Visualización y análisis cuantitativo de la angiogénesis embrionaria
25 de mayo de 2017
Este protocolo demuestra un método basado en la fluorescencia para visualizar la vasculatura y para cuantificar su complejidad en Xenopus tropicalis . Los vasos sanguíneos pueden visualizarse minutos después de la inyección de un colorante fluorescente en el corazón de un embrión después de manipulaciones genéticas y / o farmacológicas para estudiar el desarrollo cardiovascular in vivo .
El objetivo general de este procedimiento es visualizar la vasculatura de las larvas de Xenopus tropicalis. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología cardiovascular, como la forma en que se regula la angiogénesis. La principal ventaja de esta técnica es que los vasos sanguíneos en un embrión intacto y de tipo salvaje pueden visualizarse mediante la inyección simple de un colorante fluorescente.
Comience utilizando un microcargador para llenar una micropipeta de vidrio cónica con aproximadamente cinco microlitros de solución clara de LDL diI acetilada, teniendo cuidado de no cargar partículas precipitadas. Bajo un microscopio estereoscópico, use un par fino de pinzas número 55 para cortar la punta de la pipeta y así ajustar el volumen del complejo cargado, y configure el sistema de inyección controlado por presión para expulsar aproximadamente cinco nanolitros de solución por inyección. Luego, sumerja la punta de la pipeta en MS-222 al 0,04 % en solución salina de Barth modificada 0,1X o MBS, en un molde personalizado de Sylgard.
A continuación, transfiera el embrión de Xenopus tropicalis al molde de Sylgard y confirme la sedación completa mediante la ausencia de respuesta a la estimulación de la aleta dorsal. Bajo el microscopio estereoscópico, coloque el embrión con la cara ventral hacia arriba en la muesca en forma de V del molde, en una posición ligeramente oblicua. Ajuste firmemente dos alfileres minutian de 0,1 milímetros a un portaalfiles y use un alfiler para perforar la piel sobre el corazón, que debería estar pulsando visiblemente.
Inserte la aguja a través del orificio en el espacio entre el corazón y la piel sin perforar el corazón, y coloque la punta insertada dentro de la región donde se realizará la incisión. Luego, frote la segunda aguja contra la aguja insertada para hacer una incisión lineal y use ambas agujas juntas para ensanchar suavemente la incisión, exponiendo el corazón. Para inyectar la solución de LDL acetilada marcada con DiI, inserte la punta de la pipeta de vidrio en el corazón e inyecte de 50 a 60 nanolitros de LDL acetilada marcada con DiI en aproximadamente 10 pulsos de eyección.
Una vez que se haya administrado toda la solución de colorante, confirme que el corazón siga latiendo y transfiera el embrión a una nueva placa de Petri que contenga MBS 0,1X. Después de cinco a 10 minutos, la rana debería recuperarse de la anestesia y comenzar a moverse. Después de inyectar un número adecuado de embriones, examine visualmente los embriones anestesiados correctamente etiquetados bajo un microscopio de fluorescencia, descartando aquellos animales que presenten etiquetado en otros órganos.
Los embriones que no se han marcado adecuadamente pueden ser inyectados nuevamente. Luego, capture imágenes de los embriones correctamente marcados. Para una visualización más exhaustiva de los vasos sanguíneos, fije los embriones anestesiados nuevamente en paraformaldehído al 4 % durante una hora a temperatura ambiente, protegidos de la luz, para su visualización mediante microscopía confocal.
Si se inyecta una cantidad suficiente de LDL acetilado diI en el corazón, la vena cardinales posterior, o PCV, debe ser inmediatamente visible bajo un microscopio de fluorescencia. Las venas intersomíticas, o ISV, emergen dorsalmente desde la PCV en una onda de anterior a posterior que comienza en la etapa 36 y termina alrededor de la etapa 40 a 41, volviéndose ligeramente ramificadas alrededor de la etapa 43. La PCV y las ISV crecen siguiendo un patrón angiogénico estereotipado que está bajo un estricto control del desarrollo.
Curiosamente, la inhibición de la señalización de TIE-2 mediante morpholinos antisentido disminuye la longitud y la complejidad de las ISV, mientras que la expresión de la forma constitutivamente activa de TIE-2 induce una ramificación excesiva de las ISV. Se puede calcular un Índice de Complejidad de Venas para evaluar la complejidad de las ISV y se pueden generar trayectos representados para visualizar la arquitectura general del sistema vascular del embrión de Xenopus tropicalis. El protocolo original fue descrito para el uso de Xenopus laevis por Levin y Colics, y nosotros lo adaptamos para Xenopus tropicalis.
Una vez dominada, esta técnica puede completarse en una hora si se realiza adecuadamente. Antes de este procedimiento, se pueden realizar manipulaciones genéticas y farmacológicas para responder preguntas adicionales, como qué genes y vías de señalización regulan el desarrollo vascular. Mediante este procedimiento, la vasculatura marcada puede visualizarse en un animal intacto en tiempo real, lo que proporciona una herramienta poderosa para investigar la dinámica del desarrollo vascular.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo inyectar LDL acetilada diI en el corazón de una renacuajo de Xenopus tropicalis para visualizar su vasculatura.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Descripción general
Este protocolo demuestra un método basado en fluorescencia para visualizar la vasculatura y cuantificar su complejidad en Xenopus tropicalis. La técnica permite la obtención de imágenes de los vasos sanguíneos poco después de la inyección de un colorante fluorescente en el corazón del embrión, facilitando estudios sobre el desarrollo cardiovascular in vivo.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología cardiovascular
- Angiogénesis
- Biología del desarrollo
Antecedentes
- Xenopus tropicalis es un organismo modelo para el estudio del desarrollo vertebrado.
- Comprender el desarrollo vascular es fundamental para obtener conocimientos sobre diversas enfermedades.
- Las técnicas de imagen fluorescente mejoran la visualización de estructuras biológicas.
- Este método permite la observación en tiempo real de cambios vasculares.
Objetivo del estudio
- Visualizar la vasculatura de las larvas de Xenopus tropicalis.
- Investigar la regulación de la angiogénesis.
- Proporcionar un método sencillo y eficaz para estudiar el desarrollo cardiovascular.
Métodos Utilizados
- Inyección de un colorante fluorescente en el corazón del embrión.
- Uso de un microcargador y una micropipeta de vidrio cónica para la administración precisa del colorante.
- Visualización de los vasos sanguíneos bajo un microscopio estereoscópico.
- Aplicación de manipulaciones genéticas y farmacológicas para estudiar sus efectos sobre la vasculatura.
Resultados Principales
- Visualización exitosa de los vasos sanguíneos en embriones intactos.
- Cuantificación de la complejidad vascular lograda mediante imágenes.
- Conocimientos obtenidos sobre la dinámica del desarrollo cardiovascular.
- Eficacia demostrada del método de inyección del colorante fluorescente.
Conclusiones
- El protocolo proporciona un método confiable para estudiar el desarrollo vascular.
- La imagen fluorescente es una herramienta poderosa para el análisis en tiempo real.
- Este enfoque puede facilitar investigaciones adicionales en biología cardiovascular.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método permite la visualización y cuantificación directas de la complejidad vascular en un modelo vertebrado, lo que apoya la validación temprana de objetivos en las vías de angiogénesis. Al proporcionar lecturas cuantitativas del brotamiento y ramificación de vasos, facilita la reducción de riesgos mecanicistas de los objetivos vasculares antes de iniciar campañas de identificación de compuestos líderes. El sistema Xenopus tropicalis ofrece una plataforma relevante para enfermedades al permitir la evaluación de fenotipos angiogénicos con confianza predictiva en investigaciones cardiovasculares preclínicas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar hipótesis terapéuticas sobre reguladores angiogénicos, como la señalización de TIE-2, mediante la observación directa de los patrones de brotamiento vascular.
- Valor operativo: Ofrece un flujo de trabajo rápido, de una semana, para evaluar el impacto de genes o vías en el desarrollo vascular sin necesidad de modelos genéticamente modificados.
- Valor predictivo: Resultados cuantificables, como el Índice de Complejidad Venosa, apoyan la evaluación objetiva de los efectos de la modulación de dianas para tomar decisiones de selección en carteras de proyectos.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Listo para ensayo: Genera una marcación vascular estandarizada y reproducible compatible con los flujos de trabajo posteriores de imagen y análisis.
- Salida cuantitativa: Permite la medición de la longitud de las venas intersomáticas y la complejidad de ramificación como lecturas dependientes de la dosis para el cribado de compuestos.
- Escalabilidad: Un procedimiento sencillo de inyección del colorante y de obtención de imágenes permite la evaluación de mediano rendimiento de perturbaciones farmacológicas o genéticas.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Modela la angiogénesis estereotípica en Xenopus tropicalis, aportando información sobre las vías del desarrollo vascular humano.
- Continuidad traslacional: Conecta hallazgos de descubrimiento temprano con la validación preclínica mediante mecanismos angiogénicos conservados.
- Reducción de riesgos mecanicista: Permite la evaluación rápida de moduladores de vías para aclarar la biología del blanco antes de invertir en estudios con modelos mamíferos.
Integración de la Línea de Proceso y Flujo de Trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento, desde la verificación de hipótesis sobre dianas hasta la identificación de compuestos activos, proporcionando datos de fenotipo vascular que orientan las decisiones de continuar o descartar en programas centrados en la angiogénesis.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la aclaración de vías al vincular perturbaciones genéticas o farmacológicas con cambios cuantificables en la arquitectura vascular.
- Selección: Proporciona lecturas reproducibles basadas en imágenes, adecuadas para evaluar los efectos de compuestos sobre la angiogénesis en brotación.
- Análisis: Ofrece métricas cuantitativas de complejidad vascular que permiten comparaciones objetivas entre diferentes condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Aprovecha mecanismos conservados de angiogénesis para apoyar la continuidad desde modelos embrionarios hasta sistemas vasculares de mamíferos.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable de fenotipado vascular aplicable en múltiples proyectos dirigidos a la angiogénesis.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos angiogénicos mediante la visualización directa y cuantitativa de redes vasculares.
- Valor operativo: Estandariza la evaluación vascular mediante la inyección sencilla de un colorante y un imagenado reproducible, minimizando la variabilidad entre experimentos.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir la eliminación temprana de riesgos asociados a objetivos vasculares, reduciendo el riesgo de fracaso en fases avanzadas de programas cardiovasculares.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de modificadores de la angiogénesis basándose en resultados fenotípicos cuantitativos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas de microcirugía para el manejo de embriones y microinyección cardíaca.
- Depende de infraestructura de microscopía de fluorescencia para la visualización de vasos y la captura de imágenes.
- Necesita la estandarización de la etapa embrionaria y del momento de la inyección para una marcación vascular consistente.
- Implica consideraciones de adaptación al extender los hallazgos a otros sistemas modelo o contextos de relevancia humana.
- Las limitaciones prácticas incluyen la dependencia de la accesibilidad embrionaria y la necesidad de una cuidadosa optimización de la concentración del colorante para evitar marcación no específica.
