Visualización y análisis cuantitativo de la angiogénesis embrionaria Xenopus tropicalis
May 25th, 2017
Este protocolo demuestra un método basado en la fluorescencia para visualizar la vasculatura y para cuantificar su complejidad en Xenopus tropicalis . Los vasos sanguíneos pueden visualizarse minutos después de la inyección de un colorante fluorescente en el corazón de un embrión después de manipulaciones genéticas y / o farmacológicas para estudiar el desarrollo cardiovascular in vivo .
El objetivo general de este procedimiento es visualizar la vasculatura de los renacuajos de Xenopus tropicalis. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología cardiovascular, como cómo se regula la angiogénesis. La principal ventaja de esta técnica es que los vasos sanguíneos de un embrión intacto tipo pozo pueden visualizarse mediante una simple inyección de colorante fluorescente.
Comience utilizando un microcargador para llenar una micropipeta de vidrio cónico con aproximadamente cinco microlitros de solución clara de LDL acetilada diI, teniendo cuidado de que no se carguen partículas precipitadas. Bajo un microscopio de disección, use un par fino de pinzas número 55 para sujetar la punta de la pipeta para ajustar el volumen del complejo cargado y configure el sistema de inyección controlada por presión para expulsar aproximadamente cinco nanolitros de solución por inyección. A continuación, sumerja la punta de la pipeta en 0,04 % MS-222 en solución salina de Barth modificada 0,1X o MBS en un molde Sylgard hecho a medida.
A continuación, transfiera el embrión de Xenopus tropicalis al molde de Sylgard y confirme la sedación completa con falta de respuesta a la estimulación de la aleta dorsal. Bajo el microscopio de disección, cargue el lado ventral del embrión hacia arriba en la hendidura en forma de V del molde en una posición ligeramente oblicua. Coloque firmemente dos alfileres minuciosos de 0,1 milímetros en un soporte de alfileres y use un alfiler para perforar la piel sobre el corazón, que debe estar visiblemente pulsando.
Inserte el alfiler a través del orificio en el espacio entre el corazón y la piel sin perforar el corazón y coloque la punta insertada dentro de la región donde se realizará la incisión. Luego, frote el segundo alfiler contra el alfiler insertado para hacer una incisión lineal y use ambos alfileres juntos para ensanchar suavemente la incisión, exponiendo el corazón. Para inyectar la solución de LDL acetilada DiI, inserte la punta de la pipeta de vidrio en el corazón e inyecte de 50 a 60 nanolitros de LDL acetilado DiI en aproximadamente 10 pulsos de expulsión.
Cuando se haya entregado toda la solución de colorante, confirme que el corazón sigue latiendo y transfiera el embrión a una nueva placa de Petri que contenga 0,1X MBS. Después de cinco a 10 minutos, el renacuajo debe recuperarse de la anestesia y comenzar a moverse. Después de que se haya inyectado un número apropiado de embriones, se examinarán visualmente los embriones anestesiados correctamente etiquetados bajo un microscopio de fluorescencia, descartando cualquier animal que tenga otros órganos marcados.
Los embriones que no han sido suficientemente etiquetados pueden ser inyectados de nuevo. A continuación, capture imágenes de los embriones correctamente etiquetados. Para una imagen más completa de los vasos sanguíneos, fije los embriones reanestesiados en paraformaldehído al 4% durante una hora a temperatura ambiente, protegidos de la luz para su visualización mediante microscopía confocal.
Si se inyecta una cantidad suficiente de LDL acetilado diI en el corazón, la vena cardinal posterior, o PCV, debe ser inmediatamente visible bajo un microscopio de fluorescencia. Las venas intersomíticas, o ISV, emergen dorsalmente de la PCV en una onda anterior a posterior que comienza en la etapa 36 y termina alrededor de la etapa 40 a 41, ramificándose ligeramente alrededor de la etapa 43. El PCV y el ISV crecen en un patrón angiogénico estereotipado que está bajo un estricto control del desarrollo.
Curiosamente, la eliminación de la señalización de TIE-2 por morfolinos antisentido disminuye la longitud y la complejidad de los ISV, mientras que la expresión de la forma constitutivamente activa de TIE-2 induce una ramificación excesiva del ISV. Se puede calcular un Índice de Complejidad de Venas para evaluar la complejidad de los ISV y se pueden generar trayectorias renderizadas para visualizar la arquitectura general de la vasculatura embrionaria de Xenopus tropicalis. El protocolo original fue descrito para el uso de Xenopus laevis por Levin y Colics y lo adaptamos para Xenopus tropicalis.
Una vez dominada, esta técnica se puede completar en una hora si se realiza correctamente. Antes de este procedimiento, se pueden realizar manipulaciones genéticas y farmacológicas para responder preguntas adicionales, como qué genes y vías de señalización regulan el desarrollo vascular. Con este procedimiento, se pueden obtener imágenes de la vasculatura marcada en un animal intacto en tiempo real, lo que proporciona una poderosa herramienta para investigar la dinámica del desarrollo vascular.
Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo inyectar LDL acetilado diI en el corazón de un renacuajo Xenopus tropicalis para visualizar su vasculatura.
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Visión general
Este protocolo demuestra un método basado en fluorescencia para visualizar la vasculatura y cuantificar su complejidad en Xenopus tropicalis. La técnica permite la obtención de imágenes de los vasos sanguíneos poco después de la inyección de un tinte fluorescente en el corazón del embrión, facilitando estudios sobre el desarrollo cardiovascular in vivo.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Biología cardiovascular
- Angiogénesis
- Biología del desarrollo
Antecedentes
- Xenopus tropicalis es un organismo modelo para estudiar el desarrollo de los vertebrados.
- Entender el desarrollo vascular es crucial para obtener información sobre varias enfermedades.
- Las técnicas de imagen fluorescente mejoran la visualización de estructuras biológicas.
- Este método permite la observación en tiempo real de cambios vasculares.
Propósito del estudio
- Visualizar la vasculatura de las renacuajos de Xenopus tropicalis.
- Investigar la regulación de la angiogénesis.
- Proporcionar un método simple y efectivo para estudiar el desarrollo cardiovascular.
Métodos utilizados
- Inyección de un tinte fluorescente en el corazón del embrión.
- Uso de un cargador micro y una micro pipeta de vidrio cónica para una entrega precisa del tinte.
- Visualización de los vasos sanguíneos bajo un microscopio de disección.
- Aplicación de manipulaciones genéticas y farmacológicas para estudiar los efectos sobre la vasculatura.
Principales resultados
- Visualización exitosa de los vasos sanguíneos en embriones intactos.
- Cuantificación de la complejidad vascular lograda mediante imágenes.
- Conocimientos adquiridos sobre la dinámica del desarrollo cardiovascular.
- Eficacia demostrada del método de inyección de tinte fluorescente.
Conclusiones
- El protocolo proporciona un método confiable para estudiar el desarrollo vascular.
- La imagen fluorescente es una herramienta poderosa para el análisis en tiempo real.
- Este enfoque puede facilitar futuras investigaciones en biología cardiovascular.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
This method enables direct visualization and quantification of vascular complexity in a vertebrate model, supporting early-stage target validation in angiogenesis pathways. By providing quantitative readouts of vessel sprouting and branching, it facilitates mechanistic de-risking of vascular targets before committing to lead identification campaigns. The Xenopus tropicalis system offers a disease-relevant platform for assessing angiogenic phenotypes with predictive confidence in preclinical cardiovascular research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding angiogenic regulators such as TIE-2 signaling through direct observation of vessel sprouting patterns.
- Operational Value: Provides a rapid, one-week workflow to assess gene or pathway impact on vascular development without requiring genetically engineered models.
- Predictive Value: Quantifiable outputs like the Vein Complexity Index support objective assessment of target modulation effects for portfolio triage decisions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible vascular labeling compatible with downstream imaging and analysis pipelines.
- Quantitative Output: Enables measurement of intersomitic vein length and branching complexity as dose-responsive readouts for compound screening.
- Scalability: Simple dye injection and imaging procedure supports medium-throughput evaluation of pharmacological or genetic perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models stereotypic angiogenesis in Xenopus tropicalis, offering insight into human vascular development pathways.
- Translational Continuity: Connects early discovery findings to preclinical validation through conserved angiogenic mechanisms.
- Mechanistic De-risking: Allows rapid testing of pathway modulators to clarify target biology before investing in mammalian model studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, providing vascular phenotype data that informs go/no-go decisions in angiogenesis-focused programs.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by linking genetic or pharmacological perturbations to quantifiable changes in vascular architecture.
- Screening: Delivers reproducible, imaging-based readouts suitable for evaluating compound effects on angiogenic sprouting.
- Analytics: Provides quantitative vascular complexity metrics that enable objective comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Leverages conserved angiogenesis mechanisms to support continuity from embryonic models to mammalian vascular systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable vascular phenotyping platform applicable across multiple angiogenesis target projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in angiogenic target validation through direct, quantitative visualization of vascular networks.
- Operational Value: Standardizes vascular assessment via simple dye injection and reproducible imaging, minimizing inter-experiment variability.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of vascular targets, reducing late-stage failure risk in cardiovascular programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of angiogenesis modifiers based on quantitative phenotypic outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical techniques for embryo handling and cardiac microinjection.
- Dependent on fluorescence microscopy infrastructure for vessel visualization and image capture.
- Necessitates standardization of embryo staging and injection timing for consistent vascular labeling.
- Involves adaptation considerations when extending findings to other model systems or human relevance contexts.
- Practical limitations include reliance on embryonic accessibility and the need for careful optimization of dye concentration to avoid non-specific labeling.
