Los centrosomas de imagen en Fly Testículos

El objetivo general de este procedimiento es utilizar marcadores centrosomales marcados genéticamente para detectar nuevas mutaciones genéticas y descubrir la función de los genes centrosomales recién identificados. Esto se puede lograr mediante tres estrategias de imagen diferentes. Seguimiento de imágenes de testículos vivos, seguimiento B, fijación química de los testículos o tinción inmunológica de seguimiento C.

El primer paso del procedimiento es aislar los testículos de las moscas que expresan proteínas somales centris marcadas genéticamente, lo que puede ser seguido por imágenes inmediatas. El segundo paso es fijar químicamente los testículos, lo que también puede ir seguido de una toma de imágenes. En tercer lugar, los testículos se pueden teñir inmunológicamente y luego obtener imágenes de ellos.

En última instancia, las ubicaciones de las proteínas centri se identifican mediante microscopía de fluorescencia. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la zona central, como las bases moleculares de la formación central, la elongación central y la separación central. Comience por aislar los testículos de Drosophila como se detalla en la publicación de JoVE 2 6 4 1.

Después de aislar los testículos, sumerja la muestra en seis microlitros de tampón de tinción a temperatura ambiente recién preparado en un portaobjetos de microscopio de vidrio cargado positivamente. Espere 10 minutos, luego lave suavemente el exceso de DPI reemplazando el tampón de tinción dos veces. Con seis microlitros de PBS.

Tenga cuidado de no lavar los testículos. Retire las soluciones del portaobjetos usando un trozo de papel de filtro para absorberlo. Los volúmenes de seis microlitros funcionan bien para cubreobjetos de 18 milímetros cuadrados.

Ahora ayuda usar un bisturí afilado para perforar los testículos cerca del tipo de célula de interés, y esto minimiza la presión sobre estas células durante el paso de aplastamiento. A continuación, coloque con cuidado un cubreobjetos encima de la muestra y séllela con esmalte de uñas. A continuación, marque la posición de los testículos en el portaobjetos con un bolígrafo y proceda a la toma de imágenes.

Después de aislar los testículos, sumérjalos en una gota de seis microlitros de PBS sobre un portaobjetos de microscopio de vidrio cargado positivamente. Oriente manualmente los testículos de forma lineal o como se prefiera. A continuación, utilice un trozo de papel de filtro para absorber el PBS y sustituirlo por seis microlitros de tampón fijo recién preparado.

Después de cinco minutos en el tampón fijo, séquelo con un trozo de papel de filtro. Ahora sumerja la muestra en seis microlitros de tampón de tinción DPI recién preparado durante 10 minutos. Lave el DPI reemplazándolo con dos volúmenes de seis microlitros de PBS.

A continuación, coloque con cuidado un cubreobjetos de 18 milímetros cuadrados encima de la muestra y séllelo con esmalte de uñas. A continuación, marque la ubicación de los testículos en el portaobjetos y proceda con la toma de imágenes. Para este procedimiento, primero prepare algunos cubreobjetos siliconados.

Primero, sumerja los cubreobjetos en una pequeña bandeja de solución siliconada durante un minuto a temperatura ambiente debajo de una campana extractora, asegúrese de que los cubreobjetos estén completamente expuestos y no estén apilados uno encima del otro. A continuación, lave los cubreobjetos tres veces en agua durante un minuto por lavado. A continuación, realice tres lavados de un minuto en etanol al 70% y un último lavado de un minuto en agua.

A continuación, deje que los cubreobjetos siliconados se sequen al aire bajo una campana extractora. Después de diseccionar varios testículos y grabar un portaobjetos con el tipo de muestra, agregue cinco microlitros de PBS al cubreobjetos siliconado y transfiera los testículos a la gota de PBS. Se necesitan varios cubreobjetos, cada uno con un solo testículo, para garantizar el éxito.

A continuación, bajo un microscopio de disección, perfore cuidadosamente cada uno de los testículos como se demostró anteriormente. Ahora, coloque suavemente un microscopio de vidrio cargado positivamente. Deslícelo sobre el cubreobjetos, permitiendo que el PBS se disperse uniformemente entre el cubreobjetos y el portaobjetos.

A continuación, absorbe el exceso de tampón entre el cubreobjetos y la corredera, lo que aumentará la presión sobre los testículos y los aplastará. Ahora deje caer el portaobjetos preparado en nitrógeno líquido. Ahora se pueden preparar más correderas y agregarlas al tanque.

Antes de proceder con pinzas grandes, retire uno de los portaobjetos del nitrógeno líquido y utilice rápidamente un bisturí para retirar el cubreobjetos. El espécimen debe permanecer en el portaobjetos mientras se retira el cubreobjetos del espécimen. Tenga cuidado de no untarlo a lo largo de la superficie del portaobjetos S.

Esto se puede lograr usando un bisturí para quitar la cubierta con un movimiento rápido. Ahora incube los portaobjetos en un frasco de vidrio lleno de metanol. Enfriar a menos 20 grados centígrados durante 15 minutos.

Después de la incubación, transfiera los portaobjetos a un frasco que contenga acetona. Se enfría a menos 20 grados centígrados después de 30 segundos en la acetona. Lave los portaobjetos durante un minuto en PBS a temperatura ambiente.

A continuación, incube los portaobjetos durante 10 minutos en PBST recién preparado para bloquear sitios no específicos Durante la incubación de PBS TB, llene los pocillos de una cámara de humedad con agua Después de 10 minutos, retire los portaobjetos del PBST y seque cada portaobjetos alrededor de la muestra. Tenga cuidado de no secar la muestra en sí. A medida que se seca cada portaobjetos.

Colócalo en la cámara de humedad. Es importante secar el área del portaobjetos que rodea la muestra antes de agregar la solución de anticuerpos. Esto asegura que el anticuerpo permanezca localizado en la muestra, evitando así el secado durante la etapa de incubación.

A continuación, deje caer suavemente 100 microlitros de anticuerpo primario diluido en P-B-S-T-B-R recién preparado sobre las muestras. Use una dilución de uno a 200 para anticuerpos no caracterizados. A continuación, coloque una pieza cuadrada de un centímetro de paraforma encima de la muestra para esparcir la solución de anticuerpos y proteger la solución de anticuerpos de la evaporación.

Deje que los especímenes se incuben durante una hora a temperatura ambiente. Después de una hora, use fórceps para quitar suavemente la paraforma de los portaobjetos. A continuación, lave los portaobjetos tres veces en PBST a temperatura ambiente durante cinco minutos por lavado.

A continuación, transfiera los portaobjetos a la cámara de humedad con la muestra hacia arriba, añada suavemente 100 microlitros de anticuerpo secundario diluido en PBST, BR sobre las muestras. Al igual que antes, aplique paraform y espere una hora para lavar el secundario con tres lavados de cinco minutos en PBST y luego tres lavados de cinco minutos en PBS. A continuación, seque con cuidado los portaobjetos sin tocar las muestras.

Agregue seis microlitros de medios de montaje y aplique un cubreobjetos estándar. Después de sellar el cubreobjetos con esmalte de uñas y marcar la posición de los testículos, proceda con la toma de imágenes. Los centrosomas sufren múltiples transformaciones morfológicas y funcionales a lo largo de la espermatogénesis.

Un proceso fácilmente observable es la elongación del centrosoma en la espermatogonia, el marcador LAR ANA one GFP marca el ole de 0,6 micras de largo, este ole se alarga durante la espermatogénesis y alcanza una longitud de 2,5 micras en espermátidas casi maduras. Dado que los aceites centri de los espermatozoides de Drosophila son excepcionalmente largos, las imágenes se pueden utilizar para hacer afirmaciones cuantitativas sobre la elongación del centrosoma. En comparación con la morfología del tipo salvaje, se han identificado varias mutaciones que alteran el crecimiento central.

Dos ejemplos son siempre las mutaciones tempranas y cañonazadas que detienen la espermatogénesis antes del inicio de la meiosis, pero no bloquean la elongación de los espermatocitos maduros en estos mutantes: los aceites de los espermatocitos maduros crecen hasta unas 2,4 micras en comparación con los aceites de las células de control, que alcanzan una longitud máxima de 1,8 micras. Una vez masterizada, la pista A se puede hacer en 20 minutos, la pista B en 30 minutos y la pista C en tres a cinco horas, dependiendo del tamaño de la muestra. Después de ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo obtener imágenes del centrosoma en vuelo.