Los cultivos neuronales de explantes de Xenopus laevis

Cultivo de explantes neuronales de disección

El objetivo de este procedimiento es cultivar conos de crecimiento de Xenopus Lavis para su posterior análisis de imágenes de alta resolución. Esto se logra inyectando primero a las ranas hembras hormonas para estimular la producción de huevos. El segundo paso es recolectar y fertilizar los óvulos, y luego inyectarlos con ARNm u otras construcciones de interés.

Al día siguiente, los embriones se diseccionan y los tubos neurales se aíslan, se cortan y se colocan en cubreobjetos. El paso final es obtener una imagen de los axones y conos de crecimiento que crecen. En última instancia, la microscopía de fluorescencia de alta resolución se puede utilizar para mostrar cambios en la localización de proteínas en conos de crecimiento a lo largo del tiempo.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que las disecciones del tubo neural pueden ser difíciles de aprender leyendo una sección del método sin observar la técnica de primera mano. Obtener huevos de ranas hembras previamente inyectadas con 400 unidades de gonadotropina coriónica de 12 a 14 horas antes. Recoja los huevos en una solución de timbre modificado con marcas X.

A continuación, fertilice el cromosoma X recolectado in vitro con testículos picados como se ha descrito anteriormente, y añada 0,1 XMMR después de al menos 20 minutos. Retire los medios e incube los embriones en cisteína al 2% en un XMMR a pH 7,8 durante tres a cinco minutos para eliminar la capa de gelatina del embrión. A continuación, vierte los embriones en un vaso de precipitados.

A continuación, lavar los embriones con 0,1 XMMR o 0,1 x solución salina de baño modificada de tres a cinco veces después del lavado final. Mantenga los embriones en 0.1 XMMR a temperatura ambiente hasta la inyección o si lo desea. Coloque los embriones a una temperatura de 14 a 18 grados centígrados para retrasar el desarrollo antes de la inyección.

Diluir el ARN tapado previamente preparado hasta una concentración final de 50 a 200 picogramos de litro de plátano con agua bidestilada, y luego almacenar en hielo hasta la micro inyección. A continuación, prepare la aguja de inyección tirando de un capilar de silicato bo con un extractor de suter o un instrumento similar. Luego, bajo un microscopio, use pinzas para romper la punta de la aguja en ángulo para generar una forma similar a una pluma y rellene la aguja con 0,5 a un microlitro de la solución de ARN diluido.

Montar la aguja en el micromanipulador Aquí se utiliza el inyector PLI 100 PICO de un sistema médico. Ahora, coloque los embriones fertilizados en la etapa de una a cuatro células en un plato de plástico que contenga 5%fol en 0.1 XMMR. Calibrar el volumen de inyección para cada nueva micropipeta utilizando un micrómetro de radicales o de etapa.

A continuación, configure el pico inyector para que suministre la cantidad deseada de ARN para cada inyección. Aquí se utiliza un volumen de inyección de un nanolitro. Sujete los embriones con pinzas o, si lo prefiere, colóquelos en una plataforma de retención e inyecte el volumen deseado en los blasters de animales.

Distribuir las inyecciones en varios lugares del embrión para obtener una distribución uniforme del ARN. Se realizan de una a dos inyecciones en cada blaster para un embrión en etapa de cuatro células, mientras que se usan de dos a cuatro inyecciones para un embrión en etapa de dos células. Después de las inyecciones, transfiera los embriones inyectados a un plato de plástico que contenga 0,1 XMMR y deje que se desarrollen hasta la etapa 20 a 23.

Dependiendo de la velocidad de desarrollo deseada, los embriones se incuban a una temperatura de 14 a 22 grados centígrados recubren placas de cultivo tratadas con PLL con 10 microgramos por mililitro de laminina en PBS y colocan las placas a 37 grados centígrados durante una hora. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, lavar las placas tres veces con PBS, teniendo cuidado de no dejar que la superficie recubierta de laminina quede expuesta al aire después del lavado final. Sustituya el PBS por medios de cultivo.

Por último, prepare tres platos recubiertos de agros cubriendo el fondo de un plato cultivado con 1%aros en 0.1 XMMR y dejando que se endurezca. Una vez endurecido, llenar una placa con la variabilidad de los medios de steinberg en la expresión del ARNm inyectado puede hacer que los embriones exhiban un mosaico de fluorescencia antes de realizar las disecciones. Examinar los embriones para detectar la presencia de fluorescencia e identificar los embriones que expresan la proteína de fusión fluorescente en el tubo neural.

A continuación, transfiera los embriones fluorescentes en la etapa 20 a 23 en el plato de plástico recubierto de agros que contiene Steinberg's Media. Coloque el plato bajo un microscopio de disección y use pinzas finas para quitar la membrana vitelina. Luego, mientras una pinza sostiene el embrión en su lugar, use la segunda para hacer una incisión en el costado del embrión y exponer el interior hueco.

A continuación, utilice ambos juegos de pinzas para pellizcar a lo largo del tejido entre las mitades dorsal y ventral del embrión para cortar el embrión por la mitad y aislar la parte dorsal que contiene el tubo neural. Coloque el explan dorsal en un tubo de microcentrífuga que contenga dos miligramos por mililitro de colagenasa en el medio de Steinberg y colóquelo en un rotador durante 15 a 20 minutos. A continuación, transfiera el explan dorsal a un plato recubierto de agro relleno de medios frescos de steinberg.

Mientras trabajas bajo el microscopio, disecciona el tubo neural de la epidermis dorsal y el Noor ventral deslizando la punta de las pinzas entre la epidermis y el tejido subyacente, y retirando lentamente la epidermis. Luego, use una pinza para sostener el tejido y otra para extraer el tejido que rodea el tubo neural. A continuación, transfiera el tubo neural disecado a un plato recubierto de agros lleno de medios de cultivo frescos.

Una vez que se han recogido varios tubos neurales, se afilan agujas o pinzas de tungsteno para cortar cada tubo en unos 20 trozos. A continuación, coloque las piezas en los platos de cultivo recubiertos de laminina, extendiendo las berenjenas uniformemente en filas. Después de colocar los tubos neurales, no se deben mover las placas, ya que esto perturbará la unión de las células.

Incubar el tubo neural plateado a una temperatura de 20 a 22 grados centígrados. No se requiere una incubadora de cultivo celular para el cultivo de neuronas XUS lavis de 12 a 24 horas después de la siembra de las neuronas de imagen y los conos de crecimiento a temperatura ambiente. Tenga en cuenta que la expresión variable de ARN puede dar lugar a un rango de niveles de fluorescencia entre los conos de crecimiento.

Esta imagen DIC muestra axones y neuritas que crecen fuera del modelo X en la esquina superior izquierda del campo de visión. La barra de escala de esta imagen y de las siguientes representa 10 micras. Esta película de mayor aumento muestra el cono de crecimiento en la punta de un axón en crecimiento.

Finalmente, esta película de microscopía de fluorescencia muestra la expresión de EB one GFP en un cono de crecimiento. Mientras que aquí, proporcionamos el ejemplo de imagen, la proteína de fusión de punta positiva EB one GFP. Este método de explante neural se puede aplicar a cualquier número de proteínas para dilucidar sus comportamientos dentro del cono de crecimiento durante el crecimiento de las neuritas.