El aislamiento y la diferenciación de células madre derivadas de tejido adiposo subcutáneo de la especie porcina tejidos adiposos

El objetivo general de este procedimiento es aislar células madre derivadas del tejido adiposo a partir de tejidos adiposos blancos subcutáneos porcinos para evaluar su capacidad de diferenciarse en adipocitos mesenquimales, osteocitos y condrocitos. Este método puede ayudar a responder las preguntas clave de la investigación sobre la obesidad. Es una buena herramienta para descubrir el mecanismo molecular implicado en la regulación del desarrollo del tejido adiposo.

La principal ventaja de esta técnica es que se puede obtener un gran número de células estromavasculares, lo que permite un análisis detallado de la diferenciación y la biología de los adipocitos. La implicación de esta técnica apunta hacia la investigación en terapia con células madre, ya que las células madre derivadas del tejido adiposo del cerdo muestran pluripotencialidad para la transdiferenciación en múltiples líneas celulares. Comience colocando al lechón en posición prona sobre una mesa quirúrgica limpia.

Afeite todo el vello a lo largo de la línea media desde el cuello hasta la cola, y frote la piel dorsal con yodo-povidona al 7,5% tres veces. Después del tercer frotis, deje que el yodo-povidona actúe sobre la superficie de la piel durante aproximadamente 10 minutos. Luego, rocíe la piel con etanol al 70%.

Y utilice compresas de gasa empapadas en etanol para limpiar la piel en una sola dirección y eliminar el desinfectante hasta que no se observe ningún color evidente. A continuación, realice una incisión desde la región del cuello hasta la pierna. Luego, sosteniendo la grasa y la piel con pinzas, use un escalpelo para separar la capa grasa dorsal porcina de los tejidos adiposos subcutáneos y la capa de piel adyacente de los músculos.

Sumerja inmediatamente el tejido de piel y grasa en un vaso de precipitados esterilizado de 200 mililitros, que contenga DMEM sin suero a 37 grados Celsius, y rocíe el exterior del vaso con etanol al 70%. A continuación, coloque el vaso en una cabina de flujo laminar para cultivo celular y coloque una lámina esterilizada de aluminio triple de 40 por 30 centímetros junto al vaso. Transfiera el tejido, con la piel hacia abajo, sobre la lámina de aluminio.

Y use pinzas y tijeras para eliminar el tejido muscular restante del tejido adiposo. Corte la grasa en trozos cuadrados de 7 por 7 centímetros y luego transfiera los trozos de grasa a un nuevo vaso de precipitados esterilizado de 200 mililitros que contenga DMEM sin suero a 37 grados Celsius. Ahora, coloque un portamuestras personalizado, equipado con una cuchilla de acero al carbono, sobre la lámina de cobertura y coloque uno de los trozos de grasa sobre el cortador con la capa de grasa orientada hacia abajo.

Corte la grasa en trozos de aproximadamente 1 milímetro de grosor lo más cerca posible de la piel, sin cortarla. Luego, use tijeras para picar los trozos de tejido adiposo lo más finamente posible y añádalos a un matraz Erlenmeyer de 250 mililitros que contenga medio de digestión filtrado suplementado con colagenasa. Incube el matraz con agitación rotatoria durante 90 minutos a 45 RPM, en un agitador orbital a 37 grados Celsius.

Cuando el medio de digestión se convierta en una suspensión homogénea, sin grumos significativos de tejido, detenga la digestión añadiendo un volumen igual de medio de cultivo que contenga DMEM F-12 con 10% de suero bovino fetal (FBS). Para recolectar las células madre derivadas del tejido adiposo porcino, filtre la suspensión de tejido adiposo digerido a través de una sola capa de gasa hacia una botella serológica esterilizada de 250 mililitros, utilizando pinzas para presionar el centro de la gasa, con el fin de guiar y facilitar el paso del digesto. Escurra y gire la gasa con las pinzas para completar el paso del líquido y distribuya el medio en cuatro tubos cónicos de centrífuga de 50 mililitros.

Recoger las células estromales-vasculares mediante centrifugación. A continuación, desechar el sobrenadante sin perturbar los pellet para eliminar la mayor parte de la capa de grasa superior que contiene los adipocitos maduros. A continuación, volver a suspender los pellet en 10 mililitros de DMEM mediante pipeteo y agitación suave.

Centrifugar nuevamente las células y resuspender los pellet en 10 mililitros de tampón de lisis ACK. Después de siete minutos a temperatura ambiente, detener la lisis de los glóbulos rojos añadiendo 10 mililitros de DMEM a cada tubo, agitando suavemente los tubos para mezclar. Luego, centrifugar nuevamente las células.

Lave las células dos veces más con 10 mililitros de DMEM y luego reúna los sobrenadantes a través de un filtro de 100 micrones en un solo tubo cónico de 50 mililitros. Pipetee suavemente la suspensión celular varias veces para distribuir uniformemente las células y cuente las células mediante exclusión de azul de tripano. Finalmente, siembre las células madre derivadas del tejido adiposo de cerdo a una densidad de 6 veces 10 a la 4 por centímetro cuadrado en el recipiente de cultivo de tamaño adecuado con medio de cultivo celular.

Y incubar las células a 37 grados Celsius y 5 %CO2 para facilitar la formación de una monocapa. La morfología de las células madre derivadas del tejido adiposo de la fracción estromal-vascular del cerdo es similar a la de las células madre derivadas del tejido adiposo de ratón o humano, con una morfología alargada similar a la de fibra de vidrio que se observa 24 horas después de la siembra. Las células madre derivadas del tejido adiposo del cerdo alcanzan la confluencia dentro de las 72 horas, momento en el cual están listas para la diferenciación en adipocitos u otros tipos mesenquimales.

Estas células también exhiben un fuerte potencial adipogénico tras la inducción química, y se pueden observar adipocitos maduros tras nueve días de diferenciación, con más del 90 % de las células madre derivadas del tejido adiposo porcino mostrando diferenciación adipogénica. Los marcadores superficiales de células madre mesenquimales, incluidos CD 29, CD 44, CD 90 y MHC 1, se expresan altamente en las células madre derivadas del tejido adiposo porcino, mientras que CD 4a, CD 31, CD 45 y MHC II son apenas detectables, lo que demuestra que estas células madre derivadas del tejido adiposo porcino presentan características de tipo mesenquimal sin contaminación significativa de células madre endoteliales o hematopoyéticas. Además, las células madre derivadas del tejido adiposo porcino diferenciadas pueden identificarse como adipocitos, osteocitos o condrocitos mediante el uso de colorantes tisulares específicos, lo que demuestra que estas células derivadas de la fracción estromal-vascular conservan una pluripotencialidad típica de progenitores de tipo mesenquimal.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar mantener una buena técnica aséptica para el cultivo celular y llevar a cabo todos los pasos lo más rápidamente posible, para maximizar la viabilidad de las células. Una vez dominada la técnica, se pueden obtener células de dos a tres cerdos en seis horas, si el procedimiento se realiza adecuadamente.

Esta técnica estándar allanó el camino para que los investigadores de la obesidad en el campo de la diabetes exploraran los interruptores moleculares, como los factores de transcripción que controlan la diferenciación de adipocitos. Después de ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo aislar células madre derivadas de tejido adiposo de cerdo y cómo evaluar la capacidad múltiple de estas células para diferenciarse en adipocitos, osteocitos y condrocitos.