Desarrollo y validación de un método de PCR cuantitativa para Equid herpesvirus-2 Diagnóstico en los flujos respiratorios

El objetivo general del método de PCR cuantitativa es evaluar la carga viral del herpesvirus equino-2 en muestras biológicas de caballos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo diagnóstico de las enfermedades respiratorias en caballos, proporcionando datos cuantitativos sobre nuevas herramientas interpretativas para los médicos veterinarios. La principal ventaja de esta técnica es que es sensible, específica y rápida.

Otra ventaja es el desarrollo según la norma AFNOR NF U47-600, que es el representante francés en el comité internacional de normalización. La procedimiento será demostrado por Erika Hue, una investigadora joven de mi unidad. Para extraer ácidos nucleicos de una muestra biológica de fluidos respiratorios, bajo una campana extractora comience por añadir 140 microlitros de muestra biológica a 560 microlitros de solución de lisis e incube a temperatura ambiente durante 10 minutos.

Añada 560 microlitros de etanol a la muestra y aplique 630 microlitros de la solución total a una columna de sílice y centrifugue. Aplique los 630 microlitros restantes a la columna de sílice y centrifugue nuevamente. Después de aplicar la muestra a la columna, use 500 microlitros de cada uno de los tampones de lavado AW1 y AW2 para lavar la columna dos veces.

Luego, para eluir los ácidos nucleicos de la columna, agregue 50 microlitros de tampón de elución o tampón AVE a temperatura ambiente. Cierre la tapa e incube a temperatura ambiente durante un minuto. Luego, centrifugue a 6,000 gs durante un minuto.

Para amplificar el ADN, después de titular los cebadores y la sonda según el protocolo descrito en el texto, prepare 22,5 microlitros de mezcla de reacción para cada reacción añadiendo 12,5 microlitros de mezcla maestra de PCR, cebadores forward y reverse de 20 micromolar, sonda de 10 micromolar y la cantidad necesaria de agua ultrapura para alcanzar un volumen final de 22,5 microlitros. Para evitar contaminación, prepare siempre la mezcla de reacción de PCR en un área específica. Ali-cuote 22,5 microlitros de la mezcla de reacción adecuada en cada pocillo de una placa de 96 pocillos.

Incluya controles negativos para la extracción y la PCR para asegurarse de que ninguno de los reactivos esté contaminado con ADN no deseado. A continuación, agregue 2,5 microlitros de la muestra, del control negativo de extracción, del control negativo de PCR o de la muestra de control positivo a los pozos de reacción correspondientes. Luego use un sello adhesivo para placas para cubrir la placa.

Y centrifugue a 6.000 gs durante 10 segundos. Coloque la placa en un sistema de PCR en tiempo real. Luego seleccione la plantilla para la disposición del ensayo y la configuración del programa de PCR que se muestra aquí, y comience la corrida.

Después de transferir los datos brutos del sistema de PCR en tiempo real a una hoja de cálculo, establezca el umbral en las gráficas de amplificación por encima de la línea base y dentro de la región de crecimiento exponencial para obtener el ciclo umbral de cada muestra. Represente cada conjunto de puntos patrón como una curva estándar para obtener la linealidad. Luego, calcule el número de copias para las diferentes muestras en función de la curva estándar.

Para determinar el límite de detección de los resultados de la qRT-PCR, distribuya 90 microlitros de agua ultrapura en seis tubos. Para preparar seis diluciones seriadas diez veces del plásmido con el fin de dirigirse a la zona de reducción, comience transfiriendo 10 microlitros de la dilución de trabajo del plásmido al tubo con 90 microlitros de agua ultrapura. Vortexe brevemente y centrifugue el tubo.

Luego, transfiera 10 microlitros del tubo al siguiente tubo de agua. Después de mezclar en vórtex y centrifugar, repita la transferencia hasta que todos los tubos de agua reciban el plásmido. Después de amplificar el ADN en las seis diluciones seriadas diez veces como se describió anteriormente en este video, determine la zona de abatimiento, que es la última dilución del plásmido que produce una señal positiva y la primera dilución sin detección.

Para preparar seis diluciones seriadas por duplicado, distribuya 25 microlitros de agua ultrapura en seis tubos. Del último dilución del plásmido que dio una señal positiva en las diluciones decimales, transfiera 25 microlitros del tubo al primer tubo con agua. Vortexee y centrifugue antes de preparar las cinco diluciones restantes tal como se acaba de demostrar.

Amplifique el ADN a partir de las diluciones seriadas por duplicado como se describió anteriormente en este video. Después de amplificar el ADN de los tres ensayos independientes, calcule el número de réplicas positivas de un total de 24 réplicas para cada nivel de concentración del plásmido. Determine el LDD con una confianza del 95 por ciento o LDD 95 por ciento PCR, que es el nivel que da como resultado la detección de 23 réplicas positivas de un total de 24 réplicas.

Para determinar el LDD del método, prepare cinco diluciones seriadas por duplicado comenzando con 25 microlitros de la dilución de trabajo del plásmido que es cuatro veces más concentrada que la última concentración de una dilución decimal que dio una señal positiva. El plásmido utilizado en el paso de amplificación proviene de una dilución de trabajo del plásmido preparada en un área específica para evitar contaminación. Es un paso crítico.

Transfiera 5 microlitros de cada dilución del plásmido a cuatro tubos con 135 microlitros del material de recurso negativo para obtener cuatro réplicas de los cinco estándares positivos. Realice la extracción de las cuatro réplicas para los cinco estándares positivos y lleve a cabo el procedimiento de amplificación tal como se describió anteriormente en este video. Cuente el número de réplicas positivas entre ocho réplicas para cada nivel de concentración del plásmido.

Finalmente, determine el método del LDD, que es el último nivel en el que ocho réplicas de ocho réplicas son positivas. El método de RT-PCR cuantitativa descrito en este video detecta y cuantifica el herpesvirus equino-2 en fluidos respiratorios. En este experimento, se realizaron diluciones seriadas en factores de diez para estimar la zona de reducción, que se encuentra entre las diluciones 10 a la menos 9 y 10 a la menos 10.

El valor de LOD por PCR se determinó mediante una nueva dilución seriada por duplicado en la zona de reducción. Para determinar el rango de linealidad y el LOQ por PCR, se utilizó el valor de LOD por PCR como punto inicial para un rango de seis diluciones seriadas por factores de diez, entre 2,6, el valor de LOD por PCR, y 260 000 copias por 2,5 microlitros de muestra. El LOQ por PCR es la concentración más baja dentro del rango de linealidad.

La caracterización de todo el método es la validación de todos los pasos necesarios para obtener datos de qRT-PCR, desde la extracción de ADN de la muestra respiratoria hasta la amplificación y cuantificación del blanco. El rendimiento cuantitativo de todo el método analítico de qRT-PCR fue evaluado y validado mediante un perfil de exactitud representado en este gráfico. Las cargas del genoma viral de EHV2 en 172 muestras de hisopado nasal de caballos con trastornos respiratorios fueron cuantificadas como se muestra aquí.

Las cargas del genoma viral fueron más altas en caballos jóvenes, con la carga más alta detectada a 1,9 veces 10 a la 11 copias por mililitro. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en menos de dos horas por cada paso de amplificación, y el total de pasos de validación puede completarse en menos de cuatro semanas si se realiza adecuadamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar evitar el riesgo de contaminación, especialmente cuando se trabaja con una solución de plásmido.

Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la secuenciación para responder preguntas adicionales, como la identificación del genoma. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la extracción y amplificación de ADN y de cómo caracterizar sus productos de PCR. No olvide que trabajar con muestras biológicas como patógenos puede ser extremadamente peligroso.

Siempre se deben tomar algunas precauciones, como trabajar en una campana extractora y en un área con nivel de seguridad adaptado, al realizar este procedimiento.