Síntesis Split-y-piscina y caracterización del péptido Terciario Amida Biblioteca

El objetivo general de este procedimiento es demostrar cómo sintetizar bibliotecas combinatorias que contengan unidades peptídicas de medio terciario o PTA. Esto se logra preparando primero un submonómero de PTA a partir de aminoácidos naturales. El segundo paso es sintetizar una región enlazadora de péptidos en un soporte sólido.

A continuación, se sintetiza una biblioteca combinatoria que contiene subunidades de PTA y péptidos. El paso final es caracterizar la biblioteca sintetizada para garantizar la calidad de la síntesis. En última instancia, se sintetiza una biblioteca combinatoria que contiene subunidades de PTA restringidas de confirmación y dicha biblioteca se puede utilizar para el cribado de alto rendimiento para proporcionar ligandos de proteínas y conducir al descubrimiento de nuevos fármacos.

Así que la química que es el tema de este artículo se desarrolló en un intento de tratar de encontrar moléculas que fueran mucho más rígidas que algunos de los péptidos y otras cosas con las que habíamos trabajado anteriormente. La idea es que si uno identifica bibliotecas de moléculas más rígidas y se unirán a proteínas diana con afinidades mucho más altas, y pensamos que esto era muy, muy importante para tratar de desarrollar fármacos en el futuro o incluso moléculas de sonda interesantes. La demostración visual de esta síntesis de subórdenes de PTA es realmente crítica, ya que la síntesis es difícil de aprender porque la temperatura y el control de tiempo son realmente críticos para una síntesis exitosa.

Primero, agregue 8,9 gramos de dina y 11,9 gramos de bromuro de potasio a un matraz de fondo redondo de tres cuellos de 500 mililitros con una barra magnética para agitar. A continuación, añada al matraz 100 mililitros de una solución de bromuro de hidrógeno al 30% previamente preparada. Después de colocar el matraz en un tanque de etilenglicol de 10 grados centígrados negativos, el baño de hielo seco burbujea argón a través de una aguja larga desde el fondo del matraz durante 10 minutos.

Agite la solución con la barra de agitación magnética a 300 RPM. A continuación, agregue una solución de nitrito de sodio previamente preparada a un embudo de caída de ecualización de presión unido al matraz de fondo redondo de tres cuellos y séllelo con un tabique. Abra lentamente la válvula del embudo de goteo, permitiendo que la solución de nitrito de sodio gotee en el matraz.

Controle la válvula para ajustar la tasa de goteo a aproximadamente dos gotas por segundo. Una vez completada la adición de nitrito de sodio, siga revolviendo la solución durante tres horas más, permitiendo que la temperatura se caliente de menos 10 grados Celsius a temperatura ambiente. Si el color de la solución es demasiado oscuro, aplique una aspiradora para eliminar el exceso de óxidos de nitrógeno y el posible bromo generado durante la reacción.

Una vez que la solución se ha transferido a un embudo de extracción, extraiga el producto tres veces con 35 mililitros de éter datílico. Después de combinar la fase orgánica y lavar con salmuera saturada, recójala en un matraz y séquela sobre sulfato de sodio durante seis horas. Después de la filtración del sulfato de sodio, evapore el solvente al vacío para producir un aceite de color claro a amarillo pálido.

Purificar el producto crudo mediante cromatografía en columna de gel de sílice con acetato de etilo de hexano de tres a uno para el etiquetado isotópico, disolver 300 miligramos de L alanina con 10 mililitros de agua deuterada en un tubo de polietileno de 50 mililitros. Después de agregar 10 miligramos de alfa cetoglutarato como sustrato de cos, caliente el tubo a 37 grados centígrados. Cuando termine, ajuste el pH a 8.5 a 8.7 usando una solución de óxido de dute de sodio de un molar y tiras reactivas de pH.

A continuación, añada 0,1 miligramos de alanina transaminasa a la solución. Coloque el tubo en una incubadora a 37 grados centígrados e incube durante la noche con una leve agitación de 10 a 30 RPM. En este punto, hinche un gramo de 90 micras, 10 para gel con Ram linker en 10 mililitros de dimetilformamida durante tres horas en un reactor de jeringa de 12 mililitros con agitación suave, drene la dimetilformamida del reactor y agregue 10 mililitros de solución de dimetilformamida de Pi Perine al 20% para proteger el grupo FOC de la pista en medio del enlazador.

Después de agitar las perlas con la solución de Pepperdine al 20% durante 30 minutos, lávelas cinco veces con carne en forma de dimetilo para eliminar todo el Pepperdine. A continuación, retire algunas perlas de la jeringa y pruébelas con una prueba de cloral. Agregue dos mililitros de una solución de dimetilformamida de ácido bromoacético de dos molares a las perlas y agite suavemente.

A continuación, añada dos mililitros de una solución de dimetilformamida de propilcarbo diamina de dos molares a las perlas. Después de sellar la jeringa con un émbolo, agite las perlas en una coctelera durante 10 minutos. Una vez que las perlas se hayan lavado a fondo con dimetilformamida, agregue dos mililitros de una solución de metoxietil dimetilformamida molar previamente preparada.

Después de agitar las perlas y lavarlas cinco veces con dimetilformamida, revise algunas de las perlas con una prueba de cloral. Después de esto, agregue 10 mililitros de una solución de dimetilformamida de dicloral metano dimetilformamida uno a uno a la jeringa utilizada anteriormente. Divida todas las perlas de un gramo uniformemente en tres reactores de jeringa de cinco mililitros utilizando una pipeta de 1000 microlitros con una punta de pipeta truncada.

Después de lavar las tres jeringas tres veces con clorometano, lave las jeringas marcadas con r y s tres veces con hidrofurina teta anhidra, y la jeringa marcada con B tres veces con dimetilformamida. Para el acoplamiento de tristino del ácido NOIC bromo propano, agregue aproximadamente 200 miligramos de triestino a un vial en una campana extractora. Una vez que se haya tapado el vial, pese la cantidad de tristine en el vial.

A continuación, añada la cantidad adecuada de tetra hidro ferrano anhidro al vial para hacer una solución de 20 miligramos por mililitro de tetra hidroferrano de trifosgeno. Para preparar la mezcla de trifosgeno de ácidos de bromo, agregue 89 microlitros de ácido R dos Promo-Propano NOIC y S dos Promo-ácido NOICO D cuatro en dos viales pequeños por separado a cada vial, agregue cinco mililitros de la solución de tetra hidro furano Tristina. Después de sellar los viales, colóquelos en un congelador a 20 grados centígrados negativos durante 20 minutos.

Mientras tanto, agregue 1, 125 microlitros de una solución de tetra hidro furano di isopropilamina de dos a uno a la jeringa r y s. Por separado, agregue 356 microlitros de 2 4 6 trimetilpurina a cada uno de los viales que contengan las mezclas de fosfén de ácidos bromo enfriadas que producen precipitados blancos. Aplique inmediatamente la suspensión correspondiente directamente a las perlas y luego colóquelas en un agitador para agitar a menos de 120 RPM durante dos horas.

Para el acoplamiento de ácido bromoacético con diisopropil carbo diamina, agregue cinco mililitros de una solución de dimetilformamida de ácido bromoacético de dos molares a la jeringa B. Después de agitar, agregue cinco mililitros de una solución de dimetilformamida di propilcarbo diamina de dos molares a la misma jeringa y agite suavemente siguiendo esta jeringa B en el mismo agitador que la jeringa r y s. A continuación, agite las jeringas durante dos horas después de lavarlas a fondo con diclorometano y dimetilformamida. Agrupe todas las perlas de las jeringas R, s y B en un reactor de jeringa de 12 mililitros.

Una vez que las perlas se hayan lavado cinco veces con dimetilformamida, agregue 10 mililitros de una solución de diclorometano dimetilformamida uno a uno a la jeringa. Divida todas las perlas uniformemente en siete jeringas individuales de dos mililitros utilizando una pipeta de 1000 microlitros con una punta de pipeta truncada para la emanación, agregue cinco mililitros de siete soluciones de amina molar previamente preparadas a la jeringa correspondiente. Incube las siete jeringas en una incubadora a 60 grados centígrados agitándola durante la noche después de la incubación.

Lave las perlas que deben cortarse cinco veces con dicloral metano. Después de agitar las perlas durante 15 minutos y lavarlas nuevamente con di clorometano, drene el di clorometano de la jeringa. A continuación, transfiera cada cuenta individual a una placa de 96 pocillos.

Con un microscopio óptico y una pipeta con punta truncada, cubra la placa de 96 pocillos con un cubreobjetos y colóquela en el congelador a 20 grados centígrados negativos durante 15 minutos. Una vez que se haya retirado la placa del congelador, agregue 20 microlitros de una solución de clorometano TFA DI refrigerada uno a uno previamente preparada a cada uno de los pocillos que contenga una perla. Vuelva a colocar el cubreobjetos y vuelva a colocar la placa de pared 96 en una coctelera en el congelador a 20 grados centígrados negativos.

Después de agitar durante 20 minutos, retire la placa de pared 96 del congelador y retire el cubreobjetos. Seque el diclorometano de cada pozo soplando aire sobre él. Cuando se escinde a temperatura ambiente utilizando una solución de metano DICLORO al 50% de TFA, se observa una degradación significativa.

Los picos 593 y 484 corresponden al enlazador y al trímero PTA, respectivamente, lo que demuestra que toda la molécula se sintetizó con éxito en el cordón, pero se degradó durante la escisión. Cuando se escinde en condiciones de baja temperatura como se describió anteriormente, la cantidad de degradación inducida por TFA se suprime en gran medida. El mecanismo de escisión ha sido descrito en la literatura previa y se cree que pasa por una olaína Las moléculas de PTA intermedias pueden ser secuenciadas por Ms.MS, y el patrón de fragmentación es similar al de los péptidos y péptidos.

Las moléculas de PTA sintetizadas con S, dos bromo, propolo, ácido D, cuatro, generalmente dan picos más amplios en MS y MSM. Debido a la presencia de productos de duración incompleta como S dos bromo propano, ácido NOICO D tres, esto podría usarse como una indicación de la presencia del centro quiral R durante el procedimiento de secuenciación, las moléculas de PTA también tienden a formar más aductos que péptidos. Por lo tanto, se prefieren los aparatos de agua y plástico bajos en sodio.

Otro subproducto potencial es la acrilamida formada a partir de la eliminación de bromo durante la aminación. Una vez que se forma la acrilamida, se termina la secuencia. Esto se puede resolver disminuyendo la concentración de amina primaria a un molar para reducir la solución.

Una vez dominada una biblioteca de buen tamaño, se puede preparar en dos días si se realiza correctamente. Ahora que esta química se ha desarrollado por completo y que la síntesis es bastante efectiva, espero que otros investigadores adopten esta poderosa tecnología para hacer miméticos peptídicos conformacionalmente restringidos para el desarrollo de fármacos y sondas.