. Adquiera imágenes de los capilares utilizando el software de imagenología con dos fotones.

Para la imagenología ex vivo mediante microscopía de dos fotones, realice una incisión en el cuero cabelludo desde los huesos interparietales hasta los huesos frontales del ratón decapitado. Sujete la piel a los lados del cráneo con el dedo índice y el pulgar, coloque las tijeras extrafinas debajo del hueso interparietal medial y corte el cráneo a lo largo de la sutura sagital hasta aproximadamente tres milímetros más allá del punto bregmático. Luego, separe el cráneo del cerebro y retire cuidadosamente las meninges de la superficie del cerebro con la pinza.

Deslice suavemente la pinza por debajo del cerebro para liberarlo del cráneo. Posteriormente, coloque el cerebro en una matriz cerebral específica para ratones y lávelo con gotas de ACSF. A continuación, retire una sección coronal del cerebro de un milímetro de grosor.

Coloque la sección cerebral sobre un portaobjetos de vidrio cóncavo que contenga ACSF, con la parte más anterior de la sección orientada hacia arriba. Luego, cúbrala suavemente con una laminilla de vidrio. Transfiera el portaobjetos a la platina del microscopio y coloque una pequeña cantidad de solución salina al 0,9 % sobre la laminilla.

Baje el objetivo del microscopio hasta que entre en contacto con la solución salina. Posteriormente, localice la línea media del cerebro utilizando el objetivo de campo claro. A continuación, inicie la imagen de dos fotones y localice nuevamente la línea media usando el objetivo 25x.

Logre esto buscando la fisura longitudinal en la superficie cortical de la sección coronal. Luego, coloque el borde derecho de la pantalla de imagen en la línea media y mueva la pantalla visual lateralmente a través de tres cuadros completos. Localice la profundidad en la que los capilares son apenas visibles en la pantalla de visualización.

Luego, baje el plano de enfoque otros 20 micrómetros para determinar la parte superior de la pila en z. Establezca el grosor de la imagen en un micrómetro. Baje la pantalla de visualización 100 micrómetros y ajuste la potencia del láser continuamente de modo que menos del uno por ciento de los píxeles estén sobreexpuestos.

Finalmente, adquiera el z-stack. En esta figura, después de que se ha preparado la sección cerebral, se localiza un área de imagen aproximadamente a 1,5 milímetros de la línea media. Un z-stack de 100 micrómetros produce una imagen tridimensional utilizada para el análisis en el software analítico Amira.

La red capilar se traza entonces manualmente colocando nodos al inicio y al final de un capilar o en cualquier punto donde un capilar se ramifica en otro. Esto produce una imagen completamente esqueletizada a partir de la cual se extraen automáticamente los parámetros morfológicos. El número de nodos capilares, segmentos, longitud media de los segmentos y la longitud total de los segmentos puede extraerse mediante imágenes ex vivo de dos fotones de cortes cerebrales de ratón.

Aquí, se produce una imagen bidimensional de las redes capilares mediante imágenes in vivo, en la que se puede extraer el diámetro capilar y se puede calcular el volumen capilar total utilizando el diámetro capilar y la longitud total del segmento obtenida a partir de las imágenes ex vivo. Una vez dominado, este procedimiento puede completarse en tres horas y media si se realiza correctamente. Durante la realización de este procedimiento, es importante actuar rápidamente manteniendo al mismo tiempo un nivel constante de anestesia, ya que el isoflurano puede causar vasodilatación de los capilares corticales, lo que distorsiona los datos.

Durante este procedimiento, pueden obtenerse otros parámetros capilares, como la velocidad de los glóbulos rojos o el flujo de glóbulos rojos, lo que puede proporcionar una comprensión más profunda de los cambios patogénicos observados en los trastornos neurocognitivos asociados al VIH y otras enfermedades neurodegenerativas. Buena suerte con sus experimentos.