Name: Cuantificación de Cerebral Vascular Arquitectura utilizando microscopía de dos fotones en un modelo de ratón de la neuroinflamación inducida por el VIH (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-12T18:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Aprende a cuantificar la arquitectura vascular cerebral mediante microscopía de dos fotones en ratones. Este método permite analizar cambios morfológicos capilares en modelos de neuroinflamación inducida por VIH.

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Agradecemos a Maria Jepson, la Dra. Paivi Jordan y la Dra. Linda Callahan del Núcleo Multifotónico de la Universidad de Rochester por su asesoramiento técnico durante la finalización de este protocolo. También agradecemos al Dr. Changyong Feng por su asesoramiento estadístico experto, y al Dr. Maiken Nedergaard del Centro Médico de la Universidad de Rochester por el diseño de la placa de cabeza utilizado en este artículo. Este trabajo fue financiado en parte por subvenciones T32GM007356 y R01DA026325 de los Institutos Nacionales de Salud (NIH); y por el Centro de Investigación sobre el SIDA de la Universidad de Rochester P30AI078498 (NIH).

La Universidad de la Universidad de Rochester Comité de Recursos Animal aprobó todos los procedimientos realizados en este trabajo. Preparación 1. Pre-quirúrgica (y ratones) <ol><li> Prepare el área quirúrgica con todo el equipo necesario. Esterilizar todos los instrumentos utilizados durante el procedimiento de antemano el uso de 70% de etanol. Opcionalmente, utilice un esterilizador de vidrio perla o autoclave para esterilizar las herramientas. </li><li> Coloque el ratón en una cámara de inducción isoflurano conectado a un vaporizador de isoflurano. Establecer niveles de isoflurano a 4% a una velocidad de 1 L / min. Nota: para los experimentos aquí, ratones con doxiciclina (DOX) inducible transgén VIH-1 Tat impulsado por la proteína glial fibrilar específico de astrocitos (GFAP) promotor (VIH Tat-ratones Tg) 10 se utilizaron para examinar el efecto del VIH -1 neuroinflamación en la estructura vascular cerebral inducida, como se describió previamente 7,10. </li><li> Inclinar suavemente la cámara de inducción para observar el ratón y# 39; s reflejo de enderezamiento. Una vez que el reflejo de enderezamiento se ha suprimido, establecer el nivel de isoflurano al 2% y redirigir el flujo de aire de la cámara de inducción al cono de la nariz en el banco quirúrgica. </li><li> Mueve rápidamente el ratón desde la cámara de inducción al agua infundida almohadilla térmica. Continúe aplicando isoflurano (1,5-2%) a través del cono de la nariz. Ajuste la anestesia según la tolerancia individual del ratón evaluado a través de la frecuencia respiratoria (RR) de supervisión. Nota: La depresión de RR puede perturbar los parámetros de gas fisiológicos que alteran el flujo sanguíneo cerebral y la evaluación diámetro del vaso. Intente mantener RR entre 55-65 respiraciones por minuto. La frecuencia cardíaca (HR) también se puede utilizar evaluar profundidad de la anestesia; mantener HR entre 300-450 latidos por minuto para evitar cambios fisiológicos a diámetro del vaso. Típicamente, la anestesia será adecuada entre 1.5-2.0% de isoflurano a 1 L / min para un ratón dado. </li><li> Realice una pizca dedo para comprobar aún más la profundidad de la anestesia. Si el ratón no responde, commEnce los procedimientos quirúrgicos. </li></ol> 2. Preparación de la ventana craneal Thin-cráneo <ol><li> Aplicar gel de lágrimas artificiales a los ojos del ratón. Eliminar completamente el cabello desde el cuero cabelludo del ratón usando tijeras o una máquina de afeitar eléctrica. </li><li> Esterilizar el cuero cabelludo mediante la aplicación de solución de povidona yodada; dejar secar. Luego, con un microscopio óptico, quite la piel del cuero cabelludo del ratón, exponiendo completamente los huesos parietales, los huesos frontales caudales, y marcado bregma. </li><li> Aplicar una pequeña cantidad de una solución de cloruro férrico al 10% en el cráneo con el fin de secar las membranas para una fácil extracción. Retire las membranas secas con el # 5/45 fórceps raspando suavemente el cráneo. </li><li> Aplique una capa fina de pegamento alrededor de la ventana placa cabecera. Presione suavemente la placa cabecera contra el cráneo del ratón, manteniendo el área de interés en el centro de la ventana. Aplicar una gota de cemento dental a la placa cabecera para polimerizar el pegamento. </li><li> Aplique una capa finade pegamento a lo largo del borde de la ventana placa cabecera para crear un depósito en el que para mantener la solución salina. Una vez que el pegamento se haya secado, atornillar la placa superior en el arnés placa cabecera ratón. Nota: el arnés placa cabecera del ratón utilizado en este procedimiento es una estructura con una base de metal y dos columnas metálicas. En cada columna hay un resorte y una tuerca de mariposa. La placa superior se coloca en la parte superior de la primavera, y la tuerca de mariposa se aprieta hasta que la cabeza esté nivelado y no se mueve. </li><li> Retire cualquier pegamento de la ventana de placa cabezal con una broca unido a un taladro MicroTorque fijado en 6.000 rpm. Deje de cada 10 a 15 segundos para evitar el sobrecalentamiento del cráneo del ratón que puede resultar en daños estructurales en los vasos. <ol><li> Usando una broca nueva, colocar el taladro de 1,5 mm MicroTorque lateralmente desde la línea media (un tercio del diámetro de la ventana placa cabecera). Comience a enrarecer el cráneo alrededor de esta ubicación a 4.000 rpm. Mueva el taladro suavemente a través del cráneo sin presión a la baja directa. </li><li> Dril Ceseling cada 10 a 15 segundos para evitar el sobrecalentamiento del cráneo del ratón. Durante este tiempo, retirar el polvo acumulado cráneo usando un bote de aire comprimido. </li><li> Use gotas de solución salina RT enfriar cráneo durante 5-10 seg. Retire con cuidado todo el líquido con un paño suave para continuar adelgazamiento cráneo. </li></ol></li><li> Para el adelgazamiento final del cráneo, colocar un pequeño volumen de solución salina en el depósito de placa superior y ligeramente barrer un microcuchilla dental sobre el área de interés hasta los vasos pequeños son claramente visibles. </li></ol> 3. vigilancia de parámetros fisiológicos <ol><li> Una vez que el cráneo está completamente adelgazado, separar el ratón del soporte y colóquelo en la espalda. Cinta suavemente ambas patas traseras para exponer claramente los muslos mediales. </li><li> Quite el pelo sobre ambos muslos mediales con unas tijeras o una máquina de afeitar eléctrica. Desinfectar la zona quirúrgica cubriendo los muslos con povidona yodada. </li><li> Pellizcar la piel en el muslo medial justo encima de la vena femoraly la arteria utilizando el # 5 fórceps. Tire suavemente la piel hacia arriba y usar las tijeras para cortar y quitar la piel. Nota: el muslo izquierdo está reservada en caso de complicaciones quirúrgicas (anomalías vasculares, los vasos rotos). </li><li> Aplicar aproximadamente 3-5 gotas de 0,9% de solución salina al sitio quirúrgico. Esto permite una mayor ampliación de los vasos, así como mantener el sitio hidratada y prevenir el secado de los vasos. Separar la vena femoral de la arteria por rodeos disección en el paquete neurovascular femoral utilizando dos # 5/45 fórceps. </li><li> Coloque dos, 3 piezas cm de sutura quirúrgica por debajo de la arteria femoral aproximadamente 1 cm de distancia. Gire la sutura hacia la derecha superior para crear un torniquete vascular que le ayudará a prevenir la pérdida excesiva de sangre durante el cateterismo. </li><li> Hacer una pequeña incisión en la arteria femoral con las tijeras de primavera. Colocar el catéter en la arteria a través de la incisión y avance hasta que el catéter es de forma segura dentro de la arteria. </li><li&gt; desenroscar la sutura superior (torniquete) para evaluar si hay fugas y la colocación del catéter adecuado. Asegurar el catéter en la arteria femoral mediante la vinculación de dos nudos alrededor del catéter dentro del vaso utilizando las suturas. </li><li> Inyectar 10 l de heparina (100 UI / ml) a través del catéter para evitar la coagulación de la sangre. A continuación, cierre quirúrgicamente el muslo derecho cosiendo la piel junto con una sutura de 4-0 en un patrón interrumpido simple. </li><li> Inyectar 50 l de uretano (1,2 mg / g) por vía intraperitoneal en el cuadrante inferior derecho. Cinco minutos más tarde repetir con otra inyección de 50 l para el cuadrante inferior izquierdo para un total de 100 l de uretano intraperitoneal. Poco a poco reducir los niveles de isoflurano a aproximadamente 0,25%, mientras que concomitantemente volver a controlar el ratón por la profundidad de la anestesia. Nota: Mantenga la aguja superficial dentro de la cavidad peritoneal a lo largo de la pared abdominal posterior de modo que no perforar el intestino. Esto se puede lograr por pellizcar la mu recto abdominalscles lejos de las vísceras y luego inyectar. </li><li> El uso de un tubo capilar, recoger una muestra de 40 l de sangre arterial del catéter. Una el catéter hasta el transductor de presión sanguínea equipado con una llave de paso de cuatro vías lleno de solución salina y la jeringa llena de heparina. </li><li> Tape el transductor de presión de sangre al aparato quirúrgico para evitar la eliminación no intencionada la del catéter. Comience el monitoreo de la presión arterial media. </li><li> Inserte el tubo capilar de la sangre llena en un puerto de entrada analizador de gases en sangre. Una vez que toda la sangre se ha extraído, retire el tubo capilar desde el puerto de entrada. Las juntas 2 y CO 2 niveles de gases en sangre van a aparecer en un papel impreso desde el analizador de gases en sangre. </li></ol> 4. La inyección del colorante fluorescente <ol><li> Pellizcar la piel en el muslo medial izquierda utilizando el # 5 pinzas. Tire suavemente la piel hacia arriba y usar las tijeras para cortar y quitar la piel. Preparar dextrano roja colorante rodamina emisor conjugado(70 kDa) (10 mg / kg disueltos en solución salina). </li><li> Localizar la femoral vein.Using una jeringa de 1 ml con una aguja de 30 G adjunto, dibujar una solución previamente preparada de un colorante fluorescente apropiado para formación de imágenes a la línea de 130 l de la jeringa. Eliminar todas las burbujas de aire dibujando el tinte completamente en la jeringa y agitando firmemente la pared de la jeringa. <ol><li> Doble el 30 G aguja en un ángulo de aproximadamente 30 grados presionándolo contra una superficie dura lado bisel hacia arriba. Llene la aguja con el tinte y deseche cualquier exceso de líquido, dejando una muestra de 100 l. </li></ol></li><li> Se inyecta la muestra de 100 l de tinte lentamente en la vena femoral. Después de retirar la aguja, aplique firme, suave presión en el lugar de la inyección para detener cualquier sangrado. Permitir que el colorante circule durante 5 min. Nota: como alternativa, la vena femoral derecha se puede utilizar en lugar de la inyección tinte fluorescente para evitar una mayor pérdida de sangre a través de la creación de otro sitio quirúrgico. Además, si elanimales está sangrando sin control desde el sitio quirúrgico, esto puede ser una indicación de que el exceso de heparina fue dado a enjuagar el catéter. Si no hay coagulación dentro de 10-15 min y el ratón sigue sangrando, considere reiniciar el experimento con un nuevo ratón. </li><li> Cierre el muslo izquierdo cosiendo la piel junto con una sutura de 4-0, y luego la vuelta con cuidado el ratón sobre su estómago, y lo coloca en el arnés placa cabecera ratón. </li></ol> 5. En Vivo De dos fotones de imágenes <ol><li> Mueva el aparato quirúrgico para el microscopio de dos fotones, asegurándose de mantener los niveles de anestesia continuas. Colocar una pequeña cantidad de 0,9% de solución salina en el depósito de placa cabecera y bajar el objetivo de microscopio de manera que entra en contacto con la solución salina. Localice el área de interés con el objetivo de campo claro de visión </li><li> Ajuste el láser de excitación de dos fotones a una longitud de onda apropiada para el colorante fluorescente. Comience la imagen de dos fotones usando el 25x objetivo. Tenga en cuenta que en estos experimentos se utilizó un dextrano conjugado con un emisor de tinte rojo rodamina que estaba emocionado a una longitud de onda de 780 nm. A 607/36 de paso de banda filtro de emisión para detectar la fluorescencia a partir del colorante, y un filtro de emisión de paso de banda 480/20 se utilizó para detectar la autofluorescencia arterial </li><li> Busque un capilar cama en la pantalla de la vista, y ampliar esta área se utiliza el zoom 2. Adquirir imágenes ópticas de los capilares utilizando el software de imagen de dos fotones. </li><li> Después de las imágenes es completa, sacrifica el ratón por dislocación cervical seguido por decapitación. </li></ol> 6. Ex Vivo en dos fotones de imágenes <ol><li> Usando las tijeras finas extra, hacer una incisión en el cuero cabelludo de los huesos interparietales a los huesos frontales del ratón. Fije la piel a los lados del cráneo con el dedo índice y el pulgar. </li><li> Coloque las tijeras finas adicionales debajo del hueso interparietal medial y cortar el cráneo a lo largo de la sutura sagital. Deje de cortar el cráneo de aproximadamente 3 mm después de marcar el bregma. Nota: Aplicar presión al alza al cortar el cráneo para evitar cortar el cerebro. </li><li> Usando los fórceps # 5, separar el cráneo desde el cerebro y cuidadosamente eliminar cualquier meninges desde la superficie del cerebro. Meninges restantes pueden lacerar accidentalmente el cerebro; extrema se debe tener cuidado para evitar esto. Deslice suavemente los # 5 fórceps debajo del cerebro avanzando lentamente hacia adelante hasta que el cerebro está libre de cráneo. Nota: presión hacia abajo que se debe utilizar con el fin de evitar perforar el cerebro. </li><li> Coloque el cerebro en una herramienta de cerebro de seccionamiento específico para ratones. Lavar el cerebro mediante la aplicación de gotas de líquido cefalorraquídeo artificial sobre el cerebro. </li><li> Eliminar una sección coronal 2 mm de cerebro de bregma 0 a bregma -2. Coloque la sección coronal en un portaobjetos de vidrio cóncava que contiene líquido cefalorraquídeo artificial con el bregma 0 (la mayoría parte craneal de la sección) mirando hacia arriba. Cubrir suavemente el sl cerebrohielo con una hoja de cubierta de vidrio. Nota: Evite presionar el vidrio una vez colocado en la sección del cerebro, ya que puede deformar la arquitectura vascular. </li><li> Transferir la diapositiva a la platina del microscopio y colocar una pequeña cantidad de solución salina 0,9% en la hoja de la cubierta. Bajar el objetivo de microscopio hasta que entra en contacto con la solución salina. Busque la línea media del cerebro utilizando el objetivo de campo claro. </li><li> Comience la imagen de dos fotones y localice la línea media de nuevo utilizando el objetivo 25x. Lograr esto mediante la búsqueda de la fisura longitudinal en la superficie cortical de la sección coronal. Coloque el borde derecho de la pantalla de imágenes en la línea media y mover la pantalla del visor sobre lateralmente de tres fotogramas completos (aproximadamente 1,5 mm de la línea media). Tenga en cuenta que en estos experimentos, los parámetros de imagen eran idénticas a las mencionadas en la nota en el paso 5.2. </li><li> Busque la profundidad a la que los capilares son apenas visibles en la pantalla de vista. Baje el plano de enfoque un adicional de 20m para determinar la parte superior de la z-pila. </li><li> Ajuste el espesor imagen para 1 micras. Baje la pantalla de vista de 100 micras y ajustar la potencia del láser a lo largo de tal manera que menos del 1% de los píxeles son sobresaturado. Nota: las imágenes z-stack se compilan a partir de una serie de 100 500x500x1 consecutivo imágenes micras. Cuanto mayor sea el z-stack más precisos serán los cálculos de procesamiento posterior será. En general, intentar cobrar un z-pila de 100 micras o más grandes. </li><li> Pulse el icono XY Repita seguido por el icono XY adyacente. Una vez que el z-pila está completa, pulse el icono de la Serie Hecho y guarde el archivo. </li></ol> 7. Tratamiento de datos <ol><li> Abra una imagen capilar en vivo en el software ImageJ. Establezca manualmente el píxel de relación a distancia basada en los valores obtenidos a partir del software de dos fotones. <ol><li> Seleccione la recta * * icono en el menú de herramientas. Dibuja una línea que se extiende desde una pared capilar a la opositio de la pared capilar, y registrar la longitud proporcionada por ImageJ. Tenga en cuenta que puede ser necesario para hacer un zoom en la imagen con el fin de visualizar claramente los bordes de las paredes de los capilares. </li><li> Repita el paso 7.1.1 en diferentes lugares a lo largo del capilar, así como para múltiples capilares en la imagen. </li></ol></li><li> Abra el archivo z-stack en el software de análisis como Amira. Seleccione el icono de Filamento Editor de la barra de herramientas de sub-aplicación <ol><li> Ajuste el espesor espectador a aproximadamente 20. Mover al espectador a la parte superior o inferior de la z-stack. </li><li> Seleccione el icono de rastreo y mueva el cursor sobre la imagen cargada. Coloque los nodos en los capilares en los lugares descritos en la Figura 2C; segmentos aparecerán automáticamente entre nodos adyacentes. Seguir la pista a lo largo de la totalidad de los capilares z-pila. Nota: será necesario colocar nodos en entre los puntos finales y los puntos de ramificación con el fin de rastrear los capilares thrOughout el z-stack. </li><li> Para eliminar estos nodos, haga clic en el icono Intermedio Quitar. Nota: Esto puede crear segmentos de bucle erróneas que se deben quitar manualmente seleccionando el bucle usando el icono Seleccionar único y, a continuación, seleccionar el icono Eliminar Seleccionados. Si bucles siguen apareciendo en la misma zona durante el rastreo, es probable que los nodos se colocaron en diferentes capilares. </li><li> Una vez que el trazado se completa, seleccione el icono Gráfico información para abrir una hoja de cálculo que contiene los parámetros vasculares extraídos automáticamente. El número de nodos y segmentos están disponibles en la pantalla de vista principal. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El método aquí descrito se puede aplicar para analizar estructuras microvasculares del cerebro en una amplia gama de modelos experimentales / ajustes. Para el éxito de este método, tres pasos críticos deben ser dominadas. En primer lugar, la ventana-cráneo delgada no debe dañar el cráneo o el cerebro subyacente. Es fácil de perforar el cráneo durante el adelgazamiento, o causar inducida por calor de fuga vascular. Esto puede interferir con la imagen como el colorante fluorescente se escapará en el plano de enfoque y osc...

Virus de Inmunodeficiencia Humana 1 (VIH-1) invade el cerebro durante la fase aguda de infección por el virus, e infecta productivamente ambos microglia y macrófagos residentes del cerebro, lo que conduce a su activación - y la liberación de ambos mediadores inflamatorios derivados del huésped y soluble VIH-1 virotoxins tales como Tat y gp120 (revisado en 1,2). Como consecuencia, un estado neuroinflamatoria crónica se establece en el SNC, que se cree que contribuyen a la patogénesis del VIH-1 Trastornos neurocognitivos asociados (mano) 3-5. La sobreexpresión crónica del VIH-1 Tat o interleucina (IL) -17A dentro del SNC de ratones se ha demostrado que resulta en microvascular rarefacción 6,7. Esto plantea la posibilidad de que la neuroinflamación crónica puede contribuir a la patogénesis de la mano a través de efectos sobre la vasculatura cerebral. Con el fin de examinar más a fondo esta cuestión, hemos desarrollado métodos para cuantificar estruc vasculares cerebralesturas. Este documento describe un método para cuantificar el número de nodos capilares, segmentos capilares, significa la longitud del segmento, la longitud total del segmento, diámetro medio capilar, y volumen total capilar utilizando imágenes in vivo de las redes capilares a través de una ventana cortical cráneo delgado (modificado a partir descrito previamente protocolos) 8,9, así como ex vivo de imágenes de secciones de cerebro, usando microscopía de dos fotones. Este enfoque combinado proporciona una cuantificación global de los parámetros vasculares cerebrales, ya que la fina calavera ventana cortical in vivo permite la preservación del medio ambiente cerebral, mientras que ex vivo de imágenes de las redes capilares en rodajas de cerebro permite la reconstrucción de completo, en tres dimensiones redes capilares - que luego puede cuantificarse utilizando software disponible comercialmente.

<table><tbody><tr><td>Microscopio Leica</td><td>Leica Inc.</td><td>MZ8</td><td></td></tr><tr><td>Iluminador de alta intensidad</td><td>Dolan-Jenner</td><td>180</td><td></td></tr><tr><td>Almohadilla térmica</td><td>Stryker &nbsp;</td><td>TP3E</td><td></td></tr><tr><td>T/BOMBA</td><td>Gaymar Industries, Inc.</td><td>TP-500</td><td></td></tr><tr><td>TEC-4 Vaporizador de isoflurano</td><td>Datex Ohmeda</td><td>447</td><td></td></tr><tr><td>Gel de lágrimas artificiales</td><td>Butler AHS</td><td>7312</td><td></td></tr><tr><td>Solución de povidona-yodo&nbsp;</td><td>Aplicare</td><td>52380-1855-9</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras Bonn Extra Finas</td><td>Herramientas de Ciencia Fina</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Dumot #5 Pinzas</td><td>Herramientas de Ciencias Finas</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5/45 Pinzas</td><td>Herramientas de Ciencias Finas</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Solución de Cloruro Férrico</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3120-16</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 454 Prisma Gel Adhesivo Instantáneo</td><td>Henkel</td><td>45404</td><td></td></tr><tr><td>Cemento Dental</td><td>Stoelting</td><td>51459</td><td></td></tr><tr><td>Microtoruqe II Kit de Pieza de Mano</td><td>Pearson Dental</td><td>R14-0002</td><td></td></tr><tr><td>005 Rebaba para Micro Taladro</td><td>Herramientas de Ciencia Fina</td><td>19007-05</td><td></td></tr><tr><td>Norland Blade (Microcuchilla Dental)</td><td>Salvin Dental</td><td>6900</td><td></td></tr><tr><td>Uretano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U2500</td><td>Carcinógeno del grupo 2B</td></tr><tr><td>Sutura trenzada</td><td>Ethicon</td><td>735G</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Tijeras de resorte Herramientas de</td><td>ciencia fina</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Catéter arterial</td><td>SAI Infusion Technologies</td><td>MAC-01</td><td>El extremo del catéter se estiró manualmente para disminuir su diámetro.</td></tr><tr><td>Monitor de presión arterial</td><td>World Precision Intruments</td><td>SYS-BP1</td><td></td></tr><tr><td>Transductor de presión arterial e instrumentos de</td><td>precisión Cable World</td><td>BLPR2</td><td></td></tr><tr><td>RAPIDLab Analizador de gases en sangre&nbsp;</td><td>Siemens&nbsp;</td><td>248</td><td></td></tr><tr><td>40 y mu; l Tubo capilar</td><td>VWR</td><td>15401-413</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red-dextran (70.000 MW, 10 mg/kg disuelto en solución salina)</td><td>Invitrogen</td><td>D-1830</td><td></td></tr><tr><td>Ratón adulto Brain Slicer Matrix</td><td>Zivic Instruments</td><td>BSMAS001-1</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM Microscopio multifotónico</td><td>Olypmus</td><td>FV-1000 MPE</td><td></td></tr><tr><td>MaiTai HP DeepSee Ti:Sa láser</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>Institutos Nacionales de Salud (NIH)</td><td></td><td>Disponible en</td></tr><tr><td>http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html Amira Software</td><td>Visage Imaging&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cuantificación de cerebral vascular arquitectura utilizando microscopía de dos fotones en un modelo de ratón de la neuroinflamación inducida por el vih

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

La infección por el Virus de la Inmunodeficiencia Humana 1 (VIH-1) frecuentemente resulta en Trastornos Neurocognitivos Asociados al VIH-1 (HAND), y se caracteriza por un estado neuroinflamatorio crónico dentro del sistema nervioso central (SNC), que se cree que es impulsado principalmente por la activación mediada por el virus de la microglía y los macrófagos residentes en el cerebro. La infección por VIH-1 también se acompaña de cambios en el flujo sanguíneo cerebrovascular (CBF), lo que aumenta la posibilidad de que la neuroinflamación crónica asociada al VIH pueda provocar cambios en el CBF y/o en la arquitectura vascular cerebral. Para abordar esta pregunta, hemos utilizado un modelo de ratón para la neuroinflamación inducida por el VIH, y hemos probado si la exposición a largo plazo a este entorno inflamatorio puede dañar la vasculatura cerebral y provocar la rarefacción de las redes capilares. En este trabajo describimos un método para cuantificar los cambios en la densidad capilar cortical en un modelo murino de enfermedad neuroinflamatoria (ratones transgénicos VIH-1 Tat). Este enfoque generalizable emplea imágenes in vivo de dos fotones de capilares corticales a través de una ventana cortical de cráneo delgado, así como imágenes ex vivo de dos fotones de capilares corticales en secciones de cerebro de ratón. Estos procedimientos producen imágenes y archivos z-stack de redes capilares, respectivamente, que luego se pueden someter a análisis cuantitativos para evaluar los cambios en la arquitectura vascular cerebral.

La ventana cortical-cráneo delgada permite imágenes in vivo de dos fotones de capilares corticales (Figura 1). Un área adecuada para imagen muestra numerosos capilares, distintas (Figura 1A). En el mismo campo de visión, no hay ninguna pared celular arterial autofluorescencia, y pueden existir otras señales fluorescentes, tales como fluorescencia inducida por colágeno, segunda generación de armónicos 11 (Figura 1B). <...

Este artículo describe un método mediante el cual se puede cuantificar la arquitectura vascular en el cerebro utilizando microscopía de dos fotones in vivo y ex vivo.

Cuantificación de Cerebral Vascular Arquitectura utilizando microscopía de dos fotones en un modelo de ratón de la neuroinflamación inducida por el VIH

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar los cambios en las redes capilares corticales tras una exposición prolongada a la virotoxina del VIH, tat. Este método puede ayudar a examinar cambios clave en la morfología capilar cortical que podrían contribuir a la patogénesis de los trastornos neurocognitivos asociados al VIH. La principal ventaja de esta técnica es que permite una cuantificación fisiológicamente precisa de múltiples parámetros morfológicos capilares.Aunque este método puede proporcionar información sobre la patogénesis de los trastornos neurocognitivos asociados al VIH, también puede aplicarse a otras enfermedades en las que ocurren cambios vasculares, como la enfermedad de Alzheimer. Comience este procedimiento aplicando gel de lágrima artificial en los ojos de un ratón anestesiado.A continuación, afeite la cabeza utilizando una afeitadora eléctrica. Luego, aplique solución de povidona yodo para esterilizar el cuero cabelludo y déjela secar. Bajo un microscopio de luz, retire el cuero cabelludo del animal para exponer completamente los huesos parietales, los huesos frontales caudales y el punto bregmático.Aplique una pequeña cantidad de una solución al diez por ciento de cloruro férrico sobre el cráneo, con el fin de secar la membrana para facilitar su eliminación. Posteriormente, retire la membrana seca raspando suavemente el cráneo con la pinza. Luego, aplique una capa delgada de pegamento alrededor de la ventana de la placa craneal.Presione suavemente la placa craneal contra el cráneo del ratón para mantener el área de interés en el centro de la ventana. Posteriormente, aplique una gota de cemento dental sobre la placa craneal para polimerizar el pegamento. A continuación, aplique una capa delgada de pegamento a lo largo del borde de la ventana de la placa craneal para crear un reservorio que contenga la solución salina.Una vez que el pegamento se haya secado, atornille la placa craneal en el arnés de la placa craneal del ratón. Retire cualquier residuo de pegamento de la ventana de la placa craneal utilizando una broca conectada a un taladro micro-torp, ajustado a 6.000 rpm. Deténgase cada 10 a 15 segundos para evitar el sobrecalentamiento del cráneo del ratón.Después de eso, utilizando una broca nueva, comience a adelgazar el cráneo usando una fresa microtorp ajustada a 4.000 rpm. Mueva la fresa suavemente sobre el cráneo sin aplicar presión directa hacia abajo. Una vez que el cráneo esté completamente adelgazado, despegue al ratón del soporte y colóquelo sobre su espalda.Sujete suavemente ambas extremidades traseras para exponer claramente los muslos mediales. Luego, retire el vello de ambos muslos mediales y desinfecte el sitio quirúrgico cubriendo los muslos con yodopovidona. A continuación, retire suavemente la piel del muslo medial derecho, por encima de la vena y la arteria femorales.Aplique aproximadamente de tres a cinco gotas de solución salina al 0,9 % en el sitio quirúrgico. Luego, separe la vena femoral de la arteria mediante disección romo del paquete neurovascular femoral. A continuación, coloque dos trozos de hilo quirúrgico de tres centímetros de longitud debajo de la arteria femoral, a aproximadamente un centímetro de distancia entre sí.Gire la sutura superior en sentido horario para crear un torniquete vascular que ayudará a prevenir la pérdida excesiva de sangre durante la cateterización. Posteriormente, realice una pequeña incisión en la arteria femoral utilizando tijeras de resorte, lugar por donde más adelante se insertará el catéter para monitorear los parámetros fisiológicos del ratón. En este procedimiento, retire la piel del muslo izquierdo medial del ratón.A continuación, localice la vena femoral. Utilizando una jeringa de un mililitro y una aguja de calibre 30, aspire 130 microlitros de la solución de colorante fluorescente. Inyecte lentamente 100 microlitros del colorante en la vena femoral.Después de retirar la aguja, aplique presión suave y constante sobre el sitio de inyección para detener cualquier sangrado y permita que el colorante circule durante cinco minutos. Luego, cierre el sitio quirúrgico con puntos de sutura. Gire cuidadosamente al ratón sobre su estómago y colóquelo en el arnés de la placa para la cabeza del ratón.Para la imagenología in vivo con dos fotones, mueva el aparato quirúrgico al microscopio de dos fotones y asegúrese de mantener el nivel de anestesia del animal. A continuación, coloque una pequeña cantidad de solución salina al 0,9 % en el depósito de la placa craneal y baje el objetivo del microscopio hasta que entre en contacto con la solución salina. Luego, localice el área de interés utilizando el objetivo de observación en campo claro.Posteriormente, inicie la imagenología con dos fotones. Localice un lecho capilar en la pantalla de visualización y aumente esta área utilizando también el zoom óptico. Adquiera imágenes de los capilares utilizando el software de imagenología con dos fotones.Para la imagenología ex vivo mediante microscopía de dos fotones, realice una incisión en el cuero cabelludo desde los huesos interparietales hasta los huesos frontales del ratón decapitado. Sujete la piel a los lados del cráneo con el dedo índice y el pulgar, coloque las tijeras extrafinas debajo del hueso interparietal medial y corte el cráneo a lo largo de la sutura sagital hasta aproximadamente tres milímetros más allá del punto bregmático. Luego, separe el cráneo del cerebro y retire cuidadosamente las meninges de la superficie del cerebro con la pinza.Deslice suavemente la pinza por debajo del cerebro para liberarlo del cráneo. Posteriormente, coloque el cerebro en una matriz cerebral específica para ratones y lávelo con gotas de ACSF. A continuación, retire una sección coronal del cerebro de un milímetro de grosor.Coloque la sección cerebral sobre un portaobjetos de vidrio cóncavo que contenga ACSF, con la parte más anterior de la sección orientada hacia arriba. Luego, cúbrala suavemente con una laminilla de vidrio. Transfiera el portaobjetos a la platina del microscopio y coloque una pequeña cantidad de solución salina al 0,9 % sobre la laminilla.Baje el objetivo del microscopio hasta que entre en contacto con la solución salina. Posteriormente, localice la línea media del cerebro utilizando el objetivo de campo claro. A continuación, inicie la imagen de dos fotones y localice nuevamente la línea media usando el objetivo 25x.Logre esto buscando la fisura longitudinal en la superficie cortical de la sección coronal. Luego, coloque el borde derecho de la pantalla de imagen en la línea media y mueva la pantalla visual lateralmente a través de tres cuadros completos. Localice la profundidad en la que los capilares son apenas visibles en la pantalla de visualización.Luego, baje el plano de enfoque otros 20 micrómetros para determinar la parte superior de la pila en z. Establezca el grosor de la imagen en un micrómetro. Baje la pantalla de visualización 100 micrómetros y ajuste la potencia del láser continuamente de modo que menos del uno por ciento de los píxeles estén sobreexpuestos.Finalmente, adquiera el z-stack. En esta figura, después de que se ha preparado la sección cerebral, se localiza un área de imagen aproximadamente a 1,5 milímetros de la línea media. Un z-stack de 100 micrómetros produce una imagen tridimensional utilizada para el análisis en el software analítico Amira.La red capilar se traza entonces manualmente colocando nodos al inicio y al final de un capilar o en cualquier punto donde un capilar se ramifica en otro. Esto produce una imagen completamente esqueletizada a partir de la cual se extraen automáticamente los parámetros morfológicos. El número de nodos capilares, segmentos, longitud media de los segmentos y la longitud total de los segmentos puede extraerse mediante imágenes ex vivo de dos fotones de cortes cerebrales de ratón.Aquí, se produce una imagen bidimensional de las redes capilares mediante imágenes in vivo, en la que se puede extraer el diámetro capilar y se puede calcular el volumen capilar total utilizando el diámetro capilar y la longitud total del segmento obtenida a partir de las imágenes ex vivo. Una vez dominado, este procedimiento puede completarse en tres horas y media si se realiza correctamente. Durante la realización de este procedimiento, es importante actuar rápidamente manteniendo al mismo tiempo un nivel constante de anestesia, ya que el isoflurano puede causar vasodilatación de los capilares corticales, lo que distorsiona los datos.Durante este procedimiento, pueden obtenerse otros parámetros capilares, como la velocidad de los glóbulos rojos o el flujo de glóbulos rojos, lo que puede proporcionar una comprensión más profunda de los cambios patogénicos observados en los trastornos neurocognitivos asociados al VIH y otras enfermedades neurodegenerativas. Buena suerte con sus experimentos.

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Source: Nishimura, C.  y cols. Cuantificación de la arquitectura vascular cerebral mediante microscopía de dos fotones en un modelo de ratón de neuroinflamación inducida por el VIH. J. Vis. Exp. (2016). Este video demuestra la visualización in vivo de los capilares corticales en el cerebro del ratón utilizando microscopía de dos fotones. Describe los pasos para inyectar un tinte fluorescente en un ratón anestesiado con una ventana cortical de cráneo delgado, preparando la configuración para la...

 Microscopía de dos fotones para la obtención de imágenes in vivo de la microvasculatura cerebral de ratón 

Fuente: Arango-Lievano, M. et. al., Imágenes longitudinales in vivo de la vasculatura cerebrológica: relevancia para las enfermedades del SNC. J. Vis. Exp. (2016)Este video demuestra imágenes in vivo de dos fotones para visualizar placas de amiloide marcadas con fluorescencia y vasculatura cerebral. La fluorescencia azul marca las placas, mientras que la fluorescencia verde resalta los vasos sanguíneos cerebrales. Un mapa 3D de la región de interés y un mosaico de imágenes de alta resolución...

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Este protocolo describe el precondicionamiento hipóxico repetitivo, o exposiciones breves a la hipoxia sistémica que reducen los volúmenes de infarto y la interrupción de la barrera hematoencefálica después de una oclusión transitoria de la arteria cerebral media en ratones. También detalla la cuantificación dual del volumen del infarto y la alteración de la barrera hematoencefálica después de un accidente cerebrovascular para evaluar la eficacia de la protección neurovascular.

Cuantificación de Protección neurovascular Siguiendo repetitivo hipóxico Precondicionamiento y transitoria cerebral media oclusión de la arteria en ratones

Este manuscrito describe un procedimiento para realizar un seguimiento de la remodelación de la vasculatura cerebral durante la acumulación de placa amiloide in vivo usando longitudinal microscopía de dos fotones. Una preparación-cráneo adelgazada permite la visualización de los tintes fluorescentes para evaluar la progresión del daño cerebrovascular en un modelo de ratón de la enfermedad de Alzheimer.

Longitudinal<em&gt; En Vivo</em&gt; Obtención de imágenes de la vasculatura cerebral: Importancia de las enfermedades del sistema nervioso central

Aquí presentamos un protocolo basado en la microscopía para la proyección de imagen de alta resolución y una reconstrucción tridimensional del ratón unidad neurovascular y barrera blood - brain con secciones libres del cerebro. Este método permite la visualización, análisis y cuantificación de los organelos intracelulares en el BBB.

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Aprende a cuantificar la arquitectura vascular cerebral mediante microscopía de dos fotones en ratones. Este método permite analizar cambios morfológicos capilares en modelos de neuroinflamación inducida por VIH.

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Cuantificación de Cerebral Vascular Arquitectura utilizando microscopía de dos fotones en un modelo de ratón de la neuroinflamación inducida por el VIH

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