Cuantificación de Cerebral Vascular Arquitectura utilizando microscopía de dos fotones en un modelo de ratón de la neuroinflamación inducida por el VIH

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar los cambios en las redes capilares corticales después de una exposición prolongada a la virotoxina del VIH, tat. Este método puede ayudar a examinar los cambios clave en la morfología capilar cortical que pueden contribuir a la patogénesis de los trastornos neurocognitivos asociados al VIH. La principal ventaja de esta técnica es que permite una cuantificación fisiológicamente precisa de múltiples parámetros morfológicos capilares.

Sin embargo, este método puede proporcionar información sobre la patogénesis de los trastornos neurocognitivos asociados al VIH. También se puede aplicar a otras enfermedades en las que se producen cambios vasculares como la enfermedad de Alzheimer. Comience este procedimiento aplicando gel lagrimal artificial en los ojos de un ratón anestesiado.

A continuación, afeita su cabeza con una maquinilla de afeitar eléctrica. Luego, aplique una solución de povidona yodada para esterilizar el cuero cabelludo y deje que se seque. Bajo un microscopio óptico, extraiga el cuero cabelludo del animal, para exponer completamente los huesos parietales, los huesos frontales caudales y el punto bregma.

Aplique una pequeña cantidad de una solución de cloruro férrico al diez por ciento en el cráneo, con el fin de secar la membrana para facilitar su eliminación. Posteriormente, retire la membrana seca, raspando suavemente el cráneo con las pinzas. Luego, aplique una capa delgada de pegamento alrededor de la ventana de la placa principal.

Presione suavemente la placa de la cabeza contra el cráneo del ratón, para mantener el área de interés en el centro de la ventana. Después, aplique una gota de cemento dental a la placa de la cabeza, para polimerizar el pegamento. A continuación, aplique una capa delgada de pegamento a lo largo del borde de la ventana de la placa principal para crear un depósito para contener la solución salina.

Una vez que el pegamento se haya secado, atornille la placa de la cabeza en el arnés de la placa de la cabeza del ratón. Retire el pegamento de la ventana de la placa principal con una broca conectada a un taladro micro-torp, ajustado a 6.000 rpm. Deténgase cada 10 a 15 segundos para evitar el sobrecalentamiento del cráneo del ratón.

Después de eso, con una broca nueva, comience a adelgazar el cráneo con un taladro micro-torp ajustado a 4, 000 rpm. Mueva el taladro suavemente a través del cráneo sin presión directa hacia abajo. Una vez que el cráneo esté completamente adelgazado, separe el mouse del soporte y colóquelo en su espalda.

Tape suavemente ambas extremidades traseras para exponer claramente los muslos mediales. A continuación, retire el vello sobre ambos muslos mediales y desinfecte el sitio quirúrgico cubriendo los muslos con povidona yodada. A continuación, retire suavemente la piel de la parte medial del muslo derecho, por encima de la vena y la arteria femoral.

Aplique aproximadamente de tres a cinco gotas de solución salina al 0,9% en el sitio quirúrgico. A continuación, separe la vena femoral de la arteria, diseccionándola sin rodeos en el haz neurovascular femoral. Ahora, coloque dos piezas de sutura quirúrgica de tres centímetros, debajo de la arteria femoral, separadas aproximadamente un centímetro.

Gire la sutura superior en el sentido de las agujas del reloj para crear un torniquete vascular que ayudará a prevenir la pérdida excesiva de sangre durante el cateterismo. Posteriormente, se realiza una pequeña incisión en la arteria femoral con unas tijeras de muelle, donde posteriormente se introducirá el catéter para monitorizar los parámetros fisiológicos del ratón. En este procedimiento, se retira la piel de la parte medial del muslo izquierdo del ratón.

A continuación, localiza la vena femoral. Con una jeringa de un mililitro y una aguja de calibre 30, extraiga 130 microlitros de la solución de tinte fluorescente. Inyecte 100 microlitros del tinte lentamente en la vena femoral.

Después de retirar la aguja, aplique una presión suave y constante en el lugar de la inyección para detener el sangrado y permitir que el tinte circule durante cinco minutos. Luego, cierre el sitio quirúrgico con suturas. Voltee con cuidado el mouse sobre su estómago y colóquelo en el arnés de la placa de la cabeza del mouse.

Para la obtención de imágenes in vivo de dos fotones, mueva el aparato quirúrgico al microscopio de dos fotones y asegúrese de mantener el nivel de anestesia del animal. A continuación, coloque una pequeña cantidad de solución salina al 0,9 % en el depósito de la placa principal y baje el objetivo del microscopio para que entre en contacto con la solución salina. A continuación, localice el área de interés utilizando el objetivo de visualización de campo claro.

Después, comienza la toma de imágenes de dos fotones. Localice un lecho capilar en la pantalla de visualización y amplíe esta área con el zoom óptico también. Adquiera imágenes de los capilares utilizando el software de imágenes de dos fotones.

Para obtener imágenes ex vivo de dos fotones, se realiza una incisión en el cuero cabelludo desde los huesos interparietales hasta los huesos frontales del ratón decapitado. Asegure la piel a los lados del cráneo con el dedo índice y el pulgar, coloque las tijeras extrafinas debajo del hueso interparietal medial y corte el cráneo a lo largo de la sutura sagital hasta aproximadamente tres milímetros después del punto bregma. Luego, separe el cráneo del cerebro y retire con cuidado las meningas de la superficie del cerebro con las pinzas.

Deslice suavemente las pinzas debajo del cerebro para liberarlo del cráneo. Después, coloca el cerebro en una matriz cerebral, específica para ratones, y lávalo con gotas de ACSF. A continuación, retira una sección coronal del cerebro de un milímetro de grosor.

Coloque la sección de cerebro en un portaobjetos de vidrio cóncavo que contenga ACSF, con la parte más anterior de la sección hacia arriba. A continuación, cubra suavemente la rebanada de cerebro con un cubreobjetos de cristal. Transfiera el portaobjetos a la platina del microscopio y coloque una pequeña cantidad de solución salina al 0,9% en el cubreobjetos.

Baje el objetivo del microscopio hasta que entre en contacto con la solución salina. Posteriormente, localiza la línea media del cerebro utilizando el objetivo de campo claro. Ahora, comience la toma de imágenes de dos fotones y localice la línea media nuevamente usando el objetivo 25x.

Para ello, busca la fisura longitudinal en la superficie cortical de la sección coronal. A continuación, coloque el borde derecho de la pantalla de imagen en la línea media y mueva la pantalla del visor lateralmente a lo largo de tres fotogramas completos. Localice la profundidad a la que los capilares apenas son visibles en la pantalla de visualización.

A continuación, baje el plano de enfoque 20 micrómetros más para determinar la parte superior de la pila z. Establezca el grosor de la imagen en un micrómetro. Baje la pantalla de visualización 100 micrómetros y ajuste la potencia del láser de modo que menos del uno por ciento de los píxeles estén sobresaturados.

Finalmente, adquiera la pila z. En esta figura, después de que se ha preparado el corte de cerebro, se ubica un área de imagen a aproximadamente 1,5 milímetros de la línea media. Una pila z de 100 micrómetros produce una imagen tridimensional que se utiliza para el análisis en el software analítico Amira.

A continuación, la red capilar se traza manualmente colocando nodos al principio y al final de un capilar o en cualquier lugar donde un capilar se ramifique en otro. Esto produce una imagen completamente esqueletizada de la que se extraen automáticamente los parámetros morfológicos. El número de nodos capilares, segmentos, longitud media del segmento y la longitud total del segmento se pueden extraer utilizando dos imágenes ex vivo de fotones de cortes de cerebro de ratón.

En este caso, se produce una imagen bidimensional de las redes capilares mediante imágenes in vivo, en las que se puede extraer el diámetro capilar y calcular el volumen capilar total utilizando el diámetro capilar y la longitud total del segmento obtenidos de las imágenes ex vivo. Una vez dominado, este procedimiento se puede completar en tres horas y media si se realiza correctamente. Al realizar este procedimiento, es importante moverse rápidamente mientras se mantiene un nivel constante de anestesia, ya que el isoflurano puede causar vasodilatación de los capilares corticales, sesgando así los datos.

Durante este procedimiento se pueden obtener otros parámetros capilares, como la velocidad de los glóbulos rojos o el flujo de glóbulos rojos, que pueden proporcionar una comprensión más profunda de los cambios patogénicos observados en los trastornos neurocognitivos asociados al VIH y otras enfermedades neurodegenerativas. Buena suerte con tus experimentos.