Name: Técnica de microinyección a Target a los países en desarrollo Xenopus riñón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-03T11:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Aprende la técnica de microinyección dirigida al riñón en desarrollo de Xenopus laevis. Este método permite estudiar la formación renal y los genes involucrados en la organogénesis con precisión.

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Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud de subvención NIDDK (K01DK092320) y la financiación de inicio del Departamento de Pediatría de la Universidad de la Escuela de Medicina de Texas McGovern.

El siguiente protocolo ha sido aprobado por la Universidad de Texas Health Science Center en el Centro de Houston para el Laboratorio de Medicina Animal Comité de Bienestar Animal, que sirve de Atención Institucional y el empleo Comisión (protocolo #: HSC-AWC-13-135). 1. Identificación y Selección de blastómeros para inyección de riñón de orientación <ol><li> Antes de generar embriones, utilice la Tabla normal de Xenopus Desarrollo 21 para entender la orientación de las divisiones celulares tempranos en el embrión. Como alternativa, los diagramas de acceso de las etapas tempranas del desarrollo de Xenopus en Xenbase 11. </li><li> Acceder a los mapas interactivos del destino celular de Xenopus en Xenbase 11 para seleccionar qué blastómeras serán objeto de microinyección. </li><li> Observe que el embrión de una sola célula tiene un polo animal pigmentación oscura y un polo vegetal, que es blanco y Yolky. Tenga en cuenta que una membrana protectora, conocido como el vitelino envelope, cubre el embrión. </li><li> Observe que la primera división se produce típicamente entre los lados izquierdo y derecho del embrión. Estas células contribuyen por igual al linaje pronephric. </li><li> Tenga en cuenta que la segunda escisión divide el dorsal y mitades ventral del embrión, lo que lleva a un embrión de 4 células. Las células dorsales son más pequeños y tienen menos pigmento que las células ventrales (Figura 2A y la Figura 3A). <ol><li> Identificar los blastómeros ventral (V; los grandes, células oscuras) en los lados izquierdo y derecho, que contribuyen más al riñón en desarrollo que el dorsal (D; luz, células pequeñas) blastómeras (Figura 2A). </li><li> Si la inyección en un embrión de 4 celdas, inyectar el blastómeras ventral izquierdo para apuntar el riñón izquierdo (Figura 3A y la Sección 3). </li></ol></li><li> La tercera escisión biseca los lados animales y vegetales, lo que resulta en un embrión de ocho células. En este punto, hay cuatro blastómeras animales [izquierda y derecha ventral(V1) y dorsal (D1)] y cuatro blastómeros vegetales [izquierda y derecha ventral (V2) y dorsal (D2)] (Figura 2B y la Figura 3B). <ol><li> Localizar los vegetales, blastómeras ventral (V2). Estos blastómeras contribuyen más al riñón en desarrollo cualquier otra célula en esta fase (Figura 2B). Para orientar el riñón izquierdo de un embrión de 8 células, inyectar en el blastómeras la izquierda V2 (Figura 3B y la Sección 3). </li></ol></li><li> Observe que las divisiones cuarta y quinta bisecan los blastómeros animales y vegetales. Dos progenie se generó a partir de cada blastómero, resultando en un embrión de 16 células. Las células llevan el nombre de su predecesor. Por ejemplo, el blastómero V2 de la etapa de 8 células da lugar a V2.1 y V2.2 progenie en la fase de 16 células (Figura 2C). La célula V2.2 en la fase de 16 células proporciona la mayoría de las células que contribuyen a la riñón en desarrollo. </li><li> Tenga en cuenta las divisiones sexto y séptimo dan como resultado un embry 32 célulaso. Una vez más, dos progenie se generó a partir de cada blastómero, nombrados después de su predecesor. Por ejemplo, el blastómero V2.2 desde la etapa 16 de células da lugar a V2.2.1 y V2.2.2 en la etapa de 32 células. Hay un sistema de nomenclatura alternativa en la etapa de 32 células en el que se identifican las células en cuatro filas como A, B, C, y D (de animal a vegetal), y en cuatro columnas como 1, 2, 3, y 4 ( de dorsal a ventral). Por lo tanto, la blastómeros V2.2.2, que contribuye en mayor medida a los pronefros en desarrollo, se llama C3 bajo este sistema de denominación alternativa (Figura 2D). </li></ol> 2. Preparación de embriones <ol><li> Preparar 50 ml de Dejelly solución (2% de cisteína, NaOH a pH 8,0). </li><li> Aislar ambos testículos de un solo rana macho de acuerdo con protocolos estándar 14. Coloque los testículos en un plato de 60 mm Petri llena de 10 ml de solución de testículos de almacenamiento (de Marc 1x Modificado Ringers [MMR; 0,1 M NaCl, KCl 2 mM, 1 mM MgSO 4, 2 mMCaCl 2, 5 mM de HEPES pH 8, EDTA 0,1 mM] 12, 1% de albúmina de suero bovino, 50 mg / ml de gentamicina). Almacenar los testículos a 4 ° C. Nota: Los testículos se pueden almacenar durante aproximadamente 7 a 10 días a 4 ° C, pero la eficiencia de fertilización disminuirá cuanto más tiempo los testículos se han almacenado. </li><li> Exprimir una rana hembra para obtener huevos de acuerdo con protocolos estándar 14. Recoge los huevos en una placa de Petri de 100 mm. Verter el exceso de agua. </li><li> Cortar ¼ de un testículo mientras está en solución de almacenamiento Testículos utilizando fórceps y una hoja de afeitar. La transferencia de la pieza de testículo a la placa de Petri que contiene los huevos. Ajustar el tamaño de la porción de testículo utilizado para contabilizar el tamaño de los testículos, el tiempo que el testículo se ha almacenado, y cuántos son los huevos para ser fertilizados. Generalmente utilizar ¼ a 1/3 de un testículo recién disecados para fertilizar un embrague de huevos. </li><li> Cortar la parte de testículo en trozos pequeños con fórceps y una hoja de afeitar. Agregar suficiente MMR 0.3x+ 30 mg / ml de gentamicina a la placa de Petri para cubrir los huevos. Agitar la MMR en el plato para mezclar. </li><li> Espere aproximadamente 30 minutos para la fertilización se lleve a cabo a temperatura ambiente. Tenga en cuenta que el hemisferio animal (por el lado pigmentada del embrión) se sentará en la parte superior del embrión tras la fecundación efectiva. A continuación, retire el MMR de la placa de Petri con una pipeta de transferencia. Agregar suficiente Solución Dejelly al plato para cubrir los embriones. </li><li> En los próximos minutos, agitar suavemente el plato de forma intermitente. agitación vigorosa del plato en este momento puede causar defectos de eje. &#160; La capa de gelatina en los embriones se disolverá, y los embriones se congregan en el centro del plato durante el revolver. Una vez que los embriones se tocan de cerca el uno al otro en el centro del plato, eliminar la solución Dejelly con una pipeta de transferencia. No deje embriones en la solución Dejelly durante más de 5 minutos, o los embriones pueden ser dañados. </li><li> Lavar los embriones dejellied 3 - 5 veces en 0.3xMMR + 30 mg / ml de gentamicina mediante el vertido de cuidado o de pipeteado de la triple vírica y llenar el plato con el nuevo MMR. No quite toda la MMR del plato, o los embriones pueden ser dañados. </li><li> Retire cualquier huevos no fertilizados o piezas de testículo de la placa de Petri con una pipeta de transferencia. </li><li> Incubar los embriones entre 14 y 22 ° C. Nota: Los embriones se cultivan a temperaturas más bajas se desarrollan más lentamente que los embriones cultivados a temperaturas más altas. El momento de las etapas de desarrollo se puede encontrar en Xenbase 22. <ol><li> Para espaciar su desarrollo, el lugar de la mitad de los embriones de una sola fertilización en una placa de Petri se mantuvo a 14 ° C, y la otra mitad de los embriones en una placa de Petri se mantuvo a 18 ° C. Esto permite utilizar dos conjuntos de inyecciones en 4 u 8 de células de células de embriones de una sola fertilización. </li></ol></li></ol> 3. Preparación de soluciones de inyección y microinyección de embriones <ol><li> Preparar la solución inyectable que contiene 0,01ng / nl proteína unida a la membrana roja fluorescente (RFP-MEM) ARNm 9, mientras que los embriones se desarrollan para la etapa de 4 células o de 8 celdas. Almacenar la solución de inyección en hielo hasta que esté listo para inyectar. </li><li> Cargar un &quot;tubo capilar de vidrio de repuesto en un extractor de aguja, con la parte superior del tubo de reemplazo alineado con la parte superior de la caja de aguja extractora. Establecer el valor de calor No. 2 a 800, y el valor de extracción a 650. Pulse la tecla&quot; 7 tire &quot;botón para tirar de la aguja. Esto creará 2 agujas de un solo 7&quot; tubo capilar de vidrio. </li><li> Cortar la punta de una aguja desmenuzado con un par de pinzas Dumont. Nota: Después de sacar la aguja, la punta está sellada y debe ser cortada abierta. Cuanto más cerca de la punta de la aguja que se corta, menor es el diámetro será la punta de la aguja. Aunque el diámetro de la punta no afectará el volumen de inyección con el sistema de microinyección se utiliza aquí, una punta con un diámetro más grande es más probable que el daño del embrión. </li><li> Deslizar el mpinza icropipette en la parte posterior de la aguja. A continuación, deslice el anillo O grande agujero en la parte posterior de la aguja detrás de la pinza. </li><li> Llene la aguja con aceite mineral utilizando una aguja hipodérmica de calibre 27, con cuidado de no obtener burbujas de aire en la aguja. </li><li> Slip la aguja en el émbolo de la microinyector, con capacidad para la aguja en el agujero grande del espaciador de plástico blanco instalado en el émbolo. El émbolo debe tener una pequeña junta tórica más cercana al cuerpo del microinyector, seguido por el espaciador blanco, gran junta tórica agujero, y el collar. Asegure la aguja apretando la pinza. Tire suavemente de la aguja para asegurarse de que está bien sujeto. </li><li> Pulse y mantenga pulsado el botón de &quot;vacío&quot; en la caja de control microinyector hasta hay dos pitidos. </li><li> Pipetear 3 l de solución de inyección en un trozo de Parafilm. Inserte la punta de la aguja en el talón de la solución de inyección en el Parafilm. Mantenga pulsado el botón de &quot;relleno&quot; en la microinjector caja de control para dibujar la solución de inyección en la aguja. </li><li> Llenar un plato de 60 mm Petri forrada con 500 micras de poliéster de malla con 5% de Ficoll en 0.3x MMR + 30 mg / ml de gentamicina. Con cuidado, pipetear 20 - 30 4 células o 8 de células de embriones en el plato. </li><li> El uso de un bucle de pelo 14, manipular los embriones de modo que el blastómero a inyectar se enfrenta a la aguja. Para orientar el riñón izquierdo, alinee los embriones para que los blastómeros ventral izquierda de embriones de 4 células o los blastómeros V2 dejado de embriones de 8 células se enfrentan a la aguja. </li><li> Inyectar 10 nl de solución de inyección en el blastómero seleccionado de cada embrión en el plato. Nota: La malla en la parte inferior de la placa de Petri estabiliza los embriones y les impide laminados, lo que les permite ser inyectados sin el uso de un bucle de pelo para la estabilización. </li><li> Transferencia de embriones inyecta en los pocillos de una placa de cultivo que se han llenado con un 5% de Ficoll en 0.3x MMR + 30 mg / ml de gentamicina. Incubar el embrión inyectados a 16 ° C durante al menos una hora para permitir que los blastómeros inyectados para sanar. </li><li> La transferencia de los embriones curadas en pocillos de una nueva placa de cultivo que se han llenado con 0.3x MMR + 30 mg / ml de gentamicina por la etapa 9 (antes de la gastrulación). </li><li> Incubar los embriones a 14-22 ° C hasta que los embriones alcanzan etapa 38 a 40 21. </li></ol> 4. La fijación y la inmunotinción de embriones <ol><li> Preparar 50 ml de sulfato de MOPS / EGTA / magnesio / formaldehído Buffer [MEMFA: MOPS 100 mM (pH 7,4), EGTA 2 mM, MgSO mM 4, 3,7% (v / v) de formaldehído 1]. </li><li> Usando una pipeta de transferencia, puesto 10-20 etapa 38 - 40 embriones en un vial de vidrio. Añadir 10 l 5% benzocaína en 100% de etanol al vial vial y invertido para mezclar. Espere 10 minutos para anestesiar a los embriones. </li><li> Eliminar la MMR del vial usando una pipeta de vidrio. Si el procesamiento de múltiples viales al mismo tiempo, los viales se pueden mantener en posición vertical en una placa de cultivo celular de 24 pocillos. </li><li> Con un tubo de vidrioTTE, llenar el vial con MEMFA. Colocar el vial en una plataforma oscilante en tres dimensiones durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Eliminar la MEMFA del vial usando una pipeta de vidrio. Llene el vial con metanol al 100%. Colocar el vial en una plataforma oscilante en tres dimensiones para 10 min a temperatura ambiente. Repita este paso de lavado una vez más, y almacenar los embriones en 100% durante la noche metanol a -20 ° C. </li><li> Preparar 1x Phosphate Buffered Saline-albúmina de suero bovino-Triton (PBT): 1x PBS, 2 mg / ml de albúmina de suero bovino, 0,1% de Triton X-100. </li><li> Preparar la solución de anticuerpo primario: 1x PBT con 10% de suero de cabra con una dilución 1: 5 de ratón monoclonal 4A6 anticuerpo (para etiquetar las membranas de los túbulos intermedios, distales y de conexión 20), una dilución de uno y treinta minutos de anticuerpo monoclonal de ratón 3G8 (a lumen de la etiqueta de los túbulos proximales 20), y una dilución 1: 250 de anticuerpo policlonal de conejo RFP (para etiquetar el trazador MEM-RFP). Almacenar a 4 ° C. </li><li> Preparar la secondasolución de anticuerpo ry: 1x PBT con suero de cabra al 10%, 1: 500 Alexa 488 cabra anti-ratón IgG (concentración de solución madre 2 mg / ml; a la etiqueta 4A6 y 3G8) y 1: 500 Alexa 555 IgG de cabra anti-conejo (Stock concentración 2 mg / ml; para etiquetar el trazador MEM-RFP). Almacenar a 4 ° C, que cubre el tubo de papel de aluminio para protegerlo de la luz. </li><li> Alternativamente, recoger los anticuerpos primarios y secundarios después de la tinción, y guardar a 4 ° C para su reutilización en futuros experimentos. Si el anticuerpo se va a guardar para su reutilización, añadir azida de sodio al 0,01%. </li><li> Immunostain los embriones utilizando protocolos establecidos 18. </li></ol> 5. La visualización de los embriones y los análisis del tejido pronephric Targeted <ol><li> Se tamizan los embriones inmunoteñidas para verificar que el blastómero correcta se inyectó mediante la visualización de la fluorescencia del trazador bajo un estereomicroscopio fluorescente a 1X (para ver embrión entero) y 5X (para ver riñón) ampliación. Coloque los embriones en una placa de vidrio de múltiples pocillos con el queLLS llenos de 1x PBT utilizando una pipeta de transferencia con la punta cortada. Manipular los embriones con un bucle de cabello. Usar sólo los embriones que tienen la co-inyección de trazador presente en el pronefros en el lado izquierdo del embrión (Figura 3C, F y la Figura 4C, F) para la sobreexpresión del gen o el análisis de caída. </li><li> Como alternativa, desactive los embriones de Murray en Clear (2 partes de benzoato de bencilo: 1 de alcohol de bencilo parte) mediante la colocación de los embriones en un vial de vidrio y llenar el vial de Murray con Claro. Visualizar los embriones utilizando una placa de vidrio. Nota: Claro de Murray es un disolvente orgánico, y debe ser manejado con cuidado. Use guantes, y sólo utilizar viales de vidrio y pipetas de Murray con Claro. </li><li> embriones se almacena a 4 ° C en 1x PBT durante 2 - 3 semanas. Para el almacenamiento a largo plazo de embriones, los embriones deshidratar por lavado dos veces en 100% de metanol a temperatura ambiente durante 10 min. Almacenar los embriones a -20 ° C en metanol al 100%. </li></ol>

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<li>Uochi, T. S., Takahashi, S., Ninomiya, H., Fukui, A., Asashima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Na%2B%2C+K%2B-ATPase+alpha+subunit+requires+gastrulation+in+the+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">The Na+, K+-ATPase alpha subunit requires gastrulation in the Xenopus embryo.</a> Dev. Growth Differ. 39 (5), 571-580 (1997).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNieuwkoop%2C+PD+%22Normal+table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29%3A+A+systematical+%26+chronological+survey+of+the+development+from+the+fertilized+egg+till+the+end+of+metamorphosis%22">Normal table of Xenopus laevis (Daudin): A systematical & chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis</a>. , Garland Publishing, Inc. NY. (1994).</li>
<li>Ubbels, G. A., Hara, K., Koster, C. H., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+functional+role+of+the+cytoskeleton+in+determination+of+the+dorsoventral+axis+in+Xenopus+laevis+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Evidence for a functional role of the cytoskeleton in determination of the dorsoventral axis in Xenopus laevis eggs.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 77, 15-37 (1983).</li>
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<li>Colman, A., Drummond, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stability+and+movement+of+mRNA+in+Xenopus+oocytes+and+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morph%22%5BJournal%5D)">The stability and movement of mRNA in Xenopus oocytes and embryos.</a> J. Embryol. Exp. Morph. 97, 197-209 (1986).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Orientación de los pronefros de desarrollo de embriones de Xenopus se basa en la identificación y la inyección de la blastómeros correcta. La inyección de la V2 de blastómeros de embriones de 8 células se dirige a los pronefros izquierda 18. Esto deja el pronefros derecho contralateral como control interno. Si morfolino desmontables o ARN sobreexpresión se utiliza para modificar el desarrollo del riñón, el pronefros derecho contralateral se pueden utilizar para comparar los efectos del gen desmontabl...

El riñón embrionario de Xenopus, el pronefros, es un buen modelo para estudiar el desarrollo del riñón y la enfermedad. Los embriones se desarrollan externamente, son de tamaño grande, se pueden producir en grandes cantidades, y son fácilmente manipulados mediante microinyección o procedimientos quirúrgicos. Además, se conservan los genes que regulan el desarrollo del riñón en mamíferos y anfibios. Riñón de los mamíferos desarrollará en tres etapas: el pronefros, mesonefros y metanefros 1, mientras que los anfibios embrionarias tienen un pronefros y anfibios adultos tienen un metanefros. La unidad de filtrado básico de estas formas de riñón es la nefrona, y ambos mamíferos y anfibios requieren las mismas cascadas de señalización y eventos de inducción para someterse a nefrogénesis 2, 3. Los pronefros Xenopus contiene una sola nefrona compuesto por proximal, intermedia, distal y la conexión de los túbulos, y un glomus (análogo al glomérulo mamífero) 1, 4 a 6 (Figura 1 </strong&gt;). El único, gran nefrona presente en el pronefros de Xenopus lo hace adecuado como un modelo simple para el estudio de genes implicados en los procesos de desarrollo del riñón y enfermedades. Mapas del destino celular se han establecido los primeros embriones de Xenopus, y están libremente disponibles en línea en Xenbase 7-11. A continuación, describimos una técnica de microinyección de marcadores de linaje para orientar el pronefros Xenopus en desarrollo, aunque la misma técnica se puede adaptar a dirigirse a otros tejidos como el corazón o los ojos. trazadores Lineage son etiquetas (incluidos colorantes vitales, dextranos marcados con fluorescencia, enzimas histoquímicamente detectables, y mRNA que codifican proteínas fluorescentes) que se pueden inyectar en un blastómero temprano, lo que permite la visualización de la progenie de esa célula durante el desarrollo. Este protocolo utiliza MEM-RFP ARNm, que codifica la membrana dirigida proteína fluorescente roja 12, como trazador de linaje. La tecnología orientada microinyeccióntécnicas para blastómeros individuales en embriones de 8 celdas de 4 y descritos aquí pueden ser utilizados para la inyección con morfolinos para derribar la expresión de genes, o con ARN exógeno que sobreexpresan un gen de interés. Inyectando en el blastómeras ventral, vegetal, principalmente se dirigirán los pronefros del embrión, dejando el pronefros contralateral como control del desarrollo. Co-inyección de un trazador verifica que se inyectó el blastómero correcta, y muestra que los tejidos en el embrión surgió de la blastómero inyectado, la verificación de la orientación de los pronefros. La inmunotinción de las pronefros permite la visualización de lo bien que han sido blanco de los túbulos pronéfricos. Sobreexpresión y desmontables efectos pueden ser marcados contra el lado contralateral del embrión, que sirve como un control de desarrollo, y se pueden utilizar para calcular el índice pronephric 13. La disponibilidad de mapas destino celular permite que esta técnica de microinyección concretas, que sirva a los tejidos diana OTHer que los pronefros y co-inyección de un trazador fluorescente permite la microinyección dirigida a cada tejido a ser verificada antes del análisis. Durante la microinyección de embriones, la temperatura de desarrollo debe ser regulada fuertemente, dado que la tasa de desarrollo de Xenopus es altamente dependiente de ella 14. Los embriones se incubaron a temperaturas más bajas (14 - 16 ° C) para las inyecciones de células 4- 8 y debido a que el tiempo de desarrollo se hace más lenta. A 22 ° C, el tiempo de desarrollo de la etapa 1 (1 célula) a la etapa 3 (4 celdas) es de aproximadamente 2 horas, mientras que a los 16 años el tiempo de desarrollo ° C a la etapa 3 es de aproximadamente 4 horas. Se tarda aproximadamente 15 minutos para el final de un embrión de 4 células a una de 8 celdas (etapa 4) de embriones a los 22 ° C, pero tarda aproximadamente 30 minutos a 16 ° C. Del mismo modo, a 22 ° C, sólo se tarda 30 minutos para que un embrión de 8 células para pasar a un embrión de 16 células (etapa 5). Este tiempo se aumentó a 45 minutos a 16 ° C. losrefore, es útil para disminuir la tasa de desarrollo de los embriones para permitir tiempo suficiente para que las inyecciones en la etapa de 8 células antes de que los embriones pasar a la fase de 16 células. Además, las temperaturas de crecimiento pueden modularse para acelerar o ralentizar el desarrollo embrionario hasta que el riñón ha desarrollado plenamente. La epidermis de renacuajo etapa embriones de Xenopus es relativamente transparente, permitiendo una fácil obtención de imágenes de los pronefros en desarrollo sin disección o limpieza del tejido 15. Debido a la relativa transparencia de los embriones de Xenopus, imágenes de células vivas es también factible 16,17. Todo el montaje inmunotinción para visualizar el pronefros es posible con anticuerpos establecidos que etiquetan los extremos proximal, intermedio y distal túbulos de conexión de fase de 38 - 40 embriones que permiten la evaluación del desarrollo pronephric después de la manipulación específica de la expresión génica en embriones de Xenopus 18-20.

<table><tbody><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Fisher</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>S311-500</td><td></td></tr><tr><td>Solución de gentamicina, 50 mg/ml</td><td>Amresco</td><td>E737-20ML</td><td></td></tr><tr><td>L-Cisteína, 99%+</td><td>Acros Organics</td><td>52-90-4</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Fisher</td><td>BP525-100</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de 100 mm x 15 mm</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Mini Nevera II</td><td>Boekel</td><td>260009</td><td>Incubadora de sobremesa para embriones.</td></tr><tr><td>Plásmido</td><td></td><td></td> Gap43-RFP <td>Para hacer ARN trazador. Referencia: Davidson et al., 2006.</td></tr><tr><td>Rhodamine dextrano, 10.000 M.W.</td><td>Invitrogen</td><td>D1817</td><td>Tracer.</td></tr><tr><td>Grado de biología molecular, agua purificada estéril USP</td><td>Corning</td><td>46-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>7" Tubos de repuesto</td><td>Drummond Drummond</td><td>3-000-203-G/XL</td><td>Agujas de microinyección.</td></tr><tr><td>Tirador de agujas</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-30</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas finas</td><td>Dumont</td><td>11252-30</td><td>Para romper la punta de la aguja de microinyección.</td></tr><tr><td>Microinyector</td> <td>Nanoject II</td><td>Drummond</td><td>3-000-204</td>.</tr><tr><td>Aceite mineral, pesado</td><td>Fisher</td><td>CAS 8042-47-5</td><td>Aceite para agujas.</td></tr><tr><td>27 G Aguja hipodérmica monoyecto</td><td>Covidien 8881200508</td><td></td><td>Para cargar aceite mineral en la aguja de microinyección.</td></tr><tr><td>Jeringa Luer-Lok</td><td>BD</td><td>309646</td> de 5 ml <td>Para cargar aceite mineral en la aguja de microinyección.</td></tr><tr><td>Placa de Petri de 60 mm x 15 mm</td><td>Fisher</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>800 micras Malla de poliéster</td><td>Piezas pequeñas</td><td>CMY-0800-C</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de transferencia</td><td>Fisher</td><td>13-711-7M</td><td>Para la transferencia de embriones. Corte la punta para que los embriones sean fácilmente absorbidos por la pipeta.</td></tr><tr><td>Placa de cultivo celular de 6 pocillos</td><td>Nest Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Fisher</td><td>BP308-500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Acros Organics</td><td>67-42-5</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehído</td><td>Fisher</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>15 mm x 45 mm Frasco de rosca</td><td>Fisher</td><td>03-339-25B</td><td>Para fijar, teñir y almacenar embriones.</td></tr><tr><td>Célula de 24 pocillos Placa de cultivo</td><td>Nest Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benzocaína</td><td>Spectrum</td><td>BE130</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher</td><td>BP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x polvo</td><td>Fisher</td><td>BP661-50</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina de suero bovino</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>3D Mini balancín, modelo 135</td><td>Denville Scientific</td><td>57281</td><td></td></tr><tr><td>Suero de cabra, origen neozelandés</td><td>Invitrogen</td><td>16210064</td><td></td></tr><tr><td>Azida sódica</td><td>Fisher</td><td>S227I-25</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal 3G8</td> Centro Europeo de Recursos <td></td> de <td>Xenopus</td><td>Anticuerpo primario para marcar proximal Túbulos.</td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal 4A6</td><td>European Xenopus Resource Centre</td><td></td><td>Anticuerpo primario para marcar túbulos intermedios, distales y conectantes.</td></tr><tr><td>anti-RFP pAb, IgG/conejo purificado</td><td>MBL</td><td>PM005</td><td>Anticuerpo primario para marcar el trazador Gap43-RFP.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 cabra anti-ratón IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11001</td><td>Anticuerpo secundario para marcar túbulos renales.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 cabra anti-conejo IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A21428</td><td>Anticuerpo secundario para marcar el trazador Gap43-RFP.</td></tr><tr><td>Placa puntual de 9 cavidades</td><td>Corning</td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>Benzoato de bencilo</td><td>Fisher</td><td>105862500</td><td>Opcional - para la eliminación de embriones</td></tr><tr><td>Alcohol bencílico</td><td>Fisher</td><td>A396-500</td><td>Opcional - para la eliminación de embriones</td></tr></tbody></table>

técnica de microinyección a target a los países en desarrollo<em&gt; xenopus</em&gt; riñón

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

El riñón embrionario de Xenopus laevis (rana), el pronefros, consta de una sola nefrona, y se puede utilizar como un modelo para la enfermedad renal. Embriones de Xenopus son grandes, desarrollar externamente, y pueden ser manipulados fácilmente por microinyección o procedimientos quirúrgicos. Además, se han establecido mapas de destino para los primeros embriones de Xenopus. microinyección dirigida en el blastómero individuo que finalmente dará lugar a un órgano o tejido de interés se puede utilizar para sobreexpresar selectivamente o derribar a la expresión de genes dentro de esta región restringida, la disminución de los efectos secundarios en el resto del embrión en desarrollo. En este protocolo, se describe la forma de utilizar los mapas de destino de Xenopus establecidos para apuntar el riñón en desarrollo Xenopus (el pronefros), a través de microinyección en blastómeros de embriones específicos de células y 8 4-. La inyección de trazadores linaje permite la verificación de la orientación específica de la inyección.Después de embriones se han desarrollado hasta la etapa 38 - 40, todo el montaje inmunotinción se utiliza para visualizar el desarrollo pronephric, y la contribución de las células diana a las pronefros se puede evaluar. La misma técnica se puede adaptar a dirigirse a otros tipos de tejidos además de las pronefros.

Microinyecciones de 4 y 8 células embriones de Xenopus con MEM-RFP ARNm muestran diferentes niveles de focalización para el pronefros. La figura 4 muestra la etapa 40 embriones con los patrones de expresión de ARNm MEM-RFP correctas. Los embriones fueron inyectados en el blastómero ventral izquierdo (Figura 4A), y clasifican para el patrón de expresión adecuado de MEM-RFP mRNA. Además de expresar MEM-RFP en el proximal, intermedio, distal y la c...

Aquí, presentamos un protocolo para utilizar mapas de destino y trazadores de linaje para dirigir inyecciones en blastómeros individuales que dan lugar al riñón de embriones de Xenopus laevis.

Técnica de microinyección a Target a los países en desarrollo<em&gt; Xenopus</em&gt; riñón

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

El objetivo general de este procedimiento es dirigir microinyecciones al riñón en desarrollo de Xenopus. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del desarrollo, como cómo se forma el riñón y qué genes son importantes para este proceso. La principal ventaja de esta técnica es que maximiza la entrega de reactivos microinyectados a un tejido específico.La visualización de este método es importante porque la identificación del blastómero correcto para la microinyección dirigida es fundamental. Para comenzar este procedimiento, se aislaron ambos testículos de una sola rana macho y se colocaron en una placa de Petri de 60 milímetros llena con 10 mililitros de solución de almacenamiento de testículos. Luego, almacene los testículos a cuatro grados Celsius.A continuación, se recogieron óvulos de una rana hembra en una placa de Petri de 100 milímetros. Retire el exceso de agua de la placa de Petri. Después, corte un cuarto de un testículo en Solución de Almacenamiento de Testículos.Transfiera el fragmento de testículo a la placa de Petri que contiene los huevos. Posteriormente, corte la porción de testículo en trozos pequeños. Añada MMR más gentamicina a la placa de Petri para cubrir los huevos.Mézclelos girando suavemente el recipiente y luego espere aproximadamente 30 minutos para que tenga lugar la fertilización a temperatura ambiente. Después de la fertilización, el lado pigmentado de los embriones debe quedar orientado hacia arriba. Retire el MMR del recipiente de Petri utilizando una pipeta de transferencia y agregue suficiente solución desgelificante para cubrir los embriones.Posteriormente, agite suavemente el recipiente durante los siguientes minutos para disolver la capa de gelatina de los embriones. Una vez que los embriones estén en contacto cercano entre sí en el centro del recipiente, se habrá eliminado la capa de gelatina. Retire la solución desgelificante con una pipeta de transferencia.A continuación, lave los embriones desprovistos de la capa de gelatina de 3 a 5 veces en MMR más gentamicina, vertiendo cuidadosamente el MMR y rellenando el recipiente con MMR nuevo. No retire todo el MMR del recipiente, ya que podría dañar los embriones. Después de eso, retire los huevos no fertilizados o los fragmentos de testículo del recipiente de Petri.Para escalonar su desarrollo, coloque la mitad de los embriones de una sola fertilización en una placa de Petri mantenida a 14 grados Celsius, y la otra mitad de los embriones en una placa de Petri mantenida a 18 grados Celsius. Los embriones se desarrollarán más lentamente a 14 grados Celsius que a 18 grados Celsius. Esto permite realizar múltiples series de inyecciones a partir de un solo desove fertilizado.Prepare la solución de inyección que contiene punto cero uno nanogramos por nanolitro de ARNm de Proteína Fluorescente Roja Unida a la Membrana. Mientras los embriones se desarrollan hasta la etapa de 4 o 8 células. Mantenga la solución de inyección en hielo hasta su uso.Luego, cargue un tubo capilar de vidrio de reemplazo de siete pulgadas en un extractor de agujas, alineando la parte superior del tubo de reemplazo con la parte superior de la carcasa del extractor. Establezca el valor de calor dos en 800 y el valor de tracción en 650, y presione el botón de tracción para extraer la aguja. Después de eso, corte la punta de la aguja extraída con un par de pinzas Dumont.Deslice el casquillo del micropipeta hacia la parte trasera de la aguja. A continuación, deslice la junta tórica de orificio grande hacia la parte trasera de la aguja, detrás del casquillo. Ahora, llene la aguja con aceite mineral utilizando una aguja hipodérmica de calibre 27, teniendo cuidado de no introducir burbujas de aire en la aguja.Coloque la aguja en el émbolo del microinyector, insertando la aguja en el orificio grande del espaciador de plástico blanco instalado en el émbolo. Sujete la aguja apretando el casquillo. A continuación, presione y mantenga presionado el botón "Empty" en la caja de control del microinyector hasta que suenen dos pitidos.A continuación, pipetee tres microlitros de la solución de inyección sobre un trozo de parafilm. Luego, inserte la punta de la aguja en la gota de solución de inyección sobre el parafilm. Presione y mantenga pulsado el botón "Fill" en la caja de control del microinyector para aspirar la solución de inyección dentro de la aguja.Antes de la microinyección, es importante comprender las primeras divisiones celulares del embrión de Xenopus. El embrión unicelular tiene un polo animal oscuramente pigmentado y un polo vegetal que es blanco y lleno de yema. En el embrión de dos células, la primera división generalmente ocurre entre los lados izquierdo y derecho del embrión.Estas células contribuyen por igual a la línea pronefrica. La segunda división separa las mitades dorsal y ventral del embrión, dando lugar a un embrión de 4 células. Las células dorsales son más pequeñas y tienen menos pigmento que las células ventrales.Si se inyecta en un embrión de 4 células, inyecte el blastómero ventral izquierdo para dirigirse al riñón izquierdo. La tercera división segmenta los lados animal y vegetal, dando como resultado un embrión de 8 células.En este momento hay cuatro blastómeros animales y cuatro blastómeros vegetales. Para dirigirse al riñón izquierdo de un embrión de 8 células, inyecte en el blastómero vegetal ventral izquierdo. Posteriormente, llene una placa de Petri de 60 milímetros forrada con malla de poliéster de 500 micrones con ficol al cinco por ciento en MMR más gentamicina.Pipetee cuidadosamente de 20 a 30 embriones de 8 células dentro del platillo. Utilizando un lazo de cabello, manipule los embriones de manera que la blastómera que se va a inyectar quede frente a la aguja. Para dirigirse al riñón izquierdo, alinee los embriones de modo que las blastómeras vegetales ventrales izquierdas de los embriones de 8 células queden orientadas hacia la aguja.Inyecte 10 nanolitros de solución de inyección en el blastómero seleccionado de cada embrión en la placa. Luego, transfiera los embriones inyectados a los pocillos de una placa de cultivo con ficol al cinco por ciento en MMR más gentamicina. Incube los embriones inyectados a 16 grados Celsius durante aproximadamente una a dos horas para permitir que los blastómeros inyectados sanen.Después de eso, transfiera los embriones microinyectados a nuevos pocillos en la placa de cultivo llenos con MMR más Gentamicina. Incube los embriones a 14-22 grados Celsius hasta que alcancen la etapa 38-40. En este procedimiento, transfiera 10-20 embriones de la etapa 38 a 40 a un vial de vidrio.Añada 10 microlitros de benzocaína al cinco por ciento en etanol al cien por ciento al vial. Mezcle invirtiendo el vial y espere 10 minutos para anestesiar los embriones. A continuación, retire el MMR del vial y llénelo con MEMFA.Luego, colóquelo en una plataforma tridimensional con movimiento oscilante durante una hora a temperatura ambiente. Después de una hora, retire el MEMFA del vial y llénelo con metanol al 100 por ciento. A continuación, coloque el vial en una plataforma tridimensional con movimiento oscilante durante diez minutos a temperatura ambiente.Repita este paso de lavado una vez más y almacene los embriones en metanol al 100 % durante la noche a menos 20 grados Celsius. Los embriones ya están fijados y listos para la inmunotinción. Este esquema muestra qué blastómero inyectar para dirigirse al pronefros izquierdo de embriones de Xenopus en la etapa de 8 células utilizando ARNm de proteína fluorescente roja unida a membrana como trazador.La localización del trazador tras la inyección en el blastómero ventral vegetal izquierdo se muestra en rojo, mientras que el riñón se etiqueta en verde. Esta imagen muestra que el riñón fue teñido en verde con los anticuerpos 3G8 y 4A6. A continuación se muestra una vista ampliada de la región del riñón que muestra la localización del trazador, y aquí se presenta la imagen fusionada que muestra la co-localización del trazador con el riñón.Se muestra aquí la imagen confocal del riñón de un segundo embrión teñido con 3G8 y 4A6. Esta es la localización del trazador rojo en el riñón y el tejido circundante, y esta es la imagen fusionada que muestra la co-localización de los trazadores 3G8 y 4A6 en el riñón. Antes de realizar este procedimiento, es importante familiarizarse con el embrión temprano de Xenopus.Esto le permitirá dirigir adecuadamente las microinyecciones mediante el mapa de atenuación establecido de Xenopus. Una vez dominada, esta técnica puede adaptarse para dirigirse a otros tejidos, como el tubo neural o el corazón.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Aquí se demuestra la microinyección citoplasmática...

Microinyección de oocitos de Xenopus laevis

Microinyección es un método bien establecido y eficaz para la introducción de sustancias extrañas en embriones de pez cebra fecundado. Este sentido, demuestran una sólida técnica de microinyección para la realización de la sobreexpresión de ARNm, y morpholino oligonucleótidos estudios caída de genes en el pez cebra.

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Los cultivos neuronales de explantes de<em&gt; Xenopus laevis</em

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Microinyección intravenosa de nefrotoxinas en embrión de pez cebra: una técnica para administrar agentes nefrotóxicos en el torrente sanguíneo de un embrión de pez cebra

Los métodos que producen embriones morphant son esenciales para estudiar los mecanismos de desarrollo y redes reguladoras de genes. La estrella de mar patiria miniata es un sistema modelo emergente para estos estudios. Aquí se presenta un protocolo para la obtención de gametos, la producción de cultivos de embriones, y la rápida microinyección de cigotos de esta especie.

Un método para la microinyección de Patiria minata Los cigotos

El manuscrito que aquí ofrece un simple conjunto de métodos para el análisis de la secreción y la difusión de ligandos marcados con fluorescencia en Xenopus. Esto proporciona un contexto para probar la capacidad de otras proteínas para modificar la distribución de ligando y permitir que los experimentos que pueden dar información sobre los mecanismos que regulan los gradientes de morfogenes.

Uso del análisis confocal de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Encargado de investigar moduladores de Wnt y Shh morfógeno Degradados

Las lesiones renales efectuados desde nefrotóxicos, que incluyen medicamentos que van desde antibióticos a los agentes quimioterapéuticos, pueden dar lugar a trastornos complejos cuya patogénesis se conoce por completo. Este protocolo se muestra cómo el pez cebra se puede utilizar para el modelado de la enfermedad de estas condiciones, que se pueden aplicar a la identificación de medidas renoprotective.

Nefrotoxina Microinyección en pez cebra para modelar la lesión renal aguda

Se describen procedimientos optimizados para el aislamiento de folículos individuales, microinyecciones de ARN citoplasmático, la eliminación de capas celulares circundantes y la expresión de proteínas en ovocitos de Xenopus. Además, se presenta un método simple para cambios rápidos de solución en experimentos electrofisiológicos con canales iónicos activados por ligandos.

Los oocitos de Xenopus: Métodos optimizados para la microinyección, la eliminación de las capas de células foliculares y Cambios solución rápida en experimentos electrofisiológicos

Este protocolo demuestra un método basado en la fluorescencia para visualizar la vasculatura y para cuantificar su complejidad en Xenopus tropicalis . Los vasos sanguíneos pueden visualizarse minutos después de la inyección de un colorante fluorescente en el corazón de un embrión después de manipulaciones genéticas y / o farmacológicas para estudiar el desarrollo cardiovascular in vivo .

Visualización y análisis cuantitativo de la angiogénesis embrionaria<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Este protocolo tiene como objetivo demostrar cómo microinyectar una mezcla de ADN/DOTAP en los auriculares de embriones Xenopus laevis de un día de edad, y cómo imagen y reconstrucción de proteínafluorescentes verdes individuales (GFP) expresando árboles axonales ópticos en intactos, los renacuajos vivos de Xenopus.

Microinyección de ADN en los oculares en embriones de Xenopus laevis e imágenes de gFP que expresan los árboles axonales ópticos en los renacuajos de Xenopus vivos

Aprende la técnica de microinyección dirigida al riñón en desarrollo de Xenopus laevis. Este método permite estudiar la formación renal y los genes involucrados en la organogénesis con precisión.

Técnica de microinyección a Target a los países en desarrollo

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