El aislamiento y la diferenciación de células madre derivadas de tejido adiposo subcutáneo de la especie porcina tejidos adiposos

El objetivo general de este procedimiento es aislar células madre derivadas del tejido adiposo blanco subcutáneo porcino para evaluar su capacidad para diferenciarse en adipocitos mesenquimales, osteocitos y condrocitos. Este método puede ayudar a responder las preguntas clave de la investigación sobre la obesidad. Es una buena herramienta para descubrir el mecanismo molecular implicado en la regulación del desarrollo del tejido adiposo.

La principal ventaja de esta técnica es que se puede recolectar un número abundante de células estromovasculares, lo que permite analizar en profundidad la diferenciación y la biología de los adipocitos. La implicación de esta técnica se centra en la investigación de la terapia con células madre, ya que las células madre derivadas del tejido adiposo del cerdo exhiben multipotencia para la transdiferenciación en múltiples linajes celulares. Comience colocando al lechón en posición prona sobre una mesa quirúrgica limpia.

Afeita todo el vello por la línea media desde el cuello hasta la cola y frota la piel dorsal con yodo de povidona al 7,5% tres veces. Después del tercer exfoliante, deje que el yodo se asiente en la superficie de la piel durante unos 10 minutos. A continuación, rocíe la piel con etanol al 70%.

Y use almohadillas de gasa empapadas en etanol para limpiar la piel en una dirección para eliminar el desinfectante hasta que no se observe un color obvio. A continuación, haz una incisión desde la región del cuello hasta la pierna. Luego, sosteniendo la grasa y la piel con pinzas, use un bisturí para separar la capa de grasa dorsal porcina de los tejidos adiposos subcutáneos y la capa de piel adyacente de los músculos.

Sumerja inmediatamente la piel y el tejido graso en un vaso de precipitados esterilizado de 200 mililitros, que contenga DMEM de 37 grados centígrados sin suero y rocíe el exterior del vaso de precipitados con etanol al 70%. Luego, coloque el vaso de precipitados en una campana de cultivo de células de flujo laminar y coloque una cubierta de aluminio de triple capa esterilizada de 40 por 30 centímetros junto al vaso de precipitados. Transfiera el pañuelo, con la piel hacia abajo, sobre el papel de aluminio.

Y use pinzas y tijeras para recortar el tejido muscular restante del tejido adiposo. Corta la grasa en trozos cuadrados de 7 por 7 centímetros y luego transfiere los trozos de grasa a un nuevo vaso de precipitados esterilizado de 200 mililitros que contiene DMEM de 37 grados centígrados sin suero. Ahora, coloque un soporte de rebanada personalizado, equipado con una cuchilla de corte de acero al carbono en el papel de aluminio de la cubierta y coloque una de las piezas de grasa en la rebanadora con la capa de grasa hacia abajo.

Corta la grasa en trozos de aproximadamente 1 milímetro de grosor lo más cerca posible, pero sin cortar la piel. A continuación, utilice unas tijeras para picar los trozos de tejido adiposo lo más finamente posible y añada los trozos a un matraz Erlenmeyer de 250 mililitros que contenga un medio de digestión filtrado suplementado con colagenasa. Incubar el matraz durante 90 minutos a 45 RPM, en un agitador orbital a 37 grados centígrados.

Cuando el medio de digestión se convierta en una lechada, sin grumos significativos de tejido, detenga la digestión con un volumen igual de medio de cultivo que contenga DMEM F-12 con 10% de FBS. Para recolectar las células madre derivadas del tejido adiposo del cerdo, filtre la suspensión de tejido adiposo digerido a través de una sola capa de gasa en un frasco serológico esterilizado de 250 mililitros, usando pinzas para presionar el centro de la gasa, para guiar y ayudar al paso de la digestión. Drene y gire la gasa con las pinzas para completar el paso y distribuya el medio en cuatro tubos de centrífuga cónicos de 50 mililitros.

Recoger las células estromal-vasculares por centrifugación. A continuación, retire el sobrenadante sin alterar los gránulos para eliminar la mayor parte de la capa superior de grasa que contiene los adipocitos maduros. A continuación, vuelva a suspender los pellets en 10 mililitros de DMEM con pipeteo y agitación suave.

Vuelva a girar las celdas y vuelva a suspender los gránulos en 10 mililitros de tampón de lisis ACK. Después de siete minutos a temperatura ambiente, detenga la lisis de los glóbulos rojos con la adición de 10 mililitros de DMEM a cada tubo, agitando suavemente los tubos para mezclar. Y luego, vuelve a girar las celdas.

Lave las células dos veces más con 10 mililitros de DMEM y luego agrupe los sobrenadantes a través de un colador de 100 micras en un solo tubo cónico de 50 mililitros. Pipetee suavemente la suspensión celular varias veces para distribuir uniformemente las células y contar las células por exclusión de azul de tripano. Por último, siembre las células madre derivadas del tejido adiposo del cerdo a una densidad de 6 veces 10 a 4 por centímetro cuadrado en el recipiente de cultivo del tamaño adecuado en el medio de cultivo celular.

E incubar las células a 37 grados centígrados y 5%CO2, para facilitar la formación de una monocapa. La morfología de las células madre derivadas del tejido adiposo del cerdo derivadas de la fracción vascular del estroma es similar a la de las células madre derivadas del tejido adiposo de ratón o humano, con una morfología expandida similar a la fibra de vidrio observada 24 horas después de la siembra. Las células madre derivadas del tejido adiposo del cerdo se vuelven confluentes en 72 horas, momento en el que están listas para la diferenciación de adipocitos u otro tipo mesenquimatoso.

Estas células también exhiben un fuerte potencial adipogénico después de la inducción química y los adipocitos maduros se pueden observar después de nueve días de diferenciación, con más del 90% de las células madre derivadas del tejido adiposo del cerdo demostrando diferenciación adipogénica. Los marcadores de superficie de las células madre mesenquimales, incluidos CD 29, CD 44, CD 90 y MHC 1, se expresan en gran medida en las células madre derivadas del tejido adiposo del cerdo, mientras que el CD 4a, el CD 31, el CD 45 y el MHC II son apenas detectables, lo que demuestra que estas células madre derivadas del tejido adiposo del cerdo exhiben características de tipo mesenquimal sin contaminación significativa de las células madre endoteliales o hematopoyéticas. Además, las células madre diferenciadas derivadas del tejido adiposo porcino pueden identificarse como adipocitos, osteocitos o condrocitos, mediante el uso de colorantes específicos para la tinción de tejidos, lo que demuestra que estas células derivadas de la fracción estromal-vascular conservan una multipotencia típica de los progenitores de tipo mesenquimatoso.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar contar con una buena técnica aséptica para el cultivo celular y realizar todos los pasos lo más rápido posible. Para maximizar la viabilidad de las células. Una vez dominadas, las células se pueden cosechar de dos a tres cerdos en seis horas, si la técnica se realiza correctamente.

Esta técnica estándar allanó el camino para que los investigadores de la obesidad en el campo de la diabetes exploraran los interruptores moleculares, como los factores de transcripción que controlan la diferenciación de los adipocitos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar células madre derivadas del tejido adiposo de cerdo y evaluar la capacidad múltiple de estas células para diferenciarse en adipocitos, osteocitos y condrocitos.