Control espacial y Temporal de la activación de células T con un agonista de la Photoactivatable

Este protocolo describe un método basado en la proyección de imagen para activar los linfocitos T con photoactivatable péptido-MHC, que precisa control espacio-temporal de la activación de células T.

El objetivo general de este protocolo es describir el uso del péptido fotoactivable MHC para inducir la señalización polarizada en los linfocitos T. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la transducción de señales de células inmunitarias, como la forma en que los linfocitos transducen señales rápidas y localizadas y luego montan respuestas celulares polarizadas a esas señales. La principal ventaja de esta técnica es que ofrece un control espacio-temporal de la señalización de las células T.

Lo hace fijando el momento y el lugar precisos de la activación del receptor de las células T. La demostradora del procedimiento estará a cargo de Elisa Sánchez, una estudiante de posgrado de mi laboratorio. Comience agregando poli-L-lisina biotinilada, o bio-PLL, diluida de uno a 500 en agua destilada desionizada a un cubreobjetos de ocho pocillos.

Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, lavar con agua destilada desionizada y luego secar durante dos horas a temperatura ambiente. Bloquee las superficies recubiertas de bio-PLL con tampón de bloqueo que consiste en solución salina tamponada HEPES con 2% de BSA durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Después de la incubación, retire el tampón de bloqueo de las superficies recubiertas de bio-PLL sin permitir que los pocillos se sequen. Luego agregue estreptavidina e incube a cuatro grados centígrados. Después de una hora, lave las superficies recubiertas con HBS.

Llene e invierta los pozos deslizantes de la cámara cuatro o cinco veces, eliminando el HBS de los pocillos. No permita que los pozos se sequen. Añada los ligandos específicos del complejo de histocompatibilidad del péptido fotoactivable biotinilado y las moléculas de adhesión para las células T CD4 positivas o las células CD8 positivas a las superficies recubiertas con bio-PLL.

Proteger de la luz e incubar durante una hora a temperatura ambiente. Después de la incubación, lavar como antes y dejar en HBS hasta que esté listo para sembrar. Por último, agregue 200.000 linfocitos T CD4 positivos o CD8 positivos que expresen el TCR adecuado en los pocillos correctos y permita que las células se adhieran a 37 grados centígrados durante 15 minutos.

Una vez que las células se han adherido y se han extendido en la superficie, están listas para la fotoactivación y la obtención de imágenes. Utilice un microscopio de fluorescencia de reflexión interna total invertido equipado con una lente de objetivo 150X compatible con UV para la adquisición de imágenes. Monitoree las sondas en los canales verde y rojo utilizando láseres de excitación de 488 nanómetros y 561 nanómetros, respectivamente.

Después de montar el portaobjetos de la cámara que contiene las células T, ajuste la configuración del microscopio para obtener la iluminación TIRF o de epifluorescencia, según sea necesario. En el modo En vivo, seleccione un campo de celdas que expresen las sondas fluorescentes de interés. Establezca regiones a escala micrométrica para la fotoactivación debajo de células individuales mediante el control de software.

A continuación, inicie la adquisición. Por lo general, se requieren 80 puntos de tiempo con un intervalo de cinco segundos entre cada uno. Esto deja tiempo para exposiciones secuenciales de 488 nanómetros y 563 nanómetros en el caso de experimentos de doble color.

Luego, después de adquirir 10 puntos de tiempo, fotoactive las regiones seleccionadas abriendo el obturador de diafragma digital durante uno a 1,5 segundos. Una vez completado el lapso de tiempo, seleccione un nuevo campo de celdas y repita el proceso. Comience por determinar la intensidad de fluorescencia de una región de fondo fuera de la célula que se utilizará para la corrección de fondo.

Dibuja una región cuadrada del tamaño de una micra fuera de la celda y haz una máscara. Para determinar la intensidad de fluorescencia, haga clic en Analizar, Estadísticas de mascarilla. Seleccione Intensidad media de fluorescencia y exporte los valores.

Determine la intensidad de fluorescencia dentro de la región fotoactivada para cada punto de tiempo. Seleccione Máscara para resaltar la región que se fotoactivó. Para determinar la intensidad de fluorescencia, haga clic en Analizar, Estadísticas de mascarilla.

Seleccione Intensidad media de fluorescencia y Exportar los valores. Obtenga las coordenadas X e Y del centro de la región fotoactivada seleccionando Máscara para resaltar la región que se fotoactivó. Una vez resaltada la región de fotoactivación, seleccione Analizar, Estadísticas de máscara, Centro de área y Exportar los valores.

Determine las coordenadas X e Y de la sonda fluorescente de interés. Seleccione Seguimiento manual de partículas y haga clic en la sonda fluorescente que le interese a lo largo del tiempo. Una vez que se haya realizado el seguimiento de todos los puntos de tiempo, seleccione Analizar, Enmascarar estadísticas, Centro de área y Exportar los valores.

Las células T se unieron a un cubreobjetos con cámara que contenía MCC-IEFK fotoactivable. C1-GFP, una sonda para el segundo mensajero lipídico DAG, se obtuvo mediante microscopía TIRF y RFP-Tubulin en modo de epifluorescencia. La fotoactivación localizada de la superficie debajo de la célula T induce la acumulación de DAG en la zona irradiada.

A esto le sigue en cuestión de segundos la reorientación del centrosoma a la misma región. La acumulación de C1-GFP se puede cuantificar calculando la intensidad de fluorescencia normalizada después de la corrección de fondo en el centro de la región fotoactivada a lo largo del tiempo. La reorientación del centrosoma en respuesta a la fotoactivación se puede cuantificar calculando la distancia entre el centrosoma y el centro de la región fotoactivada en función del tiempo.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en menos de un día si se realiza correctamente. Por lo general, generamos de 15 a 20 películas de lapso de tiempo para analizar en este tiempo. Este enfoque allanó el camino para que los investigadores exploraran la cinética y la polarización precisas de la activación de la señalización en las células T.

También se adaptó para estudiar la señalización inhibitoria en células asesinas naturales. Como resultado, ahora tenemos una mejor comprensión de cómo se ensamblan y disuelven las interacciones comunicativas entre las células inmunitarias y las células.