Name: Control espacial y Temporal de la activación de células T con un agonista de la Photoactivatable (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Aprende a activar linfocitos T con control espaciotemporal mediante péptido-MHC fotoactivable. Este método permite estudiar la transducción de señales localizadas y las respuestas celulares polarizadas en inmunología.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a los miembros del laboratorio de Huse para asesoramiento y asistencia. El apoyo de los Estados Unidos institutos nacionales de salud (R01-AI087644 a M.H.) y P30-CA008748 al Memorial Sloan-Kettering Cancer Center.

1. preparación de superficies de vidrio estimulante
<ol><li>Cubre-objetos de capa bien ocho cámara con biotinilado poli-l-lisina (Bio-PLL) diluyen 1: 500 en agua destilada, desionizada (ddH2O). Incubar durante 30 min a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Lavado con H2O.</li>
	<li>Secado por 2 h a TA.</li>
	<li>Bloque de Bio-PLL cubrió superficies con solución amortiguadora de bloqueo (HEPES-solución salina con tampón [10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl], con 2% BSA) por 30 min a TA.<ol>
<li>Disolver 5 mg de bromhidrato de poli-l-lisina en 1 mL de 10 mM NaPO4, pH 8.5.</li>
		<li>Añadir 125 μmol (0,55 mg) del NHS-biotina (de un stock de 100 mg/mL en DMSO) y compruebe el pH de la reacción. Si el pH está por debajo de 8.5, añadir 2 μL de 4 N NaOH para elevarla a entre pH 8.5 y 9.5.</li>
		<li>Vortex durante 30 minutos.</li>
		<li>Calmar la reacción con 50 μL de 100 mM glicina disuelta en 20 mM Tris de pH 8,0.</li>
		<li>Girar a plena potencia durante 10 minutos y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. Nota: Calidad de Bio-PLL es típicamente comparado con anteriores preparaciones por capa dos diluciones en serie del material sobre una placa de ELISA de 96 pocillos y cuantificar el contenido de biotina tras incubación con fosfatasa alcalina unida estreptavidina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retire el amortiguador de bloqueo. No permita que los pozos se sequen. Añadir estreptavidina (100 μg/mL en solución amortiguadora de bloqueo). Incubar durante 1 h a 4 ° C.</li>
	<li>Lave en HBS. Llenar e invierta pozos de diapositiva de cámara 4 - 5 veces, quitando HBS de los pozos. No permita que los pozos se sequen.</li>
	<li>Añadir el biotinilado pMHC ligandos y moléculas de adhesión a la superficie. Nota: MCC y los óvulos pueden ser photocaged mediante la adición de ortho-Nitrobencilo basado en grupos de protección (por ejemplo, nitrophenylethyl (NPE) o nitroveratryloxycarbonyl (NVOC)) para el grupo ε-amino de lisinas claves (K12 en MCC, K7 en OVA). Photocaged MCC y los óvulos pueden obtenerse de proveedores comerciales. Después de la reconstitución en buffer acuoso, ellos son replegados en bacteriano expresada-Ek y H2-Kb utilizando enfoques establecidos11,12.</li>
	<li>Validación del péptido MCC o OVA photoactivatable<ol>
<li>Decage péptidos NVOC protegido por irradiación UV con una lámpara UV de mano (véase Tabla de materiales) por 20 min a TA.</li>
		<li>Pulso 1.0 x 105 vehículos blindados con 1 μm de péptido nonstimulatory (control negativo, por ejemplo, Hb), irradiados photoactivatable péptido péptido photoactivatable irradiado y péptido de agonista (control positivo, por ejemplo, MCC) durante 1 h a durante la noche a 37 ° C.</li>
		<li>Para estimular células T expresando el C. 5 C7/2B4/y TCR, uso CH12 o células B CH27. Para estimular las células de T de OT1, utilizar RMA-s o EL4 thymoma células.</li>
		<li>Mezclar el APCs pulsadas con igual número de células T en 96 pocillos redondos placas de fondo en un volumen final de 200 μl. incubar a 37 ° C durante 12-24 h.</li>
		<li>Recuperar el sobrenadante de cada pozo y analizar IL-2 por ELISA con detección colorimétrica de peroxidasa estreptavidina-rábano. Nota: Se recomienda confirmación del estado de los péptidos por espectrometría de masas por electrospray antes refolding en complejos de MHC, jaulas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realizar el plegado y la purificación de MHC con el fin de minimizar la exposición a la luz. Por ejemplo, envuelven reacciones de plegamiento de papel de aluminio y llevar a cabo cromatografía de gel filtración con la lámpara Ultravioleta de. Nota: Se ha encontrado photoactivatable MCC-Ek y OVA - H2-Kb inducir la activación de células T independientes de UV en alta densidad, posiblemente debido a la incompleta jaulas funcional. Por lo tanto, la photoactivatable pMHC se diluye en un 10-30 x exceso de pMHC nonstimulatory (e.g. -Ek que contiene el péptido de64-76 de hemoglobina (Hb)) durante la etapa de inmovilización. Esto mejora la relación señal a ruido del experimento de imágenes posteriores.</li>
	<li>Para Fotoactivar CD4+ T las células, colectivamente utilizan una mezcla de biotinilado Hb-Ek (3 μg/mL), biotinilado photoactivatable MCC-Ek (0,1 μg/mL) y el anticuerpo biotinilado contra la clase I MHC H2-Kk (0,5 μg / mL). los anticuerpos de anti-H2-Kk anima a 5 C. C7/2B4/y T las células, que expresan H2-Kk, extender sobre la superficie de vidrio sin sufrir activación.</li>
	<li>Para CD8+ T células, use una mezcla de biotinilado H2 Db teniendo el péptido KAVYDFATL (1 μg/mL), biotinilado photoactivatable OVA-H2-Kb (0,1 μg/mL) y el dominio extracelular de la molécula de adhesión ICAM-1 (2 μg/mL producido por insectos de la célula cultura13). El ICAM-1 favorece la formación contacto cercana enganchando la integrina LFA1 en la superficie de la célula de T.</li>
	<li>Aplicar todas las mezclas de proteínas en solución amortiguadora de bloqueo, seguido por incubación durante 1 h a temperatura ambiente o por lo menos 2 h a 4 ° C. Nota: La densidad molecular en las superficies de este tipo que ~ 8000 por μm2 ha sido previamente6. Que pMHC photoactivatable representa ~1/30to de la proteína biotinilada en la superficie, su densidad será ~ 267 moléculas por μm2, antes de decaging.</li>
	<li>Lavar como en el paso 1.6 y deje en HBS hasta que esté listo para usar.</li>
	<li>Añadir 200.000 CD4+ o CD8+ T expresan el TCR adecuado en cada pocillo de las células y permitir que las células se adhieran a 37 ° C durante 15 minutos. Una vez las células se han unido a la extensión en la superficie, están listos para la fotoactivación y proyección de imagen. Nota: Transducción Retroviral de células efectoras T con fluorescente puntas de prueba de la proyección de imagen se describe en detalle cordón6,7. Señalización de calcio también se puede estudiar usando las células de T untransduced con el tinte sensible del calcio Fluo-46. El tinte radiométrica Fura-2 no se recomienda porque requiere excitación en el rango de UV, que también induce la decaging de la photoactivatable pMHC.</li>
</ol>2. adquisición de la imagen
<ol><li>Usar un microscopio TIRF invertido con un objetivo X UV 150 compatible para la adquisición de la imagen. UV irradiar regiones definidas por el usuario mediante un sistema de diafragma digital conectado a una lámpara de mercurio de 100 W (HBO). Luz de esta lámpara sobre la muestra utilizando un espejo de pase largo 400 nm UV directa.</li>
	<li>Utilizar software de análisis de imagen para la fotoactivación localizada y adquisición de Time-lapse. En la mayoría de los experimentos, controlar las puntas de prueba en los canales rojos y verdes con 488 nm y 561 láseres de excitación nm, respectivamente. Luz láser se dirige sobre la muestra utilizando un espejo dicroico de doble banda que transmite también en la gama ultravioleta (para decaging). Por favor vea la Tabla de materiales y la figura 6 para obtener información adicional sobre la configuración del microscopio.</li>
	<li>Después de montar el portaobjetos de la cámara que contiene las células de T, ajuste la configuración para obtener iluminación TIRF o epifluorescencia, según sea necesario. En modo live, seleccione el campo de las células que están expresando la sonda fluorescente de interés. Establecer regiones de microescala para la fotoactivación por debajo de las células individuales utilizando el software de control.</li>
	<li>Comenzar la adquisición de Time-lapse. Por lo general, se adquieren los puntos de 80 tiempo, con un intervalo de 5 s entre cada punto del tiempo. Esto deja tiempo más que suficiente para secuencial 488 nm y 563 exposiciones nm, en el caso de los experimentos de doble color.</li>
	<li>Después de 10 puntos de tiempo, Fotoactivar las regiones seleccionadas al abrir el diafragma digital del obturador de 1-1.5 s.</li>
	<li>Una vez finalizado el lapso de tiempo, seleccione un nuevo campo de las células y repetir el proceso.</li>
</ol>3. Análisis de los datos
Nota: Fotoactivación localizada de ligandos inmovilizados crea una región estimuladora bien definida y estacionaria, que puede utilizarse para el análisis cuantitativo de la señalización de las respuestas y eventos remodelación citoesqueleto. Análisis de protocolos generalmente involucran cuantificación de la intensidad de fluorescencia dentro de la región irradiada o utilizando la región irradiada como un extremo posicional para medidas de distancia (ej. para evaluar la polarización del centrosoma a la irradiado a región). A continuación se describen ambos protocolos de análisis. Varios programas de análisis de imagen interactiva pueden utilizarse para hacer intensidad y medidas de la distancia, que pueden ser salida de procesamiento adicional y análisis.
<ol><li>
Intensidad de fluorescencia
	<ol>
<li>Determinar la intensidad de fluorescencia (FI) de una región de fondo fuera de la célula (FIb). Esto se utilizará para la corrección de fondo.<ol>
<li>Dibuja una región cuadrada de tamaño micrométrico fuera de la célula y hacer una máscara. Para determinar la intensidad de fluorescencia, haga clic en analizar | Estadísticas de la máscara. Seleccione Intensidad de fluorescencia media y los valores de exportación. Nota: Ver detalles de procedimiento (p. ej. 3.1.1.1) software Slidebook (véase Tabla de materiales). Aplicación del presente Protocolo con otros paquetes de software (por ej., FIJI) será ligeramente diferente.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Determinar la FI dentro de la región de fotoactivado para cada punto del tiempo.<ol>
<li>Seleccione máscara para resaltar la región que se fotoactiva. Para determinar la intensidad de fluorescencia, haga clic en analizar | Estadísticas de la máscara. Seleccione Intensidad de fluorescencia media y los valores de exportación.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Restar el fondo FI de los valores medidos de FI dentro de la región. Entonces, normalizar las mediciones de FI corregidas dividiendo por la media, antecedentes corrección FI de los primeros 9 marcos antes de fotoactivación. ΔF/F = ((FI-FIb)/mean(FI1-9)-FIb)). Nota: El gráfico ΔF/F como una función del tiempo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Distancia
	<ol>
<li>Obtener x e y coordenadas del centro de la región de fotoactivado.<ol>
<li>Para determinar x e y coordenadas del centro de la región de Fotoactivado, seleccione máscara para resaltar la región que se fotoactiva. Una vez que se destaca la región de fotoactivación, seleccione analizar | Estadísticas de la máscara | Centro de zona y los valores de exportación.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Determinar x e y las coordenadas de la punta de prueba fluorescente de interés para cada momento. Esto se logra normalmente a través de rastreo de partículas ya sea manual o automatizado.<ol>
<li>Para determinar x e y coordenadas de la punta de prueba fluorescente de interés, seleccione Manual de seguimiento de partículas y haga clic en la punta de prueba fluorescente de interés con el tiempo. Una vez que han sido rastreados todos los puntos de tiempo, seleccione analizar | Estadísticas de la máscara | Centro de zona y los valores de exportación.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Calcular la distancia entre la proteína fluorescente de interés y el centro de la región de fotoactivado para cada punto del tiempo usando la ecuación: distancia = √ ((x2- x1)2+ (y2-y1)2), en que x2 y y2 son las coordenadas de la proteína fluorescente de interés y x1 y y1 son las coordenadas del centro de la región de fotoactivado.</li>
		<li>Gráfico de la distancia en función del tiempo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+structure+and+function+of+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.Perspect.Biol%22%5BJournal%5D)">Understanding the structure and function of the immunological synapse.</a> Cold Spring Harb.Perspect.Biol. 2, a002311(2010).</li>
<li>Liu, X., Huse, M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-319-14463-4_11">Immunological Synapse Formation: Cell Polarity During T Cell-APC Interaction.</a> Cell Polarity 1. , 247-275 (2015).</li>
<li>Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+actin+polymerization+drives+T+cell+receptor-induced+spreading%3A+A+role+for+the+signal+transduction+adaptor+LAT%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: A role for the signal transduction adaptor LAT.</a> Immunity. 14, 315-329 (2001).</li>
<li>Dustin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+Function+of+the+Immunological+Synapse+from+Studies+with+Supported+Planar+Bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Current+topics+in+microbiology+and+immunology%22%5BJournal%5D)">Insights into Function of the Immunological Synapse from Studies with Supported Planar Bilayers.</a> Current topics in microbiology and immunology. 340, (2010).</li>
<li>Chauveau, A., Le Floc'h, A., Bantilan, N. S., Koretzky, G. a, Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diacylglycerol+kinase+%CE%B1+establishes+T+cell+polarity+by+shaping+diacylglycerol+accumulation+at+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Signal%22%5BJournal%5D)">Diacylglycerol kinase α establishes T cell polarity by shaping diacylglycerol accumulation at the immunological synapse.</a> Sci. Signal. 7, ra82(2014).</li>
<li>Huse, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+Temporal+Dynamics+of+T+Cell+Receptor+Signaling+with+a+Photoactivatable+Agonist%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Spatial and Temporal Dynamics of T Cell Receptor Signaling with a Photoactivatable Agonist.</a> Immunity. 27, 76-88 (2007).</li>
<li>Quann, E. J., Merino, E., Furuta, T., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+diacylglycerol+drives+the+polarization+of+the+microtubule-organizing+center+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Localized diacylglycerol drives the polarization of the microtubule-organizing center in T cells.</a> Nat Immunol. 10, 627-635 (2009).</li>
<li>Basu, R., Chen, Y., Quann, E. J., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+variable+hinge+region+of+novel+PKCs+determines+localization+to+distinct+regions+of+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The variable hinge region of novel PKCs determines localization to distinct regions of the immunological synapse.</a> PLoS One. 9, 1-8 (2014).</li>
<li>Liu, X., Kapoor, T. M., Chen, J. K., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diacylglycerol+promotes+centrosome+polarization+in+T+cells+via+reciprocal+localization+of+dynein+and+myosin+II%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Diacylglycerol promotes centrosome polarization in T cells via reciprocal localization of dynein and myosin II.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 11976-11981 (2013).</li>
<li>Quann, E. J., Liu, X., Altan-Bonnet, G., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cascade+of+protein+kinase+C+isozymes+promotes+cytoskeletal+polarization+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A cascade of protein kinase C isozymes promotes cytoskeletal polarization in T cells.</a> Nat. Immunol. 12, 647-654 (2011).</li>
<li>Boniface, J. J., Reich, Z., Lyons, D. S., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamics+of+T+cell+receptor+binding+to+peptide-MHC%3A+evidence+for+a+general+mechanism+of+molecular+scanning%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Thermodynamics of T cell receptor binding to peptide-MHC: evidence for a general mechanism of molecular scanning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 11446-11451 (1999).</li>
<li>Garboczi, D. N., Hung, D. T., Wiley, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA-A2-peptide+complexes%3A+refolding+and+crystallization+of+molecules+expressed+in+Escherichia+coli+and+complexed+with+single+antigenic+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">HLA-A2-peptide complexes: refolding and crystallization of molecules expressed in Escherichia coli and complexed with single antigenic peptides.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 3429-3433 (1992).</li>
<li>Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+use+two+directionally+distinct+pathways+for+cytokine+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion.</a> Nat. Immunol. 7, 247-255 (2006).</li>
<li>Abeyweera, T. P., Merino, E., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+signaling+blocks+activating+receptor+clustering+and+induces+cytoskeletal+retraction+in+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Inhibitory signaling blocks activating receptor clustering and induces cytoskeletal retraction in natural killer cells.</a> J. Cell Biol. 192, 675-690 (2011).</li>
<li>Nguyen Duc, T., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Generalizable+Platform+for+the+Photoactivation+of+Cell+Surface+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">A Generalizable Platform for the Photoactivation of Cell Surface Receptors.</a> ACS Chem. Biol. 10, 2435-2440 (2015).</li>
<li>Airan, R. D., Thompson, K. R., Fenno, L. E., Bernstein, H., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporally+precise+in+vivo+control+of+intracellular+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Temporally precise in vivo control of intracellular signalling.</a> Nature. 458, 1025-1029 (2009).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+chemokine+receptor+signal+and+T-cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of chemokine receptor signal and T-cell migration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 111, 6371-6376 (2014).</li>
<li>Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+control+of+cell+signalling+using+a+light-switchable+protein+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction.</a> Nature. 461, 997-1001 (2009).</li>
<li>Guntas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+an+improved+light-induced+dimer+%28iLID%29+for+controlling+the+localization+and+activity+of+signaling+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Engineering an improved light-induced dimer (iLID) for controlling the localization and activity of signaling proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 112-117 (2015).</li>
<li>Wu, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+photoactivatable+Rac+controls+the+motility+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells.</a> Nature. 461, 104-108 (2009).</li>
<li>Pathak, G. P., Vrana, J. D., Tucker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+cell+function+using+engineered+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+cell%2Funder+auspices+Eur.+Cell+Biol.+Organ%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of cell function using engineered photoreceptors.</a> Biol. cell/under auspices Eur. Cell Biol. Organ. 105, 59-72 (2014).</li>
<li>Grusch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporally+precise+activation+of+engineered+receptor+tyrosine+kinases+by+light%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporally precise activation of engineered receptor tyrosine kinases by light.</a> EMBO J. 33, 1713-1726 (2014).</li>
<li>Yi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome+repositioning+in+T+cells+is+biphasic+and+driven+by+microtubule+end-on+capture-shrinkage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Centrosome repositioning in T cells is biphasic and driven by microtubule end-on capture-shrinkage.</a> J. Cell Biol. 202, 779-792 (2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En los últimos años, la luz ha surgido como una excelente herramienta para la activación spatiotemporally controlada de procesos celulares. Diversas metodologías se han desarrollado, cada uno con desventajas y ventajas asociadas. El sistema descrito aquí, que se basa en la decaging de ligandos inmovilizados, extracelulares, es ideal para el análisis de las respuestas de señalización rápidas, subcelulares, polarizados. Este enfoque se ha aplicado para examinar la formación es en las células T como se describió anteriormen...

Los linfocitos T (células T) juegan un papel central en la inmunidad celular mediante el reconocimiento de péptidos antigénicos en el contexto de la superficie de la célula MHC. Reconocimiento del antígeno, que es mediada por el TCR, conduce a la diferenciación de células ingenuas T y promueve la entrega de respuestas citolíticas y comunicativas por poblaciones efectoras. Participación de TCR también induce cambios dramáticos en la arquitectura celular. Dentro de minutos, las células T gloms sobre el lado de la célula presentadora de antígeno (APC), formando una interfaz polarizada conocida como sinapsis inmunológica (es) de1,2. LA potencia respuestas de células T efectoras habilitando la direccional liberación de citoquinas o, en el caso de los linfocitos T citotóxicos (CTLs), proteínas líticas que destruyen el APC.
Participación de TCR por pMHC induce la fosforilación rápida de múltiples moléculas de adaptador aguas abajo, incluyendo a Linker para las activación de las células T (LAT), que en última instancia promueve fuerte remodelación del citoesqueleto sináptico2. Cortical actinia filamentosa (F-actina) unidades de la célula de T que se separa sobre la superficie de la APC y entonces se resuelve en una estructura anular, caracterizada por la acumulación de la F-actina en la periferia es y agotamiento del centro. Formación del anillo de F-actina se acopla firmemente a la reorientación del centro organizador de microtúbulos (MTOC, también llamado centrosoma en las células de T) a una posición justo debajo del centro de la interfaz. Ambos eventos ocurren dentro de minutos del reconocimiento del antígeno inicial y establecen el contexto arquitectónico en que eventos posteriores de activación y efectora se producen las respuestas.
Para estudiar es formación, varios laboratorios han desarrollado enfoques que la APC se sustituirá por una superficie de vidrio que contiene ligandos inmovilizados de TCR o apoya una bicapa lipídica que sí mismo contiene los ligandos3,4. Las células T forman contactos es-como en estas superficies que pueden ser reflejadas por el microscopio de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) o microscopía confocal, lo que permite estudios de alta resolución de activación temprana de la célula de T y es la formación.
Aunque estos enfoques han permitido la visualización excelente del totalmente montado, gran parte de la ligadura de TCR:pMHC siguiente señalización ocurre dentro de segundos, que complica los esfuerzos para determinar la secuencia de eventos después de la activación del TCR con precisión . Para evitar este problema, se ha desarrollado un enfoque de fotoactivación, que pMHC photoactivatable se utiliza para lograr un control spatiotemporal de TCR activación5,6,7. En este sistema, las células T se unen a las superficies de vidrio que contienen pMHC photoactivatable que es no estimulantes para el TCR hasta irradiados con luz ultravioleta (UV). La radiación UV de una región de micras de tamaño de la superficie debajo de la célula T quita la photocage crear una zona estimulante que puede ser reconocida por la célula de T. Posteriores eventos de señalización y remodelación citoesqueleto entonces son monitoreados utilizando reporteros fluorescentes genéticamente codificados. Dos versiones de photoactivatable de péptidos antigénicos, polilla citocromo c88-103 (MCC) y ovoalbúmina257-264 (OVA), que se presentan en el contexto de la clase II MHC-Ek y la clase I MHC H2-Kb, respectivamente, han sido desarrollados (figura 1). Esto permite el análisis de ambos CD4+ T las células específicas para MCC-Ek (expresando lo 5 C. C7, 2B4, o y TCR) y CD8+ T las células específicas para OVA-H2-Kb (expresan el TCR de OT1).
En la última década, el enfoque de fotoactivación y proyección de imagen de TCR se ha utilizado para establecer la cinética precisa de TCR primeros pasos de señalización y también para identificar las vías moleculares que regulan la remodelación citoesqueleto polarizados5, 6 , 7 , 8 , 9 , 10. por ejemplo, el ensayo era instrumental en la determinación de que el centrosoma reorientación hacia la APC está mediado por un gradiente localizado de lo lípidos segundo mensajero diacilglicerol centrada en el es. Se prevé que esta metodología seguirá siendo valioso para aplicaciones que exigen análisis proyección de imagen de alta resolución de la función de la célula de T.

<table><tbody><tr><td>Nunc Lab-Tek Cubreobjetos con cámara</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>155361</td><td></td></tr><tr><td>Hidrobromuro de poli-L-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td>Necesitará hacer Poly-L-Lisina biotinilada</td></tr><tr><td>EZ-Link NHS-Biotin</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>20217</td><td>Necesitará hacer Poly-L-Lisina estreptavidina biotinilada</td></tr><tr><td></td><td>Thermofischer Scientific 434301</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BirA-500: Kit de reacción estándar BirA biotina-proteína ligasa</td><td>Avidity</td><td>BirA500</td><td>Se utilizará para biotinilar proteínas</td></tr><tr><td>Biotiniladas Hb I-EK&nbsp; </td>Para el plegamiento de <td></td><td></td><td>proteínas, ver referencia 6. Para la biotinilación, utilice el kit BirA</td></tr><tr><td>Biotinylated NPE-MCC I-EK&nbsp; </td><td>Anaspec</td><td></td><td>Custom NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH) se puede comprar en Anaspec</td></tr><tr><td>Biotinylated &alpha; El anticuerpo H2-Kk</td><td>BD Biosciences</td><td>553591</td><td></td></tr><tr><td>NPE-OVA biotinilado H2-Kb</td><td>Anaspec</td><td></td><td>Custom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) se puede comprar en Anaspec</td></tr><tr><td>Biotinylated KAVY H2-Db&nbsp;</td><td>La</td><td>proteína sintetizada personalizada Anaspec (KAVYDFATL) se puede comprar en Anaspec</td>Biotinylated ICAM1&nbsp;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Para el plegamiento de proteínas, consulte la referencia en el protocolo. Para la biotinilación, utilice el kit BirA</td></tr><tr><td>Lámpara UV de mano</td><td>UVP</td><td>UVGL-25</td><td>La lámpara se sostiene a < 1 cm de la muestra.&nbsp; 30 s de luz 365 son suficientes para el decaje detectable, 20 min para el decaje cuantitativo.</td></tr><tr><td>Sistema Olympus IX-81 OMAC TIRF.</td><td>Olympus</td><td></td> Puede <td>encontrar información adicional sobre el sistema de imágenes en Figura 6</td></tr><tr><td>Mosaic digital Diafragma</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slidebook software</td><td>Intelligent Imaging Innovations</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

control espacial y temporal de la activación de células t con un agonista de la photoactivatable

Spatial and Temporal Control of T Cell Activation Using a Photoactivatable Agonist

Los linfocitos T participan en la señalización rápida, polarizado, que ocurre dentro de minutos después de la activación del TCR. Esto induce la formación de la sinapsis inmunológica, una ensambladura del estereotipado de la célula que regula la activación de la célula de T y direccionalmente apunta las respuestas efectoras. Para estudiar con eficacia estos procesos, es necesario un enfoque imagen adaptado para capturar respuestas rápidas, polarizadas. Este protocolo describe un sistema, que se basa en un photoactivatable péptido mayor complejo de histocompatibilidad (pMHC) que es no estimulante hasta que se expone a la luz ultravioleta. Decaging objetivo de este reactivo durante experimentos de videomicroscopía permite exacto control espacio-temporal de la activación del TCR y vigilancia alta resolución de posteriores respuestas celulares por reflexión interna total (TIRF) proyección de imagen. Este enfoque también es compatible con estrategias de perturbación genética y farmacológica. Esto permite el montaje de vías moleculares bien definidas que vinculan la señalización del TCR a la formación de las estructuras citoesqueléticas polarizadas que subyacen en la sinapsis inmunológica.

El enfoque de fotoactivación y proyección de imagen permite observación y fácil cuantificación de respuestas señalización rápidas, polarizadas. Para ilustrar sus capacidades, reproducidos aquí es un experimento examinando la correlación espacio-temporal entre la acumulación inducida por TCR DAG y reorientación del centrosoma. 5C. T C7 celular ráfagas fueron retrovirally transduced con dos reporteros fluorescentes: un biosensor de DAG que contienen los dominios C1 de tándem de la proteína ...

Este protocolo describe un método basado en la proyección de imagen para activar los linfocitos T con photoactivatable péptido-MHC, que precisa control espacio-temporal de la activación de células T.

Control espacial y Temporal de la activación de células T con un agonista de la Photoactivatable

T lymphocytes engage in rapid, polarized signaling, occurring within minutes following TCR activation. This induces formation of the immunological ...

El objetivo general de este protocolo es describir el uso del péptido fotoactivable MHC para inducir la señalización polarizada en los linfocitos T. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la transducción de señales de células inmunitarias, como la forma en que los linfocitos transducen señales rápidas y localizadas y luego montan respuestas celulares polarizadas a esas señales. La principal ventaja de esta técnica es que ofrece un control espacio-temporal de la señalización de las células T.Lo hace fijando el momento y el lugar precisos de la activación del receptor de las células T. La demostradora del procedimiento estará a cargo de Elisa Sánchez, una estudiante de posgrado de mi laboratorio. Comience agregando poli-L-lisina biotinilada, o bio-PLL, diluida de uno a 500 en agua destilada desionizada a un cubreobjetos de ocho pocillos.Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, lavar con agua destilada desionizada y luego secar durante dos horas a temperatura ambiente. Bloquee las superficies recubiertas de bio-PLL con tampón de bloqueo que consiste en solución salina tamponada HEPES con 2% de BSA durante 30 minutos a temperatura ambiente.Después de la incubación, retire el tampón de bloqueo de las superficies recubiertas de bio-PLL sin permitir que los pocillos se sequen. Luego agregue estreptavidina e incube a cuatro grados centígrados. Después de una hora, lave las superficies recubiertas con HBS.Llene e invierta los pozos deslizantes de la cámara cuatro o cinco veces, eliminando el HBS de los pocillos. No permita que los pozos se sequen. Añada los ligandos específicos del complejo de histocompatibilidad del péptido fotoactivable biotinilado y las moléculas de adhesión para las células T CD4 positivas o las células CD8 positivas a las superficies recubiertas con bio-PLL.Proteger de la luz e incubar durante una hora a temperatura ambiente. Después de la incubación, lavar como antes y dejar en HBS hasta que esté listo para sembrar. Por último, agregue 200.000 linfocitos T CD4 positivos o CD8 positivos que expresen el TCR adecuado en los pocillos correctos y permita que las células se adhieran a 37 grados centígrados durante 15 minutos.Una vez que las células se han adherido y se han extendido en la superficie, están listas para la fotoactivación y la obtención de imágenes. Utilice un microscopio de fluorescencia de reflexión interna total invertido equipado con una lente de objetivo 150X compatible con UV para la adquisición de imágenes. Monitoree las sondas en los canales verde y rojo utilizando láseres de excitación de 488 nanómetros y 561 nanómetros, respectivamente.Después de montar el portaobjetos de la cámara que contiene las células T, ajuste la configuración del microscopio para obtener la iluminación TIRF o de epifluorescencia, según sea necesario. En el modo En vivo, seleccione un campo de celdas que expresen las sondas fluorescentes de interés. Establezca regiones a escala micrométrica para la fotoactivación debajo de células individuales mediante el control de software.A continuación, inicie la adquisición. Por lo general, se requieren 80 puntos de tiempo con un intervalo de cinco segundos entre cada uno. Esto deja tiempo para exposiciones secuenciales de 488 nanómetros y 563 nanómetros en el caso de experimentos de doble color.Luego, después de adquirir 10 puntos de tiempo, fotoactive las regiones seleccionadas abriendo el obturador de diafragma digital durante uno a 1,5 segundos. Una vez completado el lapso de tiempo, seleccione un nuevo campo de celdas y repita el proceso. Comience por determinar la intensidad de fluorescencia de una región de fondo fuera de la célula que se utilizará para la corrección de fondo.Dibuja una región cuadrada del tamaño de una micra fuera de la celda y haz una máscara. Para determinar la intensidad de fluorescencia, haga clic en Analizar, Estadísticas de mascarilla. Seleccione Intensidad media de fluorescencia y exporte los valores.Determine la intensidad de fluorescencia dentro de la región fotoactivada para cada punto de tiempo. Seleccione Máscara para resaltar la región que se fotoactivó. Para determinar la intensidad de fluorescencia, haga clic en Analizar, Estadísticas de mascarilla.Seleccione Intensidad media de fluorescencia y Exportar los valores. Obtenga las coordenadas X e Y del centro de la región fotoactivada seleccionando Máscara para resaltar la región que se fotoactivó. Una vez resaltada la región de fotoactivación, seleccione Analizar, Estadísticas de máscara, Centro de área y Exportar los valores.Determine las coordenadas X e Y de la sonda fluorescente de interés. Seleccione Seguimiento manual de partículas y haga clic en la sonda fluorescente que le interese a lo largo del tiempo. Una vez que se haya realizado el seguimiento de todos los puntos de tiempo, seleccione Analizar, Enmascarar estadísticas, Centro de área y Exportar los valores.Las células T se unieron a un cubreobjetos con cámara que contenía MCC-IEFK fotoactivable. C1-GFP, una sonda para el segundo mensajero lipídico DAG, se obtuvo mediante microscopía TIRF y RFP-Tubulin en modo de epifluorescencia. La fotoactivación localizada de la superficie debajo de la célula T induce la acumulación de DAG en la zona irradiada.A esto le sigue en cuestión de segundos la reorientación del centrosoma a la misma región. La acumulación de C1-GFP se puede cuantificar calculando la intensidad de fluorescencia normalizada después de la corrección de fondo en el centro de la región fotoactivada a lo largo del tiempo. La reorientación del centrosoma en respuesta a la fotoactivación se puede cuantificar calculando la distancia entre el centrosoma y el centro de la región fotoactivada en función del tiempo.Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en menos de un día si se realiza correctamente. Por lo general, generamos de 15 a 20 películas de lapso de tiempo para analizar en este tiempo. Este enfoque allanó el camino para que los investigadores exploraran la cinética y la polarización precisas de la activación de la señalización en las células T.También se adaptó para estudiar la señalización inhibitoria en células asesinas naturales. Como resultado, ahora tenemos una mejor comprensión de cómo se ensamblan y disuelven las interacciones comunicativas entre las células inmunitarias y las células.

spatial-temporal-control-t-cell-activation-using-photoactivatable

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Un método para el control espacio-temporal de la actividad GTPasa pequeña luz se describe. Este método se basa en la rapamicina inducida FKBP-FRB heterodimerización y sistemas de enjaulamiento foto-. Optimización de la luz de la irradiación permite la activación espacio-temporalmente controlada de las pequeñas GTPasas a nivel subcelular.

Espacio-Temporal de manipulación de la actividad GTPasa pequeña en el nivel subcelular y en escala de tiempo de segundos en las células vivas

La compartimentación de las proteínas, ya sea dentro de la membrana plasmática o en lugares intracelulares es un mecanismo de regulación que pueden influir mucho en los resultados de señalización, por lo que, para comprender la señalización es importante estudiar el comportamiento espacial y temporal de las proteínas implicadas. Se describe aquí un sistema de microscopía TIRF base para estudiar la transducción de señal en las células T, pero es ampliamente aplicable.

Una técnica de microscopía TIRF en tiempo real, imágenes simultáneas de la TCR y sus proteínas asociadas de señalización

Este video muestra un método para desengrasar un complejo de histocompatibilidad de péptido mayor fotoactivable utilizando irradiación UV. El proceso de decaging expone la secuencia de péptidos nativos, lo que permite una activación precisa de las células T.

Evaluación de la activación controlada de células T con un péptido fotoactivable MHC

Se describe un método de imágenes de células vivas que da una idea de la dinámica de proteínas durante el proceso de activación de células T. Se demuestra el uso combinado de la T-célula ensayo de difusión, microscopía confocal y análisis de imágenes para producir resultados cuantitativos para seguir la formación de complejos de señalización a través de la activación de células T.

En tiempo real de imágenes en vivo de las células T de señalización Formación de complejos

Aquí, se presenta un procedimiento para activar selectivamente una proteína neuronal con un pulso corto de luz mediante la codificación genética de un aminoácido no natural foto-reactivo en una proteína neuronal diana expresada en neuronas en cultivo o in vivo.

Control óptico de una proteína neuronal utilizando un ácido Unnatural Amino genéticamente codificados en las neuronas

En este protocolo, jaula de la proteína quinasa A (PKA), un bioeffector de transducción de señal celular, fue inmovilizada en una superficie de nanopartículas, microinyectado en el citosol y activado por producir UV luz de radiación de infrarrojo cercano (NIR), induciendo desintegración de la fibra de estrés aguas abajo en el citosol.

Un sistema integrado para activar remotamente Transduction de la señal intracelular por fotoactivación de la cinasa mediada por nanopartículas de conversión ascendente

Aquí, presentamos un protocolo para analizar la transferencia de célula a célula de información oscilatoria por control optogenetic y control de la expresión génica en vivo. Este enfoque proporciona una plataforma única para probar una significación funcional de los programas de dinámica gene expresión en sistemas multicelulares.

Un método de Optogenetic para controlar y analizar patrones de expresión génica en las interacciones célula a célula

Este protocolo describe el uso de la única cadena MHC de clase I complejos para investigar las interacciones moleculares en la activación de células T CD8 + humana: generación de ingeniería antígeno que presenta las células que expresan la cadena sola construye, cultura del clon humano de células T CD8 + y experimentos de activación de la célula de T.

Uso de la única cadena MHC tecnología investigar Co-agonismo humano CD8 + activación de células T

Este protocolo describe la generación de quimeras mixta médula ósea murina con centros germinales autoinmunitarios espontáneos, en autorreactivos que linfocitos llevan un reportero de la proteína verde fluorescente (GFP-PA) de photoactivatable. Esto proporciona la capacidad para vincular la localización celular en posteriores análisis moleculares y funcionales de los tejidos.

Interrogando a centros germinales autorreactivos individuales por fotoactivación en un modelo mixto de quimérico de la autoinmunidad

Este protocolo describe la aplicación de un dominio de interruptor alostérico activado por luz azul (LightR) para el control espacio-temporal reversible de la actividad de las proteínas. Utilizando la tirosina quinasa Src como modelo, este estudio ofrece un protocolo elaborado para desarrollar y caracterizar Src regulado por luz (LightR-Src). Demuestra la versatilidad de este enfoque en todas las clases de enzimas.

Control espacio-temporal de la actividad proteica a través de la regulación alostérica optogenética

Este protocolo describe los pasos esenciales para el cultivo de células T primarias, incluyendo su aislamiento, activación, expansión y transfección transitoria mediante electroporación de ARNm. Además, se propone un flujo de trabajo y un panel de anticuerpos para el análisis citométrico de flujo del fenotipo, marcadores de activación, viabilidad y expresión del receptor quimérico de antígenos (CAR).

Aislamiento, cultivo y transfección transitoria de células T humanas primarias para generar células T del Receptor de Antígenos Quiméricos (CAR)

Aprende a activar linfocitos T con control espaciotemporal mediante péptido-MHC fotoactivable. Este método permite estudiar la transducción de señales localizadas y las respuestas celulares polarizadas en inmunología.

Control espacial y Temporal de la activación de células T con un agonista de la Photoactivatable

Explorar más videos