Name: Visualización de la dinámica del receptor de células T de superficie de cuatro dimensiones mediante la microscopía de hoja de luz de celosía (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Aprende a visualizar la dinámica tridimensional de receptores de células T en tiempo real mediante microscopía de hoja de luz de celosía. Este protocolo detallado permite obtener imágenes de alta resolución con mínimo fotoblanqueo.

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Nos gustaría reconocer el consejo y la orientación del Dr. Vytas Bindokas de la Universidad de Chicago. Agradecemos a la Instalación Central integrada de microscopía de luz de la Universidad de Chicago por apoyar y mantener el microscopio de lámina de luz de celosía. Este trabajo fue apoyado por NIH New Innovator Award 1DP2AI144245 y NSF Career Award 1653782 (A J.H.). J.R. cuenta con el apoyo del Programa de Becas de Investigación de Posgrado de la NSF.

5C. C7 Ratones noqueadores RAG2 transgénicos en B10. Un fondo se utilizó en este estudio de acuerdo con un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Chicago.
1. Cosecha y Activa células T
NOTA: Esta parte del protocolo se basa en protocolos anteriores. Véanse las citas para másdetalles 20,21.
<ol><li>Eutanasia a 10-12 semanas de 5C. Ratón transgénico C7 de ambos sexos (20-25 g) de acuerdo con el protocolo IACUC aprobado (es decir, cámara de CO2 seguida de luxación cervical).</li>
	<li>Rocíe bien la carcasa del ratón con 70% de etanol para empapar el pelaje y llevarlo a un gabinete de seguridad BSL-2.</li>
	<li>Gire el ratón hacia su lado derecho y haga una pequeña incisión en la cavidad corporal con tijeras quirúrgicas. Retire el bazo con fórceps quirúrgicos. Corte el tejido conectivo según sea necesario con tijeras quirúrgicas.</li>
	<li>Coloque el bazo en un colador de células de malla de poro de 70 m y machaque con la parte posterior de un émbolo de jeringa de 1 ml. Lavar bien el colador con RPMI completo (RPMI con 10% de suero bovino fetal [FBS], 2 mM de L-glutamina, 1% penicilina/estreptomicina, 50 M 2-mercaptoetanol).</li>
	<li>Centrifugar la suspensión de una sola célula de los esplenocitos a 300 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante. NOTA: El pellet en este punto será rojo.</li>
	<li>Resuspenda los esplenocitos en el tampón de lisis RBC de 5 ml. Incubar durante 5 min, luego amendar con 5 ml de RPMI completo.</li>
	<li>Centrifugar la suspensión de una sola célula de los esplenocitos a 300 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante. NOTA: El pellet en este punto debe ser blanco, no rojo.</li>
	<li>Resuspenda el pellet en 5 ml de RPMI completo.</li>
	<li>Pasar a un matraz T-25 y añadir 10 m de polilpolilla citocromo-C (MCC, secuencia ANERADLIAYLKQATK). Coloque las células en una incubadora de cultivo celular a 37 oC, 5% CO2 durante la noche.</li>
	<li>Al día siguiente, añadir ratón recombinante IL-2 a una concentración final de 100 U/ml.</li>
	<li>Observe durante los días siguientes, agregando medios nuevos a medida que los medios actuales se vuelven amarillos. Las células T morirán si se dejan en medios amarillos desatendidos durante más de 48 h. Las células están listas para usar 6-10 días después de la cosecha.</li>
</ol>2. Preparar células
<ol><li>Incubar 5 mm de cubiertas redondas con 0.1% poli-L-lisina durante 10 min. Aspirar y dejar secar naturalmente.</li>
	<li>Utilice un reactivo de gradiente de densidad (consulte la Tabla de Materiales)para separar las celdas muertas y obtener 1 x 106 células T y 1 x 106 ACC (células CH2721,22 transducidas con mCherry citosólico) por separado. NOTA: Las celdas se cuentan usando un hemocaquímetro.<ol>
<li>Agregue 3 ml de reactivo de gradiente de densidad a un tubo cónico de 15 ml y agregue las celdas con gotas al borde del tubo con cuidado. No mezcle. Centrífuga a 930 x g durante 10 min a 4 oC; aceleración/desaceleración: SLOW/SLOW. Retire cuidadosamente la capa media delgada de las celdas entre el medio completo y el reactivo de gradiente de densidad, colocando cada tipo de celda en tubos cónicos separados. NOTA: Es necesario preparar más células de las necesarias para la toma de imágenes, ya que encontramos que el 50% se pierde en promedio durante el proceso. Cuantas más células se utilicen para el proceso, más fácil será cosecharlas del gradiente de densidad. Utilizamos 4-8 mL de ambos tipos de células para asegurar el exceso de células. Si lo desea, las celdas se pueden contar antes de este paso para garantizar el volumen necesario. Las células adicionales se vuelven a colocar en sus respectivos matraces.</li>
		<li>Lave los dos tubos de las células T y CH27 tres veces con 5 ml de RPMI completo (300 x g durante 5 min). Deseche el sobrenadante cada vez durante el lavado. Resuspenda cada tubo en RPMI completo de 1 ml y cuente las células por un hemocitómetro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Resuspenda 1 x 106 AAP en 500 s RPMI completo y agregue 10 M DE MCC. Incubar durante 3 h a 37oC, 5% CO2. Lave las células tres veces con 500 ml de RPMI completo (300 x g durante 5 min). Descarta los supernatantes.</li>
	<li>Resuspenda 1 x 106 células T en RPMI completo de 500 l. Añadir 2 g de Fab con la etiqueta anti-TCR-Alexa488 (clon H57) a 500 l de células. Incubar durante 30 min a 37oC, 5%CO2. Lave las células tres veces con 500 ml de RPMI completo (300 x g durante 5 min). Deseche el sobrenadante después de cada lavado. NOTA: El anticuerpo anti-TCR divalente se cortó en Fab monovalente usando un kit de preparación Fab (ver la Tabla de Materiales)para evitar el reticulado de los receptores de células T por el anticuerpo divalente (este paso es opcional).</li>
	<li>Resuspender ambos tipos de células en 500 ml de medios de diagnóstico por imágenes (medio L-15 libre de fenol con 10% de FBS, 1% penicilina/estreptomicina, 2 mM de L-glutamina).</li>
</ol>3. Realización de la alineación diaria de LLSM
NOTA: (Importante) Este protocolo de alineación se basa en el instrumento LLSM utilizado (consulte la Tabla de materiales). Cada LLSM puede ser diferente y requerir diferentes estrategias de alineación, especialmente aquellas que son caseras. Lleve a cabo la alineación rutinaria adecuada y continúe con la sección 4.
<ol><li>Añadir 10 ml de agua más fluoresceína de 30 ml (1 mg/ml de stock) al baño LLSM (volumen de 10 ml), pulse Imagen (Inicio) para mover el objetivo a la posición de la imagen y observe un solo patrón de rayo láser Bessel. Alinee el rayo láser utilizando las guías y la región de interés (ROI) preestablecida para hacer que el haz sea un patrón delgado equilibrado en todas las direcciones.<ol>
<li>El haz también debe aparecer enfocado en la cámara del buscador. Utilice dos ajustadores de inclinación de espejo, micrómetro superior, enfoque y collar objetivo de emisión para ajustar. Vea la Figura 2A,B para el haz correctamente alineado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lavar el baño y los objetivos con al menos 200 ml de agua para eliminar completamente la fluoresceína.</li>
	<li>Cuentas fluorescentes estándar de imagen en los medios de imagen (preparadas mediante la adherido de perlas a un cubreobjetos de 5 mm con poli-L-lisina, ver la Tabla de Materiales; esto puede ser pre-preparado y reutilizado) para la función de propagación de punto físico (PSF) en medios de imagen. NOTA: Solo puede haber un cordón a la vista para su posterior procesamiento, así que trate de encontrar un cordón que esté por sí mismo en el visor o que se pueda recortar fácilmente para obtener un solo cordón.<ol>
<li>Active el tramado ajustando a 3 en la caja 'X Galvo range'. Pulse En vivo para ver el campo actual. Muévete a lo largo de la dirección Z para encontrar el deslizamiento de la cubierta y las cuentas. Encuentra el centro de un cordón moviéndote a lo largo de Z, presiona Detener para pausar el láser. Compruebe 3D, pulse Centro y, a continuación, pulse Ejecutar. Esto recopilará los datos.</li>
		<li>Ajuste manualmente el espejo de inclinación, el collar objetivo y el micrómetro de enfoque para obtener los valores grises más altos y, a continuación, ajuste según sea necesario para obtener los patrones adecuados para los modos de captura de escaneo objetivo, z galvo, z+objective (totPSF) y escaneo de muestras (samplePSF). Vea la Figura 2C-F para las proyecciones de intensidad máxima (MIP) correctamente ajustadas. NOTA: Los distintos modos de captura (escaneo objetivo, z galvo, z+objetivo y escaneo de muestra) cambian la forma en que se mueve la hoja de luz a través de la muestra. Todos los modos de escaneo deben utilizarse para la alineación.</li>
		<li>El análisis de ejemplo muestra cómo se recopilarán los datos durante el experimento. Recoja la muestra de PSF pulsando Ejecutar en modo de análisis de muestra para desenkloy y desconvolución (ver sección 5). Cambie los láseres a tres modos de color (488, 560, 647) y pulse Ejecutar de nuevo. NOTA: Dado que las imágenes LLSM en ángulo (57,2o), las imágenes capturadas en el modo "escaneo de muestras" se recopilan en este ángulo y, por lo tanto, se "sesgan". El desbrociamiento es el proceso de corregir este ángulo y "realinear" la imagen a una verdadera pila z. Estos datos deben recopilarse en los medios de diagnóstico por imágenes y en todos los canales que se mostrarán durante el experimento. Si esto no se recopila correctamente, los datos no se desviarán correctamente. Del mismo modo, asegúrese de que los medios se hayan calentado a 37 oC (o a la temperatura experimental deseada).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Configuración de celdas con LLSM
<ol><li>Agregue 100.000 ACC (50 l) desde el paso 2.5 a un cubreobjetos circular de 5 mm de diámetro del paso 2.1 y permita que se asienten durante 10 minutos.</li>
	<li>Engrase el soporte de la muestra y luego agregue la celda de cubierta hacia arriba. Agregue una gota de papel de imagen en la parte posterior de la cubierta para evitar burbujas antes de colocarlas en el baño. Atornille el soporte de la muestra en el piezo y pulse Imagen (Inicio).</li>
	<li>Encuentre un APC para crear una imagen para asegurarse de que el LLSM y el software de imágenes (consulte Tabla de materiales)funcionan correctamente. NOTA: Hacemos una imagen de un tamaño de paso de 0,4 m con 60 pasos z y 10 ms de exposición para dos colores con tramado ajustado a 3, lo que da como resultado 1,54 s por fotograma de imagen 3D con resolución XY de 200 nm y resolución Z de 400 nm. Es posible que estos ajustes deban ajustarse en función del tamaño de la celda, la resolución z deseada y la fuerza de la señal de la técnica de etiquetado fluorescente utilizada. El uso de energía láser también variará en función de la técnica de etiquetado fluorescente utilizada.<ol>
<li>Pulse En vivo para ver la imagen actual. Muévete a lo largo de Z para encontrar el resbalón de la cubierta y las células.</li>
		<li>Encuentra el centro de un APC moviéndote en la dirección Z y, a continuación, presiona Detener para pausar el láser. Compruebe 3D e introduzca los ajustes deseados (consulte el paso 4.3.1), pulse Centro y, a continuación, pulse Ejecutar. Esto recopilará los datos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bajar la etapa para cargar la posición y añadir 50 l de células T en medios de imagen (100.000 celdas, desde el paso 2.5) con gota directamente sobre el resbalón de la cubierta. Lo mejor es dejar una forma de gota en el extremo de la punta de la pipeta y luego tocar la punta al líquido de baño. Levante el escenario hacia atrás haciendo clic en"Imagen (Retorno)".</li>
	<li>Comiencen las imágenes. Asegúrese de establecer el tamaño de pila y la longitud de lapso de tiempo deseados. Por ejemplo, la imagen 60 z-pilas con un tamaño de paso de 0,4 m y la entrada de 500 marcos de tiempo. (Normalmente) deje de grabar antes de que se alcancen 500 fotogramas para evitar el fotoblanqueo. Utilice el modo Live para buscar pares de celdas, y cuando se hayan introducido ajustes listos y deseados, pulse Ejecutar para recopilar datos. Consulte la película 1 y la figura 1 para obtener un ejemplo.</li>
</ol>5. Seguimiento de la dinámica de la superficie
<ol><li>Exporte los datos desde el software de imágenes (consulte la Tabla de materiales). Esto creará archivos TIF de pila z para cada punto de tiempo en cada color.</li>
	<li>Primero desenhorado y desconvolve los datos. NOTA: Utilizamos la tubería LLSpy bajo licencia por Janelia Research Campus18de HHMI, pero el desenfrenada y la desconvolución también están disponibles dentro de múltiples softwares de imágenes (consulte Tabla de materiales).</li>
	<li>Blanquear los datos. NOTA: Utilizamos la función de blanqueo de Fiji con coincidencia de histograma (Fiji Pathway: Image ? Ajustar ? Corrección de la lejía (Bleach Correction) Coincidencia de histogramas ? OK).</li>
	<li>Importar en el software de seguimiento (consulte la Tabla de materiales). Realice un seguimiento de los clústeres de acuerdo con las especificaciones del software. Consulte la película 2 para obtener un ejemplo. NOTA: Los resultados de seguimiento dependerán del software de seguimiento utilizado, el algoritmo elegido, los parámetros de salida deseados seleccionados, etc. Por ejemplo, en el software de seguimiento que utilizamos (consulte la Tabla de materiales),elegimos permitir que el software realizara un seguimiento de formas irregulares, en lugar de asignar cada entidad a un solo punto, ya que los clústeres de TCR no están organizados en esferas perfectas. Además, elegimos recopilar 35 parámetros, incluyendo información de velocidad, dirección, volumen, intensidad, área, ubicación y duración de la pista. Sin embargo, diferentes métodos o parámetros serán beneficiosos para responder a diferentes preguntas.<ol>
<li>Si no se desea realizar el seguimiento, utilice el complemento ClearVolume para Fiji para visualizar y crear películas a partir de datos de hiperpila.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo presentado fue optimizado para el uso de células CD4+ T aisladas de 5C. Los ratones transgénicos C7 en el instrumento LLSM utilizado, y por lo tanto otros sistemas celulares y LLSM pueden necesitar ser optimizados de manera diferente. Sin embargo, este protocolo muestra la potencia de las imágenes 4D, ya que se puede utilizar para cuantificar la dinámica de un receptor de superficie en una célula entera con la menor distorsión en condiciones fisiológicas. Por lo tanto, hay muchas posibles aplicaci...

La dinámica precisa del tráfico y difusión de moléculas en la superficie celular tridimensional en tiempo real ha sido un enigma a resolver. La microscopía siempre ha sido un equilibrio entre velocidad, sensibilidad y resolución; si uno o dos se maximizan, el tercero se minimiza. Por lo tanto, debido al pequeño tamaño y la inmensa velocidad con la que se mueven los receptores de superficie, el seguimiento de su dinámica ha seguido siendo un gran desafío tecnológico para el campo de la biología celular. Por ejemplo, muchos estudios se han realizado utilizando la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF)1,2,3, que tiene alta resolución temporal, pero sólo puede imaginar una rebanada muy delgada de la membrana de la célula T (100 nm), y por lo tanto echa de menos eventos que ocurren más lejos en la célula. Estas imágenes TIRF también muestran solo una sección bidimensional de la celda. Por el contrario, las técnicas de superresolución, como la microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM)4, la microscopía de localización fotoactivada (PALM)5y la microscopía de agotamiento de emisiones estimulada (STED)6,pueden superar el límite de difracción de la luz de Abbe. Estas técnicas tienen una alta resolución espacial (resolución de 20 nm)4,5,6,7, pero a menudo tardan muchos minutos en adquirir una imagen bidimensional completa (2D) o tridimensional (3D), y por lo tanto se pierde la resolución temporal. Además, técnicas como STORM y PALM que dependen de señales parpadeantes pueden tener imprecisiones en el conteo8,9. La microscopía electrónica tiene con mucho la resolución más alta (resolución de hasta 50 pm)10; incluso se puede llevar a cabo tridimensionalmente con microscopía electrónica de barrido de haz iónico focalizado (FIB-SEM), lo que resulta en hasta 3 nm XY y 500 nm Z resolución11. Sin embargo, cualquier forma de microscopía electrónica requiere una preparación dura de la muestra y sólo se puede llevar a cabo con células o tejidos fijos, eliminando la posibilidad de tomar imágenes de muestras en vivo a lo largo del tiempo.
Técnicas para obtener la alta resolución espaciotemporal necesaria para identificar la dinámica de las moléculas superficiales e intracelulares en células vivas en su verdadera naturaleza fisiológica 3D sólo se está desarrollando recientemente. Una de estas técnicas es Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM)12, que utiliza una hoja de luz estructurada para reducir drásticamente el fotoblanqueo. Desarrollado en 2014 por el Premio Nobel Eric Betzig, la alta resolución axial, bajo fotoblanqueo y ruido de fondo, y la capacidad de crear simultáneamente imágenes de cientos de planos por campo de visión hacen que los microscopios LLS sean superiores a los microscopios de campo ancho, TIRF yconfocal12,13,14,15,16,17,18,19. Esta técnica de imagen de cuatro dimensiones (x, y, z y tiempo), aunque todavía difracción limitada (resolución XYZ de 200 nm), tiene una resolución temporal increíble (hemos logrado una velocidad de fotogramas de unos 100 fps, lo que resulta en una imagen de celda reconstruida en 3D con 0,85 segundos por fotograma) para la adquisición espacial 3D.
LLSM se puede utilizar generalmente para rastrear la dinámica en tiempo real de cualquier molécula dentro de cualquier célula a nivel de una sola molécula y una sola célula, particularmente aquellas en células altamente móviles como las células inmunes. Por ejemplo, mostramos aquí cómo utilizar LLSM para visualizar la dinámica del receptor de células T (TCR). Las células T son las células efector del sistema inmunitario adaptativo. Las TPR son responsables de reconocer los ligandos peptídicos-MHC (pMHC) que se muestran en la superficie de las células que presentan antígenos (APC), que determina la selección, desarrollo, diferenciación, destino y función de una célula T. Este reconocimiento se produce en la interfaz entre las células T y los AAP, lo que resulta en clustering de receptores localizados para formar lo que se llama la sinapsis inmunológica. Si bien se sabe que los TCR en la sinapsis inmunológica son imperativos para la función del efector de células T, todavía desconocidos son los mecanismos subyacentes del tráfico de TCR en tiempo real a la sinapsis. LLSM nos ha permitido visualizar en tiempo real la dinámica de los TCR antes y después del tráfico a la sinapsis con la interacción resultante pMHC-TCR(Figura 1). Por lo tanto, llSM se puede utilizar para resolver cuestiones actuales de la dinámica formativa de los TPR y proporcionar información para entender cómo una célula distingue entre antígenos uno mismo y otros.

<table><tbody><tr><td>Jeringa de 1 mL</td><td>BD</td><td>309659</td><td>para la recolección de células T</td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148-25ML</td><td>para cultivo de células T</td></tr><tr><td>cubreobjetos redondos de 5 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>502040</td><td>para imágenes</td></tr><tr><td>Filtro de células estériles de 70um</td><td>Corning</td><td>7201431</td><td>para la recolección de células T</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-ratón TCR y beta; cadena Anticuerpo</td><td>BioLegend</td><td>109215</td><td>para la obtención de imágenes</td></tr><tr><td>de suero fetal bovino (FBS)</td><td>X& Cultivo de células Y</td><td>FBS-500</td><td>para cultivo de células T</td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>Reactivo de gradiente Denisty para la recolección de células</td></tr><tr><td>T Sal sáldica fluoresceína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6377</td><td>Para la alineación del microscopio</td></tr><tr><td>FluoSpheres Microesferas modificadas con carboxilato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F8810</td><td>Para la alineación del microscopio</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td>N/A</td><td>software de seguimiento; Otras opciones de software de rastreo incluyen Amira o Trackmate (Fiji).</td></tr><tr><td>Microscopio de lámina de luz reticular</td><td>3i</td><td>N/A</td><td>Microscopio utilizado</td></tr><tr><td>Medio L-15 de Leibovitz, sin rojo fenol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21083027</td><td>para la obtención</td></tr><tr><td>de imágenes L-glutamina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-081</td><td>para el cultivo de células T</td></tr><tr><td>LLSpy</td><td>Janelia Research Campus</td><td>N/A</td><td>LLSpy se utilizó bajo licencia del Instituto Médico Howard Hughes, Campus de Investigación Janelia. Póngase en contacto con innovation@janelia.hhmi.org para obtener acceso. Otros métodos de deconvolución y deksewing están disponibles en softwares de procesamiento de imágenes como Fiji, Slidebook, Amira y otros. <a href="https://llspy.readthedocs.io/en/latest/" target="_blank">https://llspy.readthedocs.io/en/latest/</a></td></tr><tr><td>Moth Citocromo C (MCC), secuencia ANERADLIAYLKQATK</td><td>Elimbio</td><td>Síntesis personalizada</td><td>para la recolección de células T</td></tr><tr><td>Penacilina/Estreptamicina</td><td>Life Technologies</td><td>15140122_3683884612</td><td>Para el cultivo de células T</td></tr><tr><td>Poly-L-Lisina</td><td>Productos de investigación de Phenix</td><td>P8920-100ML</td><td>para la obtención de imágenes</td></tr><tr><td>Tampón de lisis RBC</td><td>eBioscience</td><td>00-4300-54</td><td>Para la recolección de células T</td></tr><tr><td>Ratón recombinante IL-2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0523</td><td>Para cultivo de células</td></tr><tr><td>T RPMI 1640 Medio</td><td>Corning</td><td>MT10040CV</td><td>para cultivo de células T</td></tr><tr><td>Libro de diapositivas</td><td>3i</td><td>N/A</td><td>LLSM software de imágenes</td></tr><tr><td>Herramientas de</td> <td>disección quirúrgicaNova-Tech International</td><td>DSET10</td><td>Para la cosecha de células T</td></tr><tr><td>Matraces T-25</td><td>Eppendorf</td><td>2231710126</td><td>para el cultivo de células T</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Pierce Fab Micro Kits de preparación</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>44685</td><td>Para la preparación de Fab</td></tr></tbody></table>

visualización de la dinámica del receptor de células t de superficie de cuatro dimensiones mediante la microscopía de hoja de luz de celosía

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

La señalización y la función de una célula están dictadas por las estructuras dinámicas y las interacciones de sus receptores de superficie. Para entender realmente la relación estructura-función de estos receptores in situ, necesitamos visualizarlos y rastrearlos en la superficie celular viva con suficiente resolución espaciotemporal. Aquí mostramos cómo utilizar la microscopía de hoja de luz de celosía (LLSM) recientemente desarrollada para crear imágenes de receptores de células T (TPR) en cuatro dimensiones (4D, espacio y tiempo) en la membrana celular viva. Las células T son una de las principales células efector del sistema inmune adaptativo, y aquí usamos las células T como ejemplo para mostrar que la señalización y la función de estas células son impulsadas por la dinámica y las interacciones de losTPR. LLSM permite imágenes 4D con una resolución espaciotemporal sin precedentes. Por lo tanto, esta técnica de microscopía se puede aplicar generalmente a una amplia gama de moléculas superficiales o intracelulares de diferentes células en biología.

Aquí, describimos el aislamiento, la preparación y la creación de imágenes del ratón primario 5C. Células T C7 utilizando un microscopio de lámina de luz de celosía. Durante la sección 3, es imprescindible alinear el microscopio correctamente y recopilar PSF diariamente con el que desconvolver los datos después de la recolección. En la Figura 2,mostramos las imágenes de alineación correctas que se verán al alinear el microscopio. La Figura 2A y ...

El objetivo de este protocolo es mostrar cómo utilizar la microscopía de hoja de luz de celosía para visualizar la dinámica de receptores de superficie en células vivas. Aquí se muestran los receptores de células T en CD4+ células T primarias.

Visualización de la dinámica del receptor de células T de superficie de cuatro dimensiones mediante la microscopía de hoja de luz de celosía

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

La microscopía de láminas de luz de celosía es una poderosa tecnología de imagen, pero pocos laboratorios en el mundo son capaces de usarla. Este protocolo ofrece una descripción detallada de cómo utilizar el microscopio de lámina de luz de celosía disponible comercialmente. Es un sistema extremadamente potente capaz de imágenes tridimensionales de células individuales o embriones que permite el seguimiento en tiempo real de moléculas.La principal ventaja de esta técnica es que puede imaginar tridimensionalmente células u órganos vivos individuales con alta resolución espaciotemporal y blanqueo fotográfico mínimo. El patrón de celosía de la lámina de luz nos permite tomar muestras de imágenes de alta velocidad y obtener vídeos en tiempo real de células y órganos vivos tridimensionales con detalles moleculares que otras técnicas no pueden lograr. Este primer protocolo de video que muestra cómo nos la microscopía de lámina de luz de celosía para crear imágenes de una sola celda de cuatro dimensiones.Esta es una técnica muy complicada debido a la alineación y la preparación de la muestra. Y creemos que la demostración visual mejorará la accesibilidad al permitir que más científicos imaginen muchas moléculas, células y órganos diferentes en biología. Para comenzar este procedimiento, incubar cubreobjetos redondos de cinco milímetros con 0,1%poli-L-lisina a temperatura ambiente durante 10 minutos.Aspirar el líquido y dejar que los cubreobjetos se sequen al aire de forma natural. A continuación, agregue tres mililitros de gradiente de densidad a un tubo cónico de 15 mililitros. Agregue con cuidado las células en el borde del tubo.Centrifugar a 930 veces g y a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Después de esto, retire cuidadosamente la fina capa media de las células entre el medio completo y el reactivo de gradiente de densidad asegurándose de poner cada tipo de celda en un tubo cónico separado. Centrifugar a 300 g durante cinco minutos para lavar las células.Deseche el sobrenadante y agregue cinco mililitros de RPMI a los tubos de las células T y las células CH27. Repita el lavado con RPMI fresca hasta que se hayan realizado tres lavados totales. Luego, resuspender las células en cada tubo con un mililitro de RPMI completa y contar las células con un hemocitociómetro.Resuspender un millón de células que presentan antígenos en 500 microlitros de RPMI completa y añadir 10 MCC micromolares. Incubar a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante tres horas. Después de esto, resuspender un millón de células T en 500 microlitros de RPMI completa.Añadir dos microgramos de anti-TCR beta Alexa 488 etiquetado FAB e incubar a 37 grados Celsius con 5% dióxido de carbono durante 30 minutos. A continuación, centrifugar ambas células a 300 veces g durante cinco minutos y deseche el sobrenadante. Añadir 500 microlitros de RPMI completa y repetir la centrífuga para lavar las células.Repita el lavado con RPMI fresca hasta que se hayan realizado tres lavados totales desechando el sobrenadante después de cada lavado. Después de esto, resuspendir ambos tipos de células en 500 microlitros de medios de imagen. En primer lugar, añadir 10 mililitros de agua y 30 microlitros de fluoresceína al baño LLSM.Pulse Inicio de imagen para mover el objeto a la posición de la imagen y ver un único patrón de rayo láser Bessel. Alinee el rayo láser utilizando la guía y la región preestablecida de interés para hacer de la viga un patrón delgado que esté equilibrado en todas las direcciones. El haz también debe aparecer enfocado en la cámara del buscador.Utilice los dos ajustadores de inclinación del espejo, el micrómetro de enfoque superior y el color objetivo para ajustar la viga. A continuación, lave el baño y los objetivos con al menos 200 mililitros de agua para eliminar por completo cualquier fluoresceína. Para crear una imagen de los cordones fluorescentes estándar, active el tramado estableciendo tres en el cuadro de rango Xgalvo y pulse En vivo para ver el campo actual.Ajuste manualmente el espejo de inclinación, el color objetivo y el micrómetro de enfoque para obtener los valores de gris más altos. A continuación, ajuste según sea necesario para obtener patrones adecuados para los modos de exploración objetiva, Z galvo, Z plus y captura de escaneo de muestra. Después de esto, presione Ejecutar en el modo de escaneo de muestra para recopilar la función de propagación de punto de muestra para desssenganchar y desenvolucionar.Cambie los láseres al modo de tres colores y pulse Ejecutar de nuevo. Para empezar, agregue 100.000 celdas anti-presentación al cubreobjetos circulares de cinco milímetros de diámetro preparado y démúlese durante 10 minutos. Engrase el soporte de la muestra y agregue el cubreobjetos al lado de la celda hacia arriba.A continuación, agregue una gota de medios de imágenes a la parte posterior del cubreobjetos. Atornille el soporte de muestra en el Piezo y presione Image Home. Encuentre una celda que presente antígeno a la imagen y asegúrese de que el LLSM y el software de imágenes funcionen correctamente.Pulse Live para ver la imagen actual. Muévete a lo largo de Z para encontrar el cubreobjetos y las células. Encuentra el centro de una celda que presenta antígenos moviéndote en la dirección Z, luego presiona Parar para pausar el láser.Compruebe 3D e introduzca los ajustes deseados. Presione Center y, a continuación, presione Ejecutar para recopilar los datos. Baje el escenario a la posición de carga y agregue 50 microlitros de células T y medios de imagen directamente sobre el cubreobjetos.Lo mejor es dejar que se forme una gota en el extremo de la punta de la pipeta y luego tocar la punta al líquido de baño. Vuelva a elevar la etapa haciendo clic en Retorno de imagen. Comiencen a tomar imágenes.Asegúrese de establecer la pila Z deseada y la longitud del timelapse. Por ejemplo, la imagen 60 Z se apila con un tamaño de paso de 0,4 micrómetros y introduce 500 marcos de tiempo. Detenga la grabación antes de que se alcancen 500 fotogramas para evitar el blanqueo de fotos.Utilice el modo en vivo para buscar pares de celdas y, cuando se hayan introducido los ajustes listos y deseados, pulse Ejecutar para recopilar datos. En este estudio, las células T primarias del ratón 5CC7 se aíslan y se preparan y luego se visualizan con un microscopio de lámina de luz de celosía. Aquí se muestran la trayectoria de viga correcta y la alineación de la viga cuando se imagen con fluoresceína.El escaneo objetivo debe mostrar una forma X grande en las proyecciones XZ e YZ que sea lo más simétrica posible. También deben ajustarse para que sean lo más pequeños posible de una X. La exploración Z galvo debe mostrar un óvalo en XZ y XY con un solo punto a cada lado.Por último, tanto el escaneo objetivo Z plus como el escaneo de muestra deben mostrar puntos que se vean lo más redondos posible. Usando este protocolo, se pudo ver la dinámica cuadular de los receptores de células T en una superficie de células T. La principal ventaja de este microscopio radica en la capacidad de rastrear las unidades de superficie visualizadas de los receptores de células T y obtener datos cuantificados de su tamaño, movimiento, intensidad de señal y excretas.Lo más importante a recordar es la calidad de su alineación. La lámina de luz de celosía debe estar alineada diariamente y no hacerlo correctamente resultará en imágenes distorsionadas. Del mismo modo, la calidad del PSF recogido afecta directamente a la calidad de la desenvolución, lo que en última instancia resulta en la calidad de su imagen final.Una de las razones por las que este método es tan poderoso es porque cada célula y etiqueta se pueden reemplazar para visualizar muchos tipos de células y moléculas. Por lo tanto, este método se puede utilizar para responder a cualquier pregunta relacionada con el seguimiento en cuatro dimensiones de moléculas. Creemos que esta técnica allanará el camino para que los investigadores exploren nuevas cuestiones dentro del campo del tráfico molecular.Todavía no está siendo ampliamente utilizado debido al complicado sistema, por lo que esperamos que este video de Jove mejore la accesibilidad a la técnica. Los láseres utilizados en el sistema son de clase cuatro, por lo que se debe tener absoluta precaución para garantizar la seguridad del láser. Por favor, tome el entrenamiento de seguridad láser necesario antes de usar este método.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este protocolo describe un método para células T de imagen fluorescente introducido en rodajas los ganglios linfáticos. La técnica permite en tiempo real, análisis de la migración de las células T con las tradicionales de fluorescencia de campo amplio o microscopios confocal.

Ex vivo de imágenes de células T en los ganglios linfáticos murino Rebanadas con campo amplio y microscopios confocal

La compartimentación de las proteínas, ya sea dentro de la membrana plasmática o en lugares intracelulares es un mecanismo de regulación que pueden influir mucho en los resultados de señalización, por lo que, para comprender la señalización es importante estudiar el comportamiento espacial y temporal de las proteínas implicadas. Se describe aquí un sistema de microscopía TIRF base para estudiar la transducción de señal en las células T, pero es ampliamente aplicable.

Una técnica de microscopía TIRF en tiempo real, imágenes simultáneas de la TCR y sus proteínas asociadas de señalización

En este video, describimos la técnica de microscopía de lámina de luz reticular para visualizar las interacciones entre las células T vivas y las células presentadoras de antígenos. El método consiste en enfocar una lámina de luz reticular ultradelgada en un par de células que interactúan para obtener una serie de imágenes bidimensionales, que se combinan para obtener imágenes cuatridimensionales de alta resolución que revelan la dinámica espacio-temporal de la interacción célula-célula.

Microscopía de lámina de luz reticular para visualizar las interacciones receptor-ligando en células vivas

Se describe un método de imágenes de células vivas que da una idea de la dinámica de proteínas durante el proceso de activación de células T. Se demuestra el uso combinado de la T-célula ensayo de difusión, microscopía confocal y análisis de imágenes para producir resultados cuantitativos para seguir la formación de complejos de señalización a través de la activación de células T.

En tiempo real de imágenes en vivo de las células T de señalización Formación de complejos

De alta resolución de imagen intravital con mejor contraste de hasta 120 m de profundidad en los ganglios linfáticos de ratones adultos se consigue modular espacialmente el patrón de excitación de un multi-focal del microscopio de dos fotones. En 100 m de profundidad se midió resoluciones de 487 nm (laterales) y 551 nm (axial), eludiendo así los límites de dispersión y difracción.

Muy resuelto Microscopía intravital rayas-iluminación de centros germinales

Este protocolo describe cómo utilizar la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total para visualizar y rastrear receptores individuales en la superficie de las células vivas y, por lo tanto, analizar la movilidad lateral del receptor, el tamaño de los complejos de receptores, así como para visualizar las interacciones transitorias receptor-receptor. Este protocolo puede extenderse a otras proteínas de membrana.

De alta resolución espacio-temporal Análisis de la Dinámica del receptor por Casa molécula de microscopía de fluorescencia

La comunicación entre celulares es fundamental para el control de diversas actividades fisiológicas dentro y fuera de la célula. En este trabajo se describe un protocolo para la medición de la naturaleza espacio-temporal de las secreciones de células individuales. Para ello, se utiliza un enfoque multidisciplinario que integra nanoplasmonic etiqueta libre de detección con imágenes de células vivas.

Una técnica-Label libre para el Imaging espacio-temporal de las secreciones sola célula

La inmunidad adaptativa está controlada por 'sinapsis inmunológicas' dinámicas formadas entre las células T y las células presentadoras de antígenos. Este protocolo describe métodos para investigar las células endoteliales, tanto como APC fisiológicas poco estudiadas como un nuevo tipo de "modelo de APC celular plana".

Un modelo de la célula endotelial planar for Imaging inmunológica Synapse Dinámica

Para investigar las velocidades de flujo y la direccionalidad de la actina filamentosa en la sinapsis inmunológica de las células T, se combinan imágenes de superresolución de células vivas con fluorescencia de reflexión interna total y se cuantifican con espectroscopía de correlación de imágenes espacio-temporales.

Cortical de actina de flujo en células T cuantificados por espacio-temporal de correlación Imagen Espectroscopia de Estructurado Iluminación Microscopía de datos

Este protocolo describe un método basado en la proyección de imagen para activar los linfocitos T con photoactivatable péptido-MHC, que precisa control espacio-temporal de la activación de células T.

Control espacial y Temporal de la activación de células T con un agonista de la Photoactivatable

Aquí, presentamos un protocolo para visualizar células inmunes embebidas en una matriz de colágeno (3D) tridimensional mediante microscopía de luz de hoja. Este protocolo también explica cómo realizar el seguimiento de la migración celular en 3D. Este protocolo puede ser empleada para otros tipos de suspensión de células en la matriz 3D.

Microscopía de luz de hoja para la visualización tridimensional de las células inmunes humanas

Aprende a visualizar la dinámica tridimensional de receptores de células T en tiempo real mediante microscopía de hoja de luz de celosía. Este protocolo detallado permite obtener imágenes de alta resolución con mínimo fotoblanqueo.

Visualización de la dinámica del receptor de células T de superficie de cuatro dimensiones mediante la microscopía de hoja de luz de celosía (Video) | JoVE Journal

Visualización de la dinámica del receptor de células T de superficie de cuatro dimensiones mediante la microscopía de hoja de luz de celosía

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