Técnica de microinyección a Target a los países en desarrollo Xenopus riñón
3 de mayo de 2016
Aquí, presentamos un protocolo para utilizar mapas de destino y trazadores de linaje para dirigir inyecciones en blastómeros individuales que dan lugar al riñón de embriones de Xenopus laevis.
El objetivo general de este procedimiento es dirigir las microinyecciones al riñón de xenopus en desarrollo. Este método puede ayudar a abordar preguntas clave en el campo de la biología del desarrollo, como cómo se forma el riñón y qué genes son importantes para este proceso. La principal ventaja de esta técnica es que maximiza la entrega de reactivos microinyectados a un tejido objetivo.
La visualización de este método es importante porque la identificación del blastómero correcto para la microinyección dirigida es fundamental. Para comenzar este procedimiento, ambos testículos se aislaron de una sola rana macho y se colocaron en una placa de Petri de 60 milímetros llena de 10 milímetros de solución de almacenamiento de testículos. A continuación, almacene los testículos a cuatro grados centígrados.
A continuación, se recogieron los huevos de una rana hembra en una placa de Petri de 100 milímetros. Vierte el exceso de agua de la placa de Petri. Después de eso, corte un cuarto de un testículo en la solución de almacenamiento de testículos.
Transfiera el trozo de testículo a la placa de Petri que contiene los óvulos. Posteriormente, corte la porción de los testículos en trozos pequeños. Agregue MMR más gentamicina a la placa de Petri para cubrir los huevos.
Mézclalos girando el plato y luego espera aproximadamente 30 minutos para que la fertilización tenga lugar a temperatura ambiente. Después de la fertilización, el lado pigmentado de los embriones debe estar hacia arriba. Retire la MMR de la placa de Petri con una pipeta de transferencia y agregue suficiente solución de gelatina para cubrir los embriones.
Después, agita el plato durante los próximos minutos para disolver la capa de gelatina de los embriones. Una vez que los embriones se tocan estrechamente entre sí en el centro del plato, se ha eliminado la capa de gelatina. Retire la solución de gelatina con una pipeta de transferencia.
A continuación, lave los embriones desgelatinizados de 3 a 5 veces en MMR más Gentamicina vertiendo cuidadosamente la MMR y llenando el plato con MMR nuevo. No extraiga toda la MMR de la placa, ya que puede dañar los embriones. Después de eso, retira los óvulos no fertilizados o los trozos de testículo de la placa de Petri.
Para escalonar su desarrollo, coloque la mitad de los embriones de una sola fertilización en una placa de Petri mantenida a 14 grados centígrados, y la otra mitad de los embriones en una placa de Petri mantenida a 18 grados centígrados. Los embriones se desarrollarán más lentamente a los 14 grados centígrados que a los 18 grados centígrados. Lo que permite múltiples juegos de inyecciones desde un solo nido fertilizado.
Prepare la solución inyectable que contenga el punto cero, un nanogramo por nanolitro, ARNm de proteína fluorescente roja unida a la membrana. Mientras que los embriones se desarrollan a la etapa de 4 u 8 células. Mantenga la solución inyectable en hielo hasta su uso.
Luego, cargue un tubo capilar de vidrio de repuesto de siete pulgadas en un extractor de agujas con la parte superior del tubo de reemplazo alineada con la parte superior de la caja del extractor de agujas. Establezca el valor del número de calor dos en 800 y el valor de tracción en 650 y presione el botón de tracción para tirar de la aguja. Después de eso, corta la punta de la aguja tirada con un par de pinzas Dumont.
Deslice la pinza de micropipeta en la parte posterior de la aguja. A continuación, deslice la junta tórica del orificio grande en la parte posterior de la aguja detrás de la pinza. Ahora, llene la aguja con aceite mineral usando una aguja hiperdérmica de calibre 27, teniendo cuidado de que no entren burbujas de aire en la aguja.
Deslice la aguja en el émbolo del microinyector, colocando la aguja en el orificio grande del espaciador de plástico blanco instalado en el émbolo. Asegure la aguja apretando la pinza. A continuación, mantenga presionado el botón "Vaciar" en la caja de control del microinyector hasta que escuchen dos pitidos.
A continuación, pipetee tres microlitros de solución inyectable en una pieza de parafilm. A continuación, inserte la punta de la aguja en la perla de solución inyectable del parafilm. Mantenga presionado el botón "Llenar" en la caja de control del microinyector para introducir la solución inyectable en la aguja.
Antes de la microinyección, es importante comprender las primeras divisiones celulares del embrión de xenopus. El embrión unicelular tiene un polo animal de pigmentación oscura y un polo vegetal que es blanco y yoky. En el embrión de dos células, la primera escisión suele producirse entre los lados izquierdo y derecho del embrión.
Estas células contribuyen por igual al linaje pronefrico. La segunda escisión divide las mitades dorsal y ventral del embrión, dando lugar a un embrión de 4 células. Las células dorsales son más pequeñas y tienen menos pigmento que las células ventrales.
Si se inyecta en un embrión de 4 células, inyecte el blastómero ventral izquierdo para dirigirse al riñón izquierdo. La tercera división divide en dos los lados animal y vegetal. El resultado es un embrión de 8 células.
En este punto hay cuatro blastómeros animales y cuatro blastómeros vegetales. Para dirigirse al riñón izquierdo de un embrión de 8 células, inyecte en el blastómero vegetal ventral izquierdo. Posteriormente, llene una placa de Petri de 60 milímetros forrada con malla de poliéster de 500 micras con cinco por ciento de fycol en MMR más Gentamicina.
Pipetee cuidadosamente de 20 a 30 embriones de 8 células en el plato. Con un lazo para el cabello, manipule los embriones de modo que el blastómero que se va a inyectar quede frente a la aguja. Para apuntar al riñón izquierdo, alinee los embriones de modo que los blastómeros vegetales ventrales izquierdos de los embriones de 8 células miren hacia la aguja.
Inyecte 10 nanolitros de solución inyectable en el blastómero seleccionado de cada embrión en la placa. Luego, transfiera los embriones inyectados a los pocillos de una placa de cultivo con cinco por ciento de fycol en MMR más gentamicina. Incubar los embriones inyectados a 16 grados centígrados durante aproximadamente una o dos horas para permitir que los blastómeros inyectados sanen.
Después de eso, transfiera los embriones microinyectados a nuevos pocillos en la placa de cultivo llena de MMR más gentamicina. Incubar los embriones a 14 a 22 grados centígrados hasta que alcancen la etapa 38 a 40. En este procedimiento, transfiera de 10 a 20 embriones en la etapa 38 a 40 en un frasco de vidrio.
Agregue 10 microlitros de benzocaína al cinco por ciento en etanol al 100 por ciento al vial. Mezclar invirtiendo el vial y esperar 10 minutos para anestesiar los embriones. A continuación, retire la MMR del vial y llénelo con MEMFA.
Luego, colóquelo en una plataforma mecedora tridimensional durante una hora a temperatura ambiente. Después de una hora, retire el MEMFA del vial y llénelo con metanol al 100 por ciento. A continuación, coloque el vial en una plataforma tridimensional que se balancee durante diez minutos a temperatura ambiente.
Repita este paso de lavado una vez más y almacene los embriones en metanol al 100 por ciento durante la noche a menos 20 grados centígrados. Los embriones ya están fijados y listos para la inmunotinción. Este esquema muestra qué blastómero inyectar para dirigirse a los embriones de pronefros izquierdo de xenopus en la etapa de 8 células utilizando ARNm de proteína fluorescente roja unida a la membrana como trazador.
La localización del trazador después de la inyección en el blastómero vegetal ventral izquierdo se muestra en rojo, mientras que el riñón está marcado en verde. Esta imagen muestra que el riñón estaba teñido de verde con los anticuerpos 3G8 y 4A6. Aquí hay una vista de cerca de la región del riñón que muestra la loacalización del marcador y aquí está la imagen combinada que muestra la colocalización del marcador con el riñón.
Aquí se muestra la imagen confocal del riñón de un segundo embrión teñido con 3G8 y 4A6. Esta es la localización del marcador rojo en el riñón y el tejido circundante y esta es la imagen combinada que muestra la colocalización del marcador 3G8 y 4A6 en el riñón. Antes de realizar este procedimiento, es importante familiarizarse con el embrión temprano de xenopus.
Esto le permitirá dirigir correctamente las microinyecciones a través del mapa de desvanecimiento de xenopus establecido. Una vez dominada, esta técnica se puede adaptar para dirigirse a otros tejidos, como el tubo neural o el corazón.
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Resumen
Este protocolo describe un método para dirigir microinyecciones a blastómeros individuales que se desarrollan en el riñón de embriones de Xenopus laevis. Tiene como objetivo mejorar nuestra comprensión de la formación del riñón y de los genes implicados en este proceso.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología del desarrollo
- Embriología
- Análisis de la función génica
Antecedentes
- Comprender el desarrollo renal es fundamental en la biología del desarrollo.
- Las técnicas de microinyección permiten la administración precisa de reactivos.
- Identificar el blastómero correcto es esencial para realizar inyecciones exitosas.
- Este método puede ayudar a esclarecer el papel de los genes en la organogénesis.
Objetivo del estudio
- Investigar la formación del riñón en Xenopus laevis.
- Identificar genes importantes implicados en el desarrollo renal.
- Mejorar las técnicas para microinyección dirigida en embriones.
Métodos Utilizados
- Aislamiento de testículos de una rana macho.
- Preparación de la solución de almacenamiento de testículos.
- Almacenamiento de testículos a bajas temperaturas.
- Técnicas de visualización para la identificación de blastómeros.
Resultados principales
- Microinyecciones dirigidas con éxito a blastómeros específicos.
- Mejor comprensión de los procesos de desarrollo renal.
- Identificación de genes clave que influyen en la formación del riñón.
- Metodología mejorada para estudios futuros en biología del desarrollo.
Conclusiones
- Este protocolo proporciona un método confiable para estudiar el desarrollo renal.
- Las microinyecciones dirigidas pueden ofrecer información significativa sobre la función génica.
- La investigación futura puede basarse en estos hallazgos para explorar la organogénesis.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La microinyección dirigida en embriones de Xenopus permite un control espacial preciso de la expresión génica, reduciendo los efectos fuera del blanco y mejorando la claridad mecanicista en estudios del desarrollo. Este enfoque apoya la validación de dianas al vincular genes específicos con vías de organogénesis, como la formación del pronefros, con mínima perturbación sistémica. El método aumenta la confianza predictiva en fases tempranas del descubrimiento al aislar la función génica dentro de contextos tisulares definidos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la sobreexpresión o la inhibición de genes en blastómeros específicos que contribuyen al pronefros.
- Valor operativo: Reduce los efectos secundarios en tejidos no diana, aumentando la relación señal-ruido en las lecturas fenotípicas.
- Valor predictivo: Facilita la reducción de riesgos mecanicistas al aclarar el papel de los genes en el desarrollo renal mediante manipulaciones espacialmente restringidas.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera sistemas biológicos validados con células marcadas por linaje para el análisis posterior de la contribución pronefrica.
- Valor operativo: Utiliza la inmunotinción en montaje completo en la etapa 38–40 para evaluar cuantitativamente la integración de células diana en el pronefros.
- Reproducibilidad: Se basa en mapas de destino establecidos y en la consistencia del direccionamiento de blastómeros en embriones de 4 y 8 células.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Relevancia Translacional: El pronefros de Xenopus sirve como un sistema relevante para la enfermedad al modelar mecanismos conservados del desarrollo renal en vertebrados.
- Continuidad Mecanicista: Permite avanzar desde el descubrimiento de la función génica en embriones hasta el análisis de vías en modelos preclínicos.
- Avance Ajustado al Riesgo: Apoya decisiones de continuar o no continuar al validar la interacción con el blanco en un sistema orgánico en desarrollo antes de los estudios en mamíferos.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
La técnica se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano, conectando la modulación génica específica de blastómeros con la evaluación fenotípica en tejidos en desarrollo, e informando la selección de dianas para validación adicional.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis al restringir la manipulación génica a blastómeros de la línea del pronefros, aclarando la participación de vías en la organogénesis.
- Preparación del Ensayo: Produce embriones con localización verificada del trazador, permitiendo inmunotinciones e imágenes estandarizadas para el análisis cuantitativo del pronefros.
- Análisis: Facilita la comparación de la estructura pronefrica y la co-localización del trazador para evaluar el impacto de la función génica en el desarrollo renal.
- Investigación Traducional: Relaciona los hallazgos del pronefros embrionario con mecanismos conservados aplicables en modelos de enfermedades renales en mamíferos.
- Reutilización Empresarial: Adaptable a otros tejidos (por ejemplo, tubo neural, corazón) utilizando el mismo marco de microinyección guiado por mapa de destino celular.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la precisión en la validación de objetivos al minimizar los efectos de confusión derivados de la modulación génica generalizada.
- Valor operativo: Permite microinyecciones reproducibles y escalables en blastómeros definidos mediante pasos estandarizados de preparación e incubación.
- Valor estratégico: Mejora la selección de carteras al proporcionar vínculos más claros entre genotipo y fenotipo en un sistema orgánico en desarrollo.
- Impacto en la cartera: Reduce el riesgo biológico en fases avanzadas mediante la eliminación temprana de riesgos mecanicistas en objetivos relacionados con el riñón.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de embriones de Xenopus, identificación de blastómeros y técnicas de microinyección.
- Depende de equipos de inyección funcionales, incluyendo tiradores de micropipetas, microinyectores y sistemas de incubación con control de temperatura.
- Necesita protocolos estandarizados para la clasificación de embriones, fijación e inmunotinción para garantizar la consistencia entre experimentos.
- La adaptación a otros tejidos depende de mapas de destino celular precisos y de la exactitud en el direccionamiento de blastómeros.
- Las limitaciones prácticas incluyen la sensibilidad de la viabilidad embrionaria a cambios de temperatura y al trauma provocado por la inyección.
