Desarrollo y validación de un método de PCR cuantitativa para Equid herpesvirus-2 Diagnóstico en los flujos respiratorios

El objetivo general del método qPCR es evaluar la carga viral del herpesvirus equino-2 en muestras biológicas de caballos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de diagnóstico de las enfermedades respiratorias en caballos, datos cuantitativos sobre nuevas ayudas interpretativas para los profesionales. La principal ventaja de esta técnica es que es un método sensible, específico y rápido.

Otra ventaja es el desarrollo según la norma AFNOR NF U47-600, que es el representante francés en el comité internacional de normalización. La demostradora del procedimiento estará a cargo de Erika Hue, una joven investigadora de mi unidad. Para extraer ácidos nucleicos de una muestra biológica de fluidos respiratorios, bajo una campana extractora se comienza añadiendo 140 microlitros de muestra biológica a 560 microlitros de solución de lisis y se incuba a temperatura ambiente durante 10 minutos.

Agregue 560 microlitros de etanol a la muestra y aplique 630 microlitros de la solución total a una columna de sílice y una centrífuga. Aplique los 630 microlitros restantes a la columna de sílice y vuelva a centrifugar. Después de que la muestra se haya aplicado a la columna, use 500 microlitros de cada uno de los tampones de lavado AW1 y AW2 para lavar la columna dos veces.

Luego, para eluir los ácidos nucleicos de la columna, agregue 50 microlitros de elución a temperatura ambiente o tampón AVE. Cierre la tapa e incube a temperatura ambiente durante un minuto. A continuación, centrifugar a 6.000 g durante un minuto.

Para amplificar el ADN, después de valorar los cebadores y la sonda de acuerdo con el protocolo de texto, prepare 22,5 microlitros de mezcla de reacción para cada reacción agregando 12,5 microlitros de mezcla maestra de PCR, 20 micromolares de cebadores hacia adelante y hacia atrás, 10 micromolares de la sonda y suficiente agua ultrapura según sea necesario para alcanzar 22,5 microlitros. Para evitar la contaminación, prepare siempre la mezcla de reacción PCR en un área específica. Alícuota de 22,5 microlitros de la mezcla de reacción adecuada a cada pocillo de reacción de una placa de 96 pocillos.

Incluir controles negativos para la extracción y la PCR para garantizar que ninguno de los reactivos esté contaminado con ADN no deseado. A continuación, agregue 2,5 microlitros de la muestra, el control negativo de extracción, el control negativo de PCR o la muestra de control positivo a los pocillos de reacción correspondientes. A continuación, utilice un sello adhesivo de placa para cubrir la placa.

Y centrifugar a 6.000 gs durante 10 segundos. Coloque la placa en un sistema de PCR en tiempo real. A continuación, seleccione la plantilla para el diseño del ensayo y la configuración del programa de PCR que se muestra aquí, e inicie la ejecución.

Después de transferir los datos brutos del sistema de PCR en tiempo real a una hoja de cálculo, establezca el umbral en los gráficos de amplificación por encima de la línea de base y dentro de la región de crecimiento exponencial para obtener el ciclo de umbral para cada muestra. Represente cada conjunto de estándares de puntos como una curva estándar para obtener la linealidad. A continuación, calcule el número de copias de las diferentes muestras en función de la curva estándar.

Para determinar el límite de detección de los resultados de la qRT-PCR, dispense 90 microlitros de agua ultrapura en seis tubos. Para preparar seis diluciones en serie diez veces del plásmido para dirigirse a la zona de reducción, comience transfiriendo 10 microlitros de la dilución de trabajo del plásmido al tubo con 90 microlitros de agua ultrapura. Realice un vórtice breve y centrifugue el tubo.

Luego transfiera 10 microlitros del tubo al siguiente tubo de agua. Después de vórtice y centrifugado, repita la transferencia hasta que todos los tubos de agua reciban el plásmido. Después de amplificar el ADN en las seis diluciones seriadas de diez veces como se describió anteriormente en este video, determine la zona de reducción, que es la última dilución de plásmido que produce una señal positiva y la primera dilución sin la detección.

Para preparar seis diluciones en serie dobles, dispense 25 microlitros de agua ultrapura en seis tubos. De la última dilución del plásmido que dio una señal positiva, las diluciones diez veces transfieren 25 microlitros del tubo al primer tubo de agua. Vórtice y centrifugar antes de preparar las cinco diluciones restantes como se acaba de demostrar.

Amplifique el ADN a partir de las diluciones en serie dobles como se describió anteriormente en este video. Después de amplificar el ADN de los tres ensayos independientes, calcule el número de réplicas positivas de 24 réplicas para cada nivel de concentración de plásmidos. Determine el LOD con una confianza del 95 por ciento o el LOD del 95 por ciento de PCR, que es el nivel que da como resultado la detección de 23 réplicas positivas de 24 réplicas.

Para determinar el LOD del método, prepare cinco diluciones en serie dobles, comenzando con 25 microlitros de la dilución de trabajo del plásmido, que es cuatro veces más concentrada que la última concentración de una dilución diez veces mayor que dio una señal positiva. El plásmido utilizado en la etapa de amplificación proviene de una dilución de trabajo de plásmido preparada en un área específica para evitar la contaminación. Es un paso crítico.

Transfiera 5 microlitros de cada dilución de plásmido a cuatro tubos con 135 microlitros del material de recurso negativo para obtener cuatro réplicas de los cinco patrones positivos. Lleve a cabo la extracción de las cuatro réplicas para los cinco estándares positivos y realice el procedimiento de amplificación como se describe anteriormente en este vídeo. Cuente el número de réplicas positivas de ocho réplicas para cada nivel de concentración de plásmido.

Por último, determine el método LOD, que es el último nivel en el que ocho réplicas de ocho réplicas son positivas. El método cuantitativo de RT-PCR descrito en este vídeo detecta y cuantifica el herpesvirus équido-2 en fluidos respiratorios. En este experimento, se realizaron diluciones seriadas diez veces para estimar la zona de abatimiento, que se encuentra entre las diluciones 10 a la 9ª negativa y 10 a la 10ª negativa.

El valor de PCR de LOD se determinó con una nueva dilución en serie doble en la zona de reducción. Para determinar el rango de linealidad y LOQ PCR Se utilizó el valor de LOD PCR para iniciar el rango de diluciones seriales de seis diez veces entre 2,6, el valor de LOD PCR y 260.000 copias por 2,5 microlitros de muestra. La PCR LOQ es la concentración más baja en el rango de linealidad.

La caracterización de todo el método es la validación de todos los pasos necesarios para obtener datos de qRT-PCR desde la extracción de ADN de la muestra respiratoria hasta la amplificación y cuantificación de la diana. Se evaluó y validó el rendimiento cuantitativo del método analítico completo qRT-PCR con un perfil de precisión representado en este gráfico. Las cargas del genoma viral de EHV2 en 172 muestras de hisopos nasales de caballos con trastornos respiratorios se cuantificaron como se muestra aquí.

Las cargas del genoma viral fueron mayores en los caballos jóvenes, con la carga más alta detectada entre 1,9 veces 10 a 11 copias por mililitro. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en menos de dos horas por paso de amplificación, y el total de los pasos de validación se puede realizar en menos de cuatro semanas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar evitar el riesgo de contaminación, especialmente cuando se trabaja con una solución de plásmido.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la secuenciación, para responder a preguntas adicionales, como la identificación del genoma. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar la extracción y amplificación de ADN y caracterizar sus reservas de PCR. No olvide que trabajar con muestras biológicas como patógenos puede ser extremadamente peligroso.

Siempre se deben tomar algunas precauciones, como trabajar en una capucha y un área de nivel de seguridad adaptada, mientras se realiza este procedimiento.