Preparativos Piso en observación y análisis de embrión de pez cebra muestras teñidas por todo el montaje In situ La hibridación

El objetivo general de este procedimiento es visualizar mejor los embriones fijos de pez cebra teñidos en puntos tempranos del desarrollo. Esto se logra tiñendo primero el embrión de pez cebra utilizando el montaje en casa en hibridación C dos. A continuación, se selecciona un embrión para montarlo en plano y se hace una incisión central en la yema con un par de pinzas finas, luego se utilizan las herramientas de pestañas para raspar suavemente y eliminar los gránulos de yema restantes.

Finalmente, el embrión se monta en glicerol en un portaobjetos para permitir la obtención de imágenes adecuadas de la muestra. En última instancia, el montaje plano permite una mejor visualización de los embriones teñidos desde una vista dorsal al extraer la yema y colocar el embrión en una preparación bidimensional. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la obtención de imágenes de embriones intactos en etapas de desarrollo más tempranas, es que el montaje plano elimina el saco vitelino, lo que permite ver todo el embrión.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del desarrollo, como la caracterización del dominio del campo renal pregénero en un embrión. Por lo general, las personas nuevas en este método tienen dificultades porque esta técnica requiere un manejo delicado del embrión y también porque aprender la cantidad adecuada de presión necesaria para eliminar el saco vitelino puede llevar tiempo. Demostrando este procedimiento seremos yo, Zoe y Amanda, que somos estudiantes de posgrado en el laboratorio de wingers.

Después de recolectar, fijar y teñir embriones, de acuerdo con el protocolo de texto, seleccione un embrión para el montaje plano con un X-P-B-S-T. Transfiera el embrión a una placa de Petri de plástico o vidrio. Luego, con el plato bajo un microscopio estereoscópico, use pinzas finas para enrollar el embrión de modo que se obtenga una vista lateral con los extremos de la cabeza y la cola visibles.

A continuación, utiliza unas pinzas finas para sujetar el embrión y una segunda serie para hacer una incisión en la yema en una posición situada en el centro entre la cabeza y la cola del embrión. Luego, con pinzas finas, saque la yema de la cavidad de la celda de roble. Use un X-P-B-S-T para enjuagar la yema perdida del embrión usando una o dos gotas de un XPBS.

Transfiere el embrión a un portaobjetos de vidrio plano. Arrastre el embrión hasta el borde del tampón para que permanezca en una posición plana contra el portaobjetos de vidrio. Mientras ancla el embrión, use una herramienta de pestañas para raspar suavemente la superficie ventral para eliminar los gránulos de yema.

Si la solución de PBST se llena con exceso de yema o comienza a evaporarse, agregue una o dos gotas frescas y arrastre el embrión a este tampón fresco. Una vez que la yema se haya extraído satisfactoriamente, transfiera suavemente el embrión a una placa de Petri de PBST para un enjuague final. A continuación, transfiera el embrión a una placa de Petri que contenga 100% de glicerol e incube durante cinco minutos.

Para montar el embrión en un portaobjetos de vidrio, transfiéralo a un recipiente limpio. Deslice una o dos gotas de glicerol al 100% y colóquelo con el lado ventral de la yema hacia el portaobjetos de vidrio. Con una herramienta de pestañas, arrastre el embrión hasta el borde de la gota de glicerol para que permanezca en una posición plana contra el portaobjetos.

Si el eje embrionario es curvo, use las pinzas finas para hacer suavemente pequeñas incisiones en la yema restante para aliviar la tensión y poder colocarla plana. En la diapositiva. Coloque pequeñas hendiduras de arcilla para modelar en las cuatro esquinas de un cubreobjetos de vidrio de 18 por 18.

Coloque lentamente el cubreobjetos sobre el embrión, inclinando el cubreobjetos para minimizar las burbujas de aire en el glicerol. Finalmente, agregue una gota adicional de 100% glicerol al costado del cubreobjetos para llenar el espacio entre el vidrio y eliminar la deriva, use un microscopio estereoscópico o compuesto para obtener la imagen que se muestra aquí. Se utilizó una combinación de sondas junto con dos colores para etiquetar los progenitores renales en desarrollo que dan lugar al riñón y los embriones se montaron de forma plana en una etapa temprana.

Por lo tanto, en las etapas de los ácaros, los progenitores renales se demarcan en un patrón en forma de U por su expresión de las transcripciones PAX dos A que rodean el mesodermo parial que expresa concomitantemente delta C que se muestra en rojo. Cuando delta C fue comarcado con C crox 20, se reveló un subdominio rostral de los progenitores renales que expresa delta C analizando la expresión de PAX dos a, SLC cuatro A cuatro, SLC 12 A tres y S-M-Y-H-C uno en el 14. Por lo tanto, la etapa de ácaros permite el mapeo de todo el dominio progenitor renal con PAX dos A, y reveló que un subconjunto de células en el subdominio rostral expresaba SLC cuatro A cuatro.

Eso no se superpuso con el subdominio mimo de los progenitores renales que expresaron SLC 12 A tres. En esta figura se encuentran embriones con mutaciones en el gen Retinaldehído deshidrogenasa dos necesarios para la biosíntesis de ácido retinoico o embriones tratados con DEAB e inhibidor de ALD H desarrollados con expresión reducida o abrogada respectivamente de WT uno A, demostrando que el deseo de dos colores con la preparación de montaje plano es valioso para el estudio de los dominios celulares durante la organogénesis. En peces cebra con mutaciones genéticas o cuando se exponen químicamente a moléculas pequeñas Una vez dominada, esta técnica puede tardar de 10 a 15 minutos si se realiza correctamente.

Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como las imágenes, para responder preguntas adicionales, como dónde se encuentran los límites de los segmentos renales. Después de ver el video, debe tener una buena comprensión de cómo montar un embrión de pez cebra teñido para visualizar mejor las estructuras deseadas mediante la eliminación de la yema.