Síntesis Split-y-piscina y caracterización del péptido Terciario Amida Biblioteca

El objetivo general de este procedimiento es demostrar cómo sintetizar bibliotecas combinatorias que contengan unidades de amida terciaria peptídica o unidades PTA. Esto se logra primero preparando un submonómero PTA a partir de aminoácidos naturales. El segundo paso consiste en sintetizar una región de enlazador peptídico sobre un soporte sólido.

A continuación, se sintetiza una biblioteca combinatoria que contiene subunidades de PTA y péptidos. El paso final consiste en caracterizar la biblioteca sintetizada para garantizar la calidad de la síntesis. En última instancia, se obtiene una biblioteca combinatoria que contiene subunidades de PTA con restricción conformacional, la cual puede utilizarse en cribados de alto rendimiento para obtener ligandos de proteínas y contribuir al descubrimiento de nuevos fármacos.

Por lo tanto, la química que es objeto de este artículo se desarrolló en un intento por encontrar moléculas mucho más rígidas que algunos de los péptidos y otras sustancias con las que habíamos trabajado previamente. La idea es que si se identifican bibliotecas de moléculas más rígidas, estas se unirán a dianas proteicas con afinidades mucho mayores, y consideramos que esto era muy, muy importante para tratar de desarrollar fármacos en el futuro o, incluso, moléculas sonda interesantes. La demostración visual de esta síntesis del suborden PTA es realmente fundamental, ya que la síntesis es difícil de aprender porque el control de la temperatura y del tiempo es crucial para lograr una síntesis exitosa.

Primero, agregue 8,9 gramos de dine y 11,9 gramos de bromuro de potasio a un matraz redondo de tres cuellos de 500 mililitros con una barra magnética de agitación. Luego, agregue 100 mililitros de una solución de bromuro de hidrógeno al 30% previamente preparada al matraz. Después de colocar el matraz en un baño de etilenglicol y hielo seco a menos 10 grados Celsius, burbujee argón a través de una aguja larga desde el fondo del matraz durante 10 minutos.

Agite la solución con la barra magnética a 300 RPM. A continuación, agregue una solución previamente preparada de nitrito de sodio a un embudo de adición con equilibrio de presión acoplado al matraz redondo de tres cuellos y séllelo con un septum. Abra lentamente la válvula del embudo de adición, permitiendo que la solución de nitrito de sodio gotee dentro del matraz.

Controle la válvula para ajustar la velocidad de goteo a aproximadamente dos gotas por segundo. Una vez finalizada la adición de nitrito de sodio, continúe agitando la solución durante tres horas más, permitiendo que la temperatura aumente de menos 10 grados Celsius a temperatura ambiente. Si el color de la solución es demasiado oscuro, aplique vacío para eliminar los óxidos de nitrógeno en exceso y el bromo posible generado durante la reacción.

Una vez que la solución se haya transferido a un embudo de extracción, extraiga el producto tres veces con 35 mililitros de éter de dietilo. Después de combinar la fase orgánica y lavarla con salmuera saturada, recójala en un matraz y séquela sobre sulfato de sodio durante seis horas. Tras la filtración del sulfato de sodio, evapore el disolvente al vacío para obtener un aceite claro o ligeramente amarillento.

Purifique el producto bruto mediante cromatografía en columna de gel de sílice con una mezcla de hexano y acetato de etilo en relación tres a uno. Para la marcación isotópica, disuelva 300 miligramos de L-alanina con 10 mililitros de agua deuterada en un tubo de polietileno de 50 mililitros. Después de agregar 10 miligramos de alfa-cetoglutarato como sustrato auxiliar, caliente el tubo a 37 grados Celsius. Al finalizar, ajuste el pH a entre 8,5 y 8,7 utilizando una solución de óxido de sodio 1 molar y tiras indicadoras de pH.

A continuación, agregue 0,1 miligramos de alanina transaminasa a la solución. Coloque el tubo en un incubador a 37 grados Celsius e incube durante la noche con agitación suave a 10-30 RPM. En este punto, hincha un gramo de perlas de gel de 90 micrones, 10 a 1, con enlazador Ram en 10 mililitros de dimetilformamida durante tres horas en un reactor de jeringa de 12 mililitros con agitación suave, drene la dimetilformamida del reactor y agregue 10 mililitros de solución de perina dimetilformamida al 20 %pi para desproteger el grupo FOC del enlazador amida de rink.

Después de agitar las perlas con la solución al 20 % de Pepperdine durante 30 minutos, lávelas cinco veces con dimetilformamida para eliminar todo el Pepperdine. A continuación, retire algunas perlas de la jeringa y pruébelas con una prueba de cloral. Añada dos mililitros de una solución dos molar de ácido bromoacético en dimetilformamida a las perlas y agite suavemente.

Luego, agregue dos mililitros de una solución de dicloruro de dipropilcarbodiimida en dimetilformamida dos molar a las perlas. Después de sellar la jeringa con un émbolo, agite las perlas en un agitador durante 10 minutos. Una vez que las perlas hayan sido lavadas completamente con dimetilformamida, añádales dos mililitros de una solución previamente preparada de metoxietil en dimetilformamida uno molar.

Después de agitar las perlas y lavarlas cinco veces con dimetilformamida, compruebe algunas de las perlas con una prueba de cloral. A continuación, añada 10 mililitros de una solución uno a uno de diclorometano y dimetilformamida a la jeringa utilizada previamente. Divida todas las perlas de un gramo equitativamente en tres reactores de jeringa de cinco mililitros utilizando una pipeta de 1000 microlitros con una punta de pipeta truncada.

Después de lavar las tres jeringas tres veces con clorometano, lave las jeringas etiquetadas como r y s tres veces con tetrahidrofurano anhidro, y la jeringa etiquetada como B tres veces con dimetilformamida. Para la acoplamiento de tristina con ácido bromopropanoico, agregue aproximadamente 200 miligramos de tristina a un vial en una campana extractora. Una vez que el vial haya sido tapado, pese la cantidad de tristina en el vial.

Luego, agregue la cantidad adecuada de tetrahidroferrano anhidro al vial para obtener una solución de trifenilfosgeno tetrahidroferrano de 20 miligramos por mililitro. Para preparar la mezcla de ácidos bromados con trifenilfosgeno, agregue 89 microlitros de ácido R-2-bromopropanoico y ácido S-2-bromopropanoico-D4 en dos viales pequeños por separado; a cada vial, añada cinco mililitros de la solución de trifenilfosgeno en tetrahidrofurano. Después de sellar los viales, colóquelos en un congelador a menos 20 grados Celsius durante 20 minutos.

Mientras tanto, agregue 1.125 microlitros de una solución de tetrahidrofuranodietilamina en proporción dos a uno a las jeringas r y s. Por separado, agregue 356 microlitros de 2,4,6-trimetilpurina a cada uno de los viales que contienen las mezclas enfriadas de ácidos bromo y fosgeno, obteniendo precipitados blancos. Aplique inmediatamente la suspensión correspondiente directamente sobre las perlas funcionalizadas y luego colóquelas en un agitador para agitar a 120 rpm durante dos horas.

Para la acoplación del ácido bromoacético con la diisopropilcarbodiamina, añada cinco mililitros de una solución dos molar de ácido bromoacético en dimetilformamida a la jeringa B. Después de agitar, añada cinco mililitros de una solución dos molar de diisopropilcarbodiamina en dimetilformamida a la misma jeringa y agite suavemente. A continuación, coloque la jeringa B en el mismo agitador que las jeringas R y S. Agite luego las jeringas durante dos horas, después de lavar cuidadosamente las jeringas con diclorometano y dimetilformamida. Reúna todas las perlas de las jeringas R, S y B en un reactor de jeringa de doce mililitros.

Una vez que las perlas hayan sido lavadas cinco veces con dimetilformamida, añada 10 mililitros de una solución de diclorometano y dimetilformamida uno a uno a la jeringa. Divida todas las perlas de forma uniforme en siete jeringas individuales de dos mililitros utilizando una pipeta de 1000 microlitros con una punta de pipeta truncada para la emanación, y agregue cinco mililitros de siete soluciones de amina dos molares previamente preparadas a las jeringas correspondientes. Incube las siete jeringas en un incubador a 60 grados Celsius con agitación durante la noche tras la incubación.

Lave las perlas que deben ser escindidas cinco veces con diclorometano. Después de agitar las perlas durante 15 minutos y lavarlas nuevamente con diclorometano, drene el diclorometano de la jeringa. A continuación, transfiera cada perla individual a una placa de 96 pocillos.

Utilizando un microscopio óptico y una pipeta con una punta recortada, cubra la placa de 96 pocillos con una lámina de cubreobjetos y colóquela en el congelador a menos 20 grados Celsius durante 15 minutos. Una vez que la placa haya sido retirada del congelador, agregue 20 microlitros de una solución fría previamente preparada de TFA DI clorometano uno a uno a cada uno de los pocillos que contienen una perla. Reemplace la lámina de cubreobjetos y coloque la placa de 96 pocillos en un agitador dentro del congelador a menos 20 grados Celsius.

Después de agitar durante 20 minutos, retire la placa de 96 pocillos del congelador y desprenda el cubreobjetos. Sopla para secar al aire el diclorometano de cada pocillo pasando aire sobre él. Cuando se escinde a temperatura ambiente utilizando una solución de TFA al 50 % en diclorometano, se observa una degradación significativa.

Los picos 593 y 484 corresponden al enlazador y al trímero de PTA, respectivamente, lo que indica que toda la molécula se sintetizó con éxito en la perla, pero se degradó durante la escisión. Cuando la escisión se realiza en condiciones de baja temperatura, como se describió anteriormente, la degradación inducida por TFA se suprime considerablemente. El mecanismo de escisión ha sido descrito en la literatura previa y se cree que transcurre a través de un intermedio olefínico. Las moléculas de PTA pueden secuenciarse mediante MS/MS, y el patrón de fragmentación es similar al de los péptidos.

Las moléculas de PTA sintetizadas con ácido S-dos bromo propanoico D-cuatro generalmente producen picos más anchos en MS y msm. Espectros MS debido a la presencia de productos de duración incompleta, como ácido S-dos bromo propanoico D-tres, lo cual podría utilizarse como un indicio de la presencia del centro quiral R durante el procedimiento de secuenciación. Las moléculas de PTA también tienden a formar más aductos que los péptidos. Por lo tanto, se prefiere agua con bajo contenido de sodio y equipo de plástico.

Otro subproducto potencial es la acrilamida formada por la eliminación de bromo durante la aminación. Una vez formada la acrilamida, la secuencia se termina. Esto puede resolverse reduciendo la concentración de amina primaria a un molar con el fin de disminuir la solución.

Basicidad Una vez dominada una biblioteca de buen tamaño, puede prepararse en dos días si se realiza adecuadamente. Ahora que esta química ha sido completamente desarrollada y la síntesis es bastante eficaz, espero que otros investigadores adopten esta poderosa tecnología para fabricar miméticos peptídicos con restricción conformacional para el desarrollo de fármacos y sondas.