Name: Preparativos Piso en observación y análisis de embrión de pez cebra muestras teñidas por todo el montaje In situ La hibridación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-17T16:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Aprende a realizar montajes planos de embriones de pez cebra teñidos con hibridación in situ para mejorar la visualización dorsal. Este método elimina el vitelo y facilita el estudio de la organogénesis en biología del desarrollo.

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Este trabajo fue apoyado en parte por la financiación a RAW de cada uno de los siguientes: subvenciones del NIH K01 DK083512, DP2 OD008470 y R01 DK100237; March of Dimes Basil O&#39;Connor arranque Académico de subvención n º 5-FY12-75; poner en marcha los fondos de la Universidad de Notre Dame Colegio de Ciencias y el Departamento de Ciencias Biológicas. Nos gustaría agradecer especialmente a Elizabeth y Michael Gallagher, junto con toda la familia Gallagher, quien impartió una generosa donación a la Universidad de Notre Dame para fomentar investigación con células madre. Los financiadores no tenía papel en el diseño del estudio, recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Damos las gracias a los funcionarios del Departamento de Ciencias Biológicas por su apoyo, y el Centro de Investigación de Pez Cebra en Notre Dame por su extraordinaria dedicación en el cuidado y el bienestar de nuestra colonia de pez cebra. Por último, agradecemos a los miembros de nuestro laboratorio de investigación para sus comentarios, discusiones y puntos de vista acerca de este trabajo, ya queasí como Marigold (Maripooka) y Zinnia Wingert para proporcionar arrojar naturalmente bigotes felinos para hacer más excelentes herramientas de pestañas para nuestra investigación.

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Los autores no tienen nada que revelar.

El pez cebra han demostrado ser un organismo modelo de gran valor en toda la comunidad de investigación durante los últimos años. El pez cebra exhiben un alto grado de conservación genética con la de los vertebrados superiores, y las ventajas relacionadas con su anatomía, reproducción y ciclo de vida hacen de esta especie muy susceptible a los análisis experimentales. Por otra parte, el avance de las técnicas moleculares aplicables a la pez cebra ha promovido además el uso de este organismo modelo en la investigación científica. Por ejemplo, una gran variedad de líneas de pez cebra transgénico se han generado para estudiar la progresión de la enfermedad y para responder a muchas preguntas fundamentales que son la base de los mecanismos fundamentales del desarrollo, incluyendo la organogénesis. Por consiguiente, basado en el uso dinámico de pez cebra en tanto la enfermedad y la investigación del desarrollo, metodologías de etiquetado celular y cuantificación de la señal son un aspecto crucial de análisis de datos. Mientras que los métodos que emplean un fluorescentetibodies se pueden utilizar para detectar la expresión de la proteína en el pez cebra transgénico, los investigadores normalmente se basan en procedimientos estándar como de WISH 12-16 a examinar la localización espacio-temporal de las transcripciones de genes en una, muestra el pez cebra transgénico no fijo. De hecho, el deseo es una de las técnicas más utilizadas en la biología 16, y es una herramienta vital que se utiliza para caracterizar el fenotipo de las mutaciones genéticas y perturbaciones genéticas químicas. No obstante, desea que se asocia con una serie de dificultades y retos potenciales. Para confirmar la especificidad de la ribroprobe antisentido, ribosondas sentido se pueden utilizar como un control para evaluar la especificidad de los patrones de tinción ribosonda antisentido. Mientras que las secciones 4 y 5 se presentan en el orden de etiquetado y detección de una sonda marcada con digoxigenina seguida de la sonda marcada con fluoresceína, este orden se puede invertir. Normalmente, las señales más débiles (genes con niveles de expresión más bajos) se detectan mejor con sondas marcadas con digoxigenina y esta manchadesarrollado primero con un sustrato púrpura, seguido por la detección y la tinción de la señal más fuerte (gen más abundantemente expresado) utilizando el sustrato de color rojo. Sin embargo, si las reacciones de dos colores se van a realizar, se recomienda que diversas combinaciones de etiquetas y sustratos se ponen a prueba para encontrar el procedimiento que sea el más adecuado para la recolección y análisis de datos. Además, los tiempos previstos de bloqueo, de anticuerpos de incubación y el lavado suministrada en los Capítulos 4-5 se adaptan para los embriones de menos de 24 horas después de la fecundación; largos intervalos de estos mismos pasos con embriones mayores pueden conducir a la acumulación de sales en la muestra. Extensas consejos para la solución de problemas DESEO embrión de pez cebra norma ya se han documentado en la literatura 12-16. Podría decirse que el dilema más común es el alto fondo. Se recomienda aumentar el número de lavados MABT en el paso de 4,7 a 15 a 20 lavados, si es necesario, sin embargo, en nuestra experiencia, la adición de la noche a la mañana MABT &#39;súper-wash&#39;da excelentes resultados cuando se utiliza junto con 10 o más lavados MABT cortos antes de proceder al paso 4.8. Otro ejemplo dilema es pobre infiltración de la sonda, que puede ocurrir con largas ribosondas. Esquila la ribosonda siguiente Paso 3.6 a través de la hidrólisis alcalina puede contrarrestar esto. En nuestra experiencia con las muestras de los jóvenes, no se requiere típicamente esquila sonda. Sin embargo, hay que tener en cuenta que los parámetros de este tipo pueden ser factores contribuyentes en el resultado de un experimento de DESEO, y sugerimos el examen de soluciones en esta sección útil ya disposición del público en la comunidad, según sea necesario para refinar los parámetros experimentales para DESEO en su propia investigación 12. Además de las técnicas tradicionales de WISH 12-16, ha habido un surgimiento continuo de los avances en las metodologías de deseo y protocolos alternativos que se han formulado. Estos incluyen nuevas formas de detección de la señal, tales como mediante el uso de fluorescenciacencia 17-19, a los métodos que permiten la localización de microRNAs 20. Aún así, a pesar de las muchas mejoras que se han hecho a los métodos de etiquetado células actuales, la eficacia de estos procedimientos son negados si la mancha (s) no se puede visualizar fácilmente dentro de la muestra de interés en un punto de tiempo deseado. Esta limitación es un problema para los investigadores, especialmente cuando se refiere a las primeras etapas embrionarias de la ontogenia del pez cebra, que podría dar lugar a lagunas en nuestra comprensión de los diversos procesos de desarrollo que se plantean en estos momentos. Durante el desarrollo normal del pez cebra, el saco vitelino disminuye progresivamente de tamaño como los embriones mayores de 11 años. Por lo tanto, en estas etapas de desarrollo posteriores (&gt; 24 horas después de la fecundación), tinción DESEO es bastante sencillo de analizar porque el embrión es más grande en comparación con su contiguo saco vitelino. Sin embargo, este no es el caso de la etapa de yema de cola a somitogenesis temprana (cuando el embrionariamasa se coloca alrededor de la yema), donde el saco vitelino opaco a veces puede oscurecer la visualización de la mancha. En consecuencia, el método de montaje plana fue ideado para ayudar a aliviar los problemas de formación de imágenes y de análisis de datos asociados con la caracterización de las muestras de embrión de pez cebra (esquematizados en la Figura 1 y la Figura 2), y ha sido ampliamente utilizado desde la fenotipificación sistemática de mutaciones genéticas aisladas a partir de las primeras pantallas genéticos a gran escala 21. Desde el advenimiento de la técnica de montaje plana, el análisis de las etapas tempranas del desarrollo se ha mejorado significativamente. Una vez que la yema de huevo se retira del embrión, es posible colocar el plano de embriones en un portaobjetos de vidrio en la orientación deseada para la imagen. Esta posición de dos dimensiones permite la visualización de todo el embrión de una sola vez, lo que elimina la necesidad de girar la muestra. Numerosos tejidos se encuentran en amplios dominios del embrión, tales comolos precursores que forman la sangre y el riñón. Además, uno puede necesitar para comparar varios tejidos en desarrollo diferentes al mismo tiempo. El montaje plano permite al investigador ver simultáneamente todo el dominio de tales grupos de células, y por lo tanto puede ser de gran ayuda cuantificaciones como una medición de área para un tejido o célula recuentos. Esta técnica ha ayudado en última instancia, conducen a muchos descubrimientos sobre una variedad de mecanismos de desarrollo importantes que subyacen en la hematopoyesis, la neurogénesis y organogénesis. Así, una vez dominado, las solicitudes de esta técnica sencilla para los investigadores son muy importantes. Por ejemplo, en un estudio que examina la elección linaje durante la hematopoyesis, plana montar preparaciones de embriones de pez cebra en las etapas 14 y 18 somite (ss) se utilizaron para ilustrar los cambios que se produjeron en el patrón de expresión del factor de transcripción PU.1 dedo de zinc entre de tipo salvaje y GATA1 morpholino inyectado embriones 22.Este método permitió la detección de un dominio de PU.1 expandido en 18 SS, lo que indica que GATA1 es más probable que la regulación de la expresión de PU.1 en la masa celular intermedia (ICM) alrededor de este punto de tiempo. Embriones montados en plano adicional teñidas para diferentes genes eritroides incluyendo gtpbp1 y epsin demostraron una pérdida en la expresión de estos genes en mutantes VLT que eran GATA1 - / -. Otros análisis no mostraron cambios en la expresión de los genes del eritroides como biklf y testhymin que se sabe que es independiente de la actividad Gata. Por lo tanto, en conjunto con sus otros resultados experimentales, se reveló que GATA1 es esencial en la regulación de la diferenciación de células dentro del linaje eritroide mielo-. En un estudio de desarrollo de la cresta neural, se utilizaron soportes planos para examinar la expresión Crestin en mont blanc (m610 mob) mutantes en un estudioexaminar los papeles de mont blanc y la función del gen TFAP2A 23. A las 10 y 20 ss, expresión Crestin fue abrogado por completo en la cabeza y se redujo en la región del tronco de mutantes m610 mafia en comparación con la expresión normal de tipo salvaje, en última instancia, ayudar a este grupo a una conclusión sobre la importancia de la mont blanc y TFAP2A regulación durante la formación de la cresta neural. Además, en términos de la organogénesis, montajes planos han permitido el descubrimiento de la presencia de dominios distintos a principios del campo progenitoras renal durante el desarrollo del riñón embrionario de pez cebra, conocido como los pronephros. El embrión de pez cebra ofrece un sistema conservada y sin embargo sencillo anatómicamente para estudiar cómo progenitores renales dan lugar a las unidades de nefrones funcionales que comprenden los pronephros, un proceso conocido como nefrogénesis 6,7 (Figura 4). Análisis montar plana ha sido útil para los dominios de documentos de reprogenitores internos y para diseccionar el resultado de cambios en la señalización de RA durante pronephros que modelan 6,7 (Figura 5), que era desconocida hasta entonces. En conjunto, estos ejemplos sugieren que de hecho hay muchas aplicaciones generales para este piso protocolo de montaje en el estudio de diversos procesos que ocurren durante el desarrollo normal y estados de enfermedad. Conceptualmente, este procedimiento plana de montaje es bastante simple en general. Sin embargo, las manipulaciones y el grado de finura necesaria para dominar este método puede ser muy difícil de dominar, a falta de demostración visual. Por lo tanto, este protocolo fue compilado para permitir a los investigadores, especialmente los nuevos en el modelo de pez cebra, con la oportunidad de comprender mejor cómo llevar a cabo esta técnica y compartir nuestros consejos sobre los reactivos que pueden optimizar la manipulación de tejidos. Esperamos que este protocolo en última instancia permitirá a otros en la comunidad para perfeccionar las condiciones de la muestra más ideales para ser used para obtener imágenes de alta calidad, análisis de datos y la comunicación de sus resultados en publicaciones. En última instancia, esto debería permitir a los investigadores para superar los obstáculos anatómicos del pez cebra durante la embriogénesis temprana, que puede oscurecer la presentación de los resultados experimentales, y resolver estos a través de la utilización de esta técnica simple pero significativo.

El pez cebra, Danio rerio, se ha convertido en un organismo ampliamente utilizado en el estudio de la biología del desarrollo. El pez cebra son una tropicales, especies de vertebrados de agua dulce pertenecientes a la familia de los ciprínidos. El pez cebra fueron utilizados originalmente para la investigación del medio ambiente para obtener información sobre los riesgos potenciales de los contaminantes del agua, ya que eran fáciles de obtener, baratos y fáciles de mantener 1. En los últimos treinta años, el pez cebra se ha reconocido como un sistema modelo de vertebrados genéticamente manejable para una serie de razones. El pez cebra muestran un alto nivel de conservación anatómica y fisiológica con los vertebrados superiores, incluyendo mamíferos 2,3. Recientes secuencia del genoma anotación ha puesto de manifiesto que aproximadamente el 70% de los genes humanos tienen al menos un homólogo pez cebra 4. Por ejemplo, muchos genes ortólogos que juegan un papel importante durante el desarrollo del riñón se han identificado entre estas especies 5-7. Este dramatic grado de conservación en relación con la biología celular y molecular ha permitido a los investigadores para crear modelos para una amplia gama de enfermedades humanas en el pez cebra 8, y el pez cebra se han convertido en una herramienta valiosa para identificar posibles terapias de drogas utilizando las pantallas de genética químicas 9. Por otra parte, el modelo de pez cebra no sólo es capaz de recapitular una serie de complejos procesos de desarrollo y estados patológicos que se observan en los seres humanos, pero varios atributos adicionales también aumentar su atractivo como un organismo modelo para estudios embriológicos. El pez cebra son ovíparos y se reproducen a través de desove de difusión, lo que proporciona a los investigadores un acceso fácil a los embriones desde el inicio de la fertilización 10. Otras ventajas incluyen el tamaño del embrión, la transparencia, y el rápido desarrollo, externa 10. Además, los adultos de pez cebra poseen alta fecundidad y por lo general producen relativamente grandes tamaños de postura que pueden oscilar entre 200 a 500por semana, lo que en última instancia, los investigadores para llevar a cabo experimentos de rendimiento altas, tales como pantallas químicas fenotipo basado, con facilidad 9. Aún así, a pesar de la gran cantidad de ventajas que se exhiben por el modelo de pez cebra, existen retos que se refieren al análisis y la comunicación de los resultados experimentales obtenidos a partir de las etapas tempranas del desarrollo. En algunos casos, la anatomía inherente del embrión de pez cebra podría oscurecer la visualización de los datos de uno. Después de la fecundación, la célula inicial se somete a múltiples eventos de escisión como progresa el desarrollo 11. Después de la gastrulación, el eje embrionario surge en la fase de tailbud (10 HPF) de tal manera que se envuelve alrededor de la yema 11. Como el desarrollo posterior avanza a través del período de segmentación, el tronco crecerá en masa y también alargar por alargamiento axial de tal manera que una cola junto con una porción del saco vitelino en sí se extiende hacia fuera de la masa central de la yema11. Entre el tailbud y somite etapa 20 (19 HPF), los intentos de observar las características específicas de desarrollo después de la utilización de los distintos protocolos de tinción, tales como el deseo, puede ser un reto tanto para visualizar y fotografiar debido a la geometría del embrión y la opacidad de el saco vitelino. Una forma de eliminar estos retos es eliminar la yema y luego aplanar el embrión en una muestra de dos dimensiones que puede ser analizada de una manera más sencilla. Los siguientes recursos de protocolo y de vídeo proporcionan una guía para saber cómo deyolk con éxito y plana montar un embrión después de la fijación y la tinción, utilizando el ejemplo de uno o tinción DESEO de dos colores. Deseo es una técnica ampliamente utilizado que permite la detección de ácidos nucleicos específicos en muestras conservadas y por lo tanto permite el sitio (s) de la expresión génica para ser detectado dentro de los tejidos. Técnicas de WISH se han descrito extensamente, y se puede realizar con diversos sustratos de colores, así como la gripesistemas de detección de orescent 12-20. Aquí ofrecemos nuestro protocolo DESEO modificado utilizado para los embriones de pez cebra entre las etapas tailbud y segmentación de desarrollo. DESEO protocolos alternativos, sin embargo, son compatibles con el procedimiento de montaje plana descrita aquí, como se señaló al comienzo del protocolo a continuación. Además, el montaje plano podría ser utilizado en conjunción con cualquier número de técnicas de visualización existentes, como toda la inmunohistoquímica monte, ni etiquetas de seguimiento de linaje celular, que no están escritas en este protocolo. En general, la técnica de montaje plana mejor puede permitir el análisis superior y presentación de los datos obtenidos a partir de experimentos con las primeras etapas del desarrollo embrionario en el pez cebra.

<table><tbody><tr><td>50 X E3</td><td></td><td></td><td>250 mM de NaCl, 8,5 mM de KCl, 16,5 mM de CaCl2, 16,5 mM MgSO4 en agua destilada. Suplementar con azul de metileno (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) para inhibir la contaminación.</td></tr><tr><td>1 x E3</td><td></td><td></td><td>Diluir 50 x E3 en agua destilada.</td></tr><tr><td>Colador de té de malla</td><td>English Tea Store</td><td>SKU #ASTR_KEN, MPN#1705</td><td></td></tr><tr><td>Plato de incubación de embriones</td><td>Falcon</td><td>35-1005</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de transferencia</td><td>Samco</td><td>202, 204</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga de fondo plano</td><td>VWR</td><td>87003-300; 87003-298</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de vidrio</td><td>Wheaton</td><td>225012</td><td></td></tr><tr><td>1x PBST</td><td></td><td></td><td>Detergente Tween-20 al 0,1% en 1x PBS, elaborado diluyendo 10x PBS en agua destilada.</td></tr><tr><td>Stock de preadolescentes de 20</td><td>años American Bioanalytical</td><td>AB02038</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB11072</td><td></td></tr><tr><td>Servicios de Microscopía Electrónica</td><td>de Paraformaldehído</td><td>19210</td><td></td></tr><tr><td>4% PFA/1X PBS</td><td></td><td></td><td>Disuelva el 4% de PFA (w/v) en 1x PBS, deje hervir en una placa caliente en una campana extractora. Enfríe y congele las alícuotas para almacenarlas a -20 °C. Descongele justo antes de usarlas y no vuelva a congelar las existencias.</td></tr><tr><td>Unidad de esterilización de filtros</td><td>Corning</td><td>430516</td><td>sistema de filtrado de 1 L, 0,45 &mu; m CA</td></tr><tr><td>MeOH</td><td>Sigma</td><td>34860-4L</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>Roche</td><td>03-115-879-001</td><td>Disolver en agua destilada para hacer caldo de proteinasa K (10 mg/ml) y almacenar alícuotas a -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>HYB+</td><td></td><td></td><td>50% formamida, 5x SSC, 0,1% Tween-20, 5 mg/ml de levadura ARN de torula, 50 &mu; g/&mu; l reactivos</td></tr><tr><td>de reacción de reacción de transcripción con ribosonda marcados con heparina DIG/FLU in vitro</td><td>Roche</td><td>11175025910; 11685619910</td><td>Consulte las instrucciones del fabricante.</td></tr><tr><td>SP6 ARN polimerasa Roche</td><td></td><td>11487671001</td><td></td></tr><tr><td>T7 ARN polimerasa</td><td>Roche</td><td>10881775001</td><td></td></tr><tr><td>T3 ARN polimerasa</td> Roche <td>11031171001</td><td>Inhibidor</td> de la ARNasa 1 Roche 3335399001 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de la DNasa 1, 10x tampón de DNasa 1</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>Glucógeno</td><td>Roche 10901393001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol (EtOH)</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td>Alícuota 50 ml de alícuotas de 100% EtOH y 70% EtOH (diluido con agua de grado molecular) y almacenar a -20 °C.</td></tr><tr><td>Agua destilada de grado molecular</td><td>Mediatech</td><td>25-055-CM</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>Thermo</td><td>51221073</td><td>Modelo 2831</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo</td><td>ND-2000c</td><td></td></tr><tr><td>Formamida</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00600</td><td>Almacene a -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>American Bioanalytical AB13156</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MAB</td><td></td><td></td><td>2 L formula: En 1,5 L de agua destilada, mezcle 23,2 g de ácido maleico, 17,5 g de NaCl, 55,0 g de Trisma base, luego agregue 8 ml de 1M Tris-HCl pH 9.5 y luego llene hasta 2 L. Autoclave.</td></tr><tr><td>MABT</td><td></td><td></td><td>MAB + 0,1% (v/v) Tween-20</td></tr><tr><td>Block solution</td><td></td><td></td><td>Elaboramos en 50 ml de alícuotas frescas: 10 ml de BSA (a partir del 10% de stock de laboratorio), 5 ml de FCS (de stock) y 35 ml de MABT. Guarde el bloque no utilizado en 4 & deg; C para usar como solución de anticuerpos. Nota: Descongele las acciones de BSA y FCS a 37 &deg; C&ndash; Si se descongelan a una temperatura más alta, se convierten en un gel espeso (no lo use).</td></tr><tr><td>FCS (suero fetal de ternero) caldo</td><td>Invitrogen</td><td>16140089</td><td>Aliquot en porciones de 5 o 10 ml y almacenar a -20 °C.</td></tr><tr><td>Caldo de BSA (albúmina sérica bovina)</td><td>American Bioanalytical AB00448</td><td></td><td>Haga un caldo al 10% diluido en MAB disolviendo las escamas de BSA a temperatura ambiente con agitación rápida, luego almacene 10 ml de alícuotas a -20 & C. Almacene las escamas de BSA sin disolver a 4 & C.</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-digoxigenina</td><td>Roche</td><td>11-093-274-910</td><td>Almacenar en 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Anticuerpo antifluoresceína</td><td>Roche</td><td>11-426-338-910</td><td>Almacenar en 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>plato de tinción de 12 pocillos</td><td>BD-Falcon</td><td>35-3225</td><td></td></tr><tr><td>Tampón</td><td></td><td></td> de pretinción <td>100 mM Tris pH 9,5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0,1% (v/v) Tween-20. Hazlo siempre fresco: precipitará en el transcurso de unos días.</td></tr><tr><td>Solución de tinción-púrpura</td><td></td><td></td><td>Por cada 10 ml necesarios: agregue 45 &#956; l de NBT y 35 &#956; l de BCIP a tampón de pretinción fresco (no utilizado en muestras de embriones).</td></tr><tr><td>Solución de tinción-rojo</td><td></td><td></td><td>Por cada 10 ml necesarios: añadir 31,5 &#956; l de INT y 35 &#956; l de BCIP a tampón de pretinción fresco (no utilizado en muestras de embriones).</td></tr><tr><td>Stock NBT</td><td>Sigma</td><td>N6876</td><td>Almacenado a -20 &deg; C; polvo diluido 50 mg/ml en 70% DMF, 30% agua.</td></tr><tr><td>Stock INT</td><td>Sigma</td><td>I8377</td><td>Almacenado a -20 &deg; C; polvo diluido 55 mg/ml en 70% DMF, 35% agua.</td></tr><tr><td>Stock BCIP</td><td>Sigma</td><td>B8503</td><td>Almacenado a -20 &deg; C; polvo diluido 50 mg/ml en DMF al 100%.</td></tr><tr><td>DMF (dimetilformaldehído)</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00450</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td>0.1 M glicina, pH 2.2</td></tr><tr><td>Placa de Petri de plástico pequeña</td><td>Corning</td><td>430589, 430588</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G7893</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas finas</td><td>Roboz</td><td>RS-1050</td><td>Dumont Pinzas Patrón #55</td></tr><tr><td>Herramienta</td><td></td> de pestañas<td></td><td>Se construye fijando una pestaña adecuada a la punta de una pipeta (se pueden utilizar tamaños que van desde P10 a P1000) con superpegamento. Utilizamos una pestaña humana que se desprende de forma natural, un bigote de animal que se desprende de forma natural o un pelo de abrigo de piel nervudo, o una pestaña natural o sintética comprada en el departamento de belleza de una tienda farmacéutica o minorista (las pestañas extra largas son más susceptibles de un montaje estable en la punta de la pipeta). La punta de la pipeta se fija a una varilla recta (de 8 a 10 cm de longitud) como un soporte de aguja (p. ej., Fisher 08-965-A) para facilitar su manejo. Vea Figura 3 para ver imágenes de estas herramientas caseras.</td></tr><tr><td>Corredera de vidrio</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4445</td><td>White Frost</td></tr><tr><td>Funda de vidrio</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-540A</td><td>18 x 18 mm</td></tr><tr><td>Arcilla para modelar</td><td>Hasbro</td><td>Playdoh</td><td>Otros productos de arcilla para modelar artesanales pueden ser sustituidos.</td></tr><tr><td>Portaobjetos</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-587-10 Bandeja de</td><td>cartón para guardar portaobjetos planos.</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Nikon</td><td>SMZ645, SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio compuesto</td><td>Nikon</td><td>80i, 90i</td><td></td></tr></tbody></table>

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Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

El embrión de pez cebra se utiliza hoy día para la investigación básica y biomédica para investigar el control genético de los procesos de desarrollo y para modelar las anomalías congénitas. Durante el primer día de vida, el embrión de pez cebra que avanza a través de muchas etapas de desarrollo, incluyendo la fertilización, segmentación, gastrulación, segmentación y la organogénesis de estructuras tales como el riñón, el corazón y el sistema nervioso central. La anatomía de un joven embrión de pez cebra presenta varios desafíos para la visualización y el análisis de los tejidos involucrados en muchos de estos eventos ya que el embrión se desarrolla en asociación con una masa de yema ronda. Por lo tanto, para un análisis preciso y de formación de imágenes de fenotipos experimentales en especímenes embrionarias fijas entre la tailbud y 20 somite etapa (10 y 19 horas después de la fecundación (HPF), respectivamente), tales como las teñidas utilizando un montaje toda la hibridación in situ (desea), se a menudo es deseable eliminar el embrión de la yema de Btodos y a la posición plana sobre un portaobjetos de vidrio. Sin embargo, la realización de un procedimiento de soporte plano puede ser tedioso. Por lo tanto, plana exitosa y eficiente montaje preparación se facilita en gran medida a través de la demostración visual de la técnica de disección, y también ayudado por el uso de reactivos que facilitan el manejo óptimo de los tejidos. Aquí, le ofrecemos nuestro protocolo DESEO para la detección de uno o dos colores de la expresión génica en el embrión de pez cebra, y demostrar cómo el procedimiento de montaje plana se puede realizar en este ejemplo de una muestra fija de colores. Este protocolo de montaje plana es ampliamente aplicable al estudio de muchas estructuras embrionarias que surgen durante el desarrollo de pez cebra temprana, y puede ser implementado en conjunción con otros métodos de tinción realizadas en muestras de embrión de fijos.

El procedimiento de protocolo de montaje plana implica la transformación del embrión de pez cebra de su anatomía normal, en la que el eje del cuerpo se envuelve alrededor de una pelota de yema situado en el centro, en una de dos dimensiones preparación (Figura 1A). Total de imágenes monte de la joven embrión de pez cebra se ve limitada por la naturaleza de cómo se ajusta el eje embrionario alrededor de la yema. Como resultado, vistas laterales o dorsales de todo el montaje de embrión de especímenes teñidos sólo pueden capturar una parte del eje o tejidos particulares oscuros (Figura 1B). Por comparación, deyolking y aplanamiento del embrión permite que todo el eje embrionario para ser visualizado en un momento (Figura 1B). Estas limitaciones se demuestran mediante el examen de un embrión de WISH manchado que se marcó con ribosondas antisentido para detectar irx3b (púrpura), que marca un subconjunto de los progenitores renales adyacentes a somitas 7 a través de 13, y MYOD1 (rojo) que las etiquetas de lasomitas (Figura 1B). El campo de la irx3b + renales progenitores está oscurecida en el conjunto de montaje en vista lateral porque transcripciones irx3b son abundantes en el sistema nervioso central, por lo que el campo renal prácticamente imposible visualizar con el ángulo de la cámara lateral; Además, el campo de la irx3b + progenitores renales es sólo parcialmente visible cuando el embrión se hace girar en una vista de cámara dorsal porque el campo se envuelve alrededor de la yema (Figura 1B). Sin embargo, una vista dorsal del mismo embrión siguiente montaje plana permite a todo el campo de irx3b + progenitores renales para ser analizados de una forma sencilla en relación con los somitas a lo largo del tronco y otras estructuras embrionarias (fig. 1B). Por lo tanto, los dominios espaciales elaboradas pueden ser idealmente documentados con este método. Varios pasos más importantes están involucrados en la ejecución con éxito del procedimiento en lo plano. Para realizar esta techniquE, el balón yema debe ser separada primero del embrión adecuado (Figura 2A), que se puede hacer con instrumentos finos tales como un par de pinzas finas, mientras que el embrión se visualizó usando un microscopio estereoscópico. Después de la eliminación crudo de la bola de yema de huevo, una herramienta de pestañas fina se utiliza para raspar gránulos de yema de que se han mantenido unido al embrión (Figura 2B). La eliminación de los gránulos resto de yema ayuda para facilitar la visualización de los tejidos embrionarios. Finalmente, el embrión deyolked se manipula para posicionarlo de manera estable en un portaobjetos de vidrio (Figura 2C), que permite la documentación de la observación y el SIDA de la muestra usando el software de imágenes y una cámara conectada a un microscopio. Las herramientas de las pestañas son dispositivos caseros que se pueden construir mediante la colocación de un látigo adecuado para una punta de pipeta utilizando pegamento, que se pueden montar en un mango (Figura 3A, mesa de Materiales) si se desea. Diferentes muestras de pestañas pueden ser adquiridos para producirarremeter herramientas con características ligeramente diferentes en términos de longitud y forma cónica (Figura 3B), que cada usuario puede tener distintas predilecciones para una vez que comienzan a experimentar con el procedimiento en lo plano. Los ejemplos de muestras de pestañas incluyen arrojar naturalmente pestañas humanos, vertiente natural de pelo hirsuto animal o bigotes, y, finalmente, las variedades sintéticas de las pestañas disponibles en el mercado encuentran en los departamentos de cosméticos de venta. La zona que rodea y que contiene la muestra (s) posicionado sobre un portaobjetos de vidrio (Figura 4A) se pueden obtener imágenes para el análisis de alta resolución. Una combinación de sondas se utilizaron para etiquetar los progenitores renales en desarrollo que dan lugar al riñón en el embrión de tipo salvaje en las etapas tempranas del desarrollo con el deseo de dos colores, y luego montar plana preparativos se realizaron para ver las muestras (Figura 4B, 4C ). Durante las primeras etapas somite, progenitores renales están demarcadas en un patrón en forma de U por thEIR expresión de las transcripciones pax2a (púrpura) que rodean el mesodermo paraxial que expresa de forma concomitante Delta C (DLC) (rojo) (columna de la izquierda, la figura 4B) 6,7. En comparación, cuando se detectaron las transcripciones de DLC con un sustrato de color púrpura, y se marcaron en combinación con el marcador de Krox20 cerebro posterior (rojo), un subdominio rostral de los progenitores renales se visualizó que expresa DLC (columna de la derecha, Figura 4B), como se señaló anteriormente 6,7. Montar preparaciones planas pueden ser utilizados de manera similar para estudiar las etapas somitogenesis posteriores. En la etapa de somite 14, se analizó la expresión de marcadores renales pax2a, slc4a4 y SLC12A3 (púrpura), junto con smyhc1 (rojo), que marca las somitas (Figura 4C). Estas combinaciones permiten el mapeo de todo el dominio progenitoras renal con pax2a, al tiempo que revela que un subconjunto de células en una expr subdominio rostralcomputan slc4a4a y se distinguen por un subdominio caudal que no se solapan de progenitores renales que expresaban SLC12A3. WISH-Dos color y la preparación plana de montaje también son valiosos para el estudio de dominios celulares durante la organogénesis en el pez cebra con mutaciones genéticas u otras perturbaciones de la exposición ambiental a moléculas pequeñas 6,7 (Figura 5). Las NLS de pez cebra y mutantes lib albergan mutaciones en aldehído deshidrogenasa 1A2 (aldh1a2, anteriormente conocido como RALDH2), que codifica una enzima necesaria para la biosíntesis de ácido retinoico (RA). RA es esencial para el correcto desarrollo de muchos tipos de células renales, incluyendo la formación de células podocitos que contribuyen a hacer que el filtro de sangre del riñón embrionario, conocido como el glomérulo 6,7. DESEO se realizó para etiquetar los progenitores podocitos con wt1a concomitantemente con demarcación de tque el desarrollo de somitas con smyhc1 y cerebro posterior con Krox20 en embriones de tipo salvaje, nls embriones mutantes, embriones mutantes lib, y los embriones tratados con un inhibidor de la enzima ALDH química, DEAB (Figura 5). Los embriones con expresión aldh1a2 deficientes mostraron reducción de la expresión wt1a en comparación con los embriones de tipo salvaje, mientras que los embriones tratados con DEAB mostraron una abrogación de transcripciones wt1a (Figura 5, columna derecha). En conjunto, estos resultados representativos demuestran cómo la técnica plana de montaje se puede utilizar para analizar y documentar las diferencias anatómicas con precisión en el embrión temprano, y así implementar para los estudios de desarrollo de valor. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig1.jpg" /> Figura 1. Visión general del plano de montaje preparación para los embriones de pez cebra. A) El procedimiento de montaje plana permite la visión simultánea de los tejidos a lo largo del eje embrionario, porque se retira la masa de yema central y el embrión de forma estable colocada sobre una superficie plana. B) Las imágenes de un montaje DESEAN embrión manchada en las vistas lateral y dorsal, y luego, después se llevó a cabo una preparación plana de montaje. El embrión se tiñó con sondas antisentido para detectar transcripciones de genes que codifican irx3b (púrpura) y MYOD1 (rojo). <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig2.jpg" /> Figura 2. Esquema del procedimiento de montaje plana para los embriones de pez cebra. A) El embrión se primera groseramente deyolked para eliminar la mayoría de la masa de yema de huevo, a continuación, (B) la superficie ventral se deyolked finamente para eliminar restantes gránulos de yema, ydespués de lavar el embrión es (C) montado lado dorsal sobre un portaobjetos de vidrio para el análisis visual y / o de formación de imágenes fotográficas. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig3.jpg" /> Figura 3. Fotografías de ejemplo herramientas de pestañas en comparación con unas pinzas finas. A) herramientas de pestañas hechas en casa eran imágenes junto con un par de pinzas finas estándar, situado adyacente a una regla métrica para proporcionar una referencia. B) La vista ampliada de las herramientas de las pestañas al lado de las pinzas finas, con la referencia milímetro proporcionado a lo largo de la parte superior de la vista . Dos herramientas de pestañas diferentes se muestran, con el asterisco (*) se utiliza para marcar el látigo obtenido de una vertiente natural de las pestañas humana, y el doble asterisco (**) utiliza para marcar un latigazo que se obtuvo de un pelo arrojar naturalmente felino y se recorta a hacer un final un tanto romo. En cada case, el látigo se ha enhebrado a través de la punta de la pipeta y se fija con varias capas de pegamento para crear progresivamente un sello fuerte para estabilizar / anclar el látigo de la pipeta conectada a un dispositivo de manipulación. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig4.jpg" /> Figura 4. Caracterización de los cambios de desarrollo en el campo progenitoras renal en el embrión de pez cebra de tipo salvaje. A) Deslice esquemática que indica el área observada para el análisis en (B, C). B) embriones de tipo salvaje en el 1, 3, y 5 somite etapa se tiñeron por el deseo de dos colores para evaluar la composición del campo progenitoras renal que da la altura de las de riñón de embrión o pronephros. (Columna izquierda) Las transcripciones que codifican el factor de transcripción pax2a (teñida de púrpura) marcan varias poblaciones en el embrión, incluyendo el p renalcampo rogenitor que emerge de la mesodermo intermedio. Las transcripciones que codifican el ligando de Notch DLC marcan los somitas que se forman a partir del mesodermo paraxial (teñido en rojo). (Columna derecha) Cuando la expresión de transcritos dlc (teñidas en púrpura) y el cerebro posterior rhombomere marcador Krox20 (teñido en rojo) se examinan en los mismos embriones, expresión dlc se puede observar en un subdominio rostral de los progenitores renales adyacentes a somitas 1-5, que se oscurece durante la co-tinción de dlc con pax2a. C) embriones de tipo salvaje en la etapa 14 somite eran doble o triple manchado con una combinación de un marcador renal (púrpura), el smyhc1 marcador somite (rojo) y el cerebro posterior rhombomere marcador Krox20 (también rojo). (Panel superior) En esta etapa, las transcripciones pax2a seguir para demarcar los progenitores renales. (Media, paneles inferiores) Dentro del territorio progenitor renal, un subdominio rostral está marcadopor slc4a4 y transcripciones que codifican SLC12A3 marcar un subdominio caudal. <img alt="La figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig5.jpg" /> Figura 5. El uso de preparaciones montadas planas para caracterizar los fenotipos causados ​​por mutaciones genéticas o perturbaciones genéticas químicos que modulan la biosíntesis de ácido retinoico. El patrón de expresión de deseo en la etapa 15 somite de wt1a (púrpura) y smyhc1/krox20 (rojo) se comparó entre los tipos silvestres y embriones con deficiencia de ácido retinoico (RA) de la producción debido a los defectos en la aldehído deshidrogenasa 1a2 (nls y mutaciones lib) o la inhibición química de la actividad deshidrogenasa retinaldehído con diethylaminobenzaldehyde (DEAB). La reducción de la producción de la AR en lib es ligeramente más grave que nls, talesque los embriones lib expresan ligeramente reducida tinción de las transcripciones wt1a que organizó de manera similar nls embriones mutantes, mientras que el tratamiento DEAB de tipos silvestres se asocia con la derogación completa de la expresión wt1a.

El embrión de pez cebra es un excelente modelo para la investigación de la biología del desarrollo. Durante la embriogénesis, el desarrollo de pez cebra con una masa de yema, que presenta retos en tres dimensiones para la observación de muestras y análisis. Este protocolo se describe cómo crear dos dimensiones planas montar preparaciones de todo el montaje in situ (WISH), teñidas muestras de embriones de pez cebra.

Preparativos Piso en observación y análisis de embrión de pez cebra muestras teñidas por todo el montaje<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model ...

El objetivo general de este procedimiento es visualizar mejor embriones de pez cebra teñidos y fijados en puntos temporales tempranos del desarrollo. Esto se logra primero teñiendo el embrión de pez cebra mediante hibridación en C dos con montaje casero. A continuación, se selecciona un embrión para montarlo plano y se realiza una incisión central en la yema con un par de pinzas finas; luego, se utilizan herramientas de raspado para raspar y eliminar suavemente los gránulos de yema restantes.Finalmente, el embrión se monta en glicerol sobre un portaobjetos para permitir la visualización adecuada del espécimen. En definitiva, el montaje plano permite una mejor visualización de los embriones teñidos desde una vista dorsal, al eliminar la yema y colocar al embrión en una preparación bidimensional. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como la obtención de imágenes de embriones intactos en etapas tempranas de desarrollo, es que el montaje plano elimina la vesícula vitelina, lo que permite observar al embrión completo.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del desarrollo, como caracterizar el dominio del campo pregonadal renal en un embrión. En general, las personas nuevas en este método tienen dificultades porque esta técnica requiere un manejo delicado del embrión, y también porque aprender la cantidad adecuada de presión necesaria para eliminar la vesícula vitelina puede llevar tiempo. Quienes demostraremos este procedimiento seré yo, Zoe, y Amanda, quienes somos estudiantes de posgrado en el laboratorio de Winger.Después de recolectar, fijar y teñir embriones según el protocolo descrito, seleccione un embrión para su montaje plano con una X-P-B-S-T. Transfiera el embrión a una placa de Petri de plástico o vidrio. Luego, con la placa bajo un microscopio estereoscópico, use pinzas finas para girar el embrión de modo que se obtenga una vista lateral con los extremos de la cabeza y de la cola visibles.A continuación, utilice pinzas finas para sostener el embrión firmemente y un segundo par para realizar una incisión en la yema en una posición central ubicada entre la cabeza y la cola del embrión. Luego, con pinzas finas, retire la yema de la cavidad de la célula de roble. Utilice un X-P-B-S-T para enjuagar los restos de yema del embrión, empleando una o dos gotas de un XPBS.Transfiera el embrión a una placa de vidrio plana. Arrastre el embrión hasta el borde del tampón para que permanezca en una posición plana contra la placa de vidrio. Mientras sujeta el embrión, utilice una herramienta de pestaña para raspar suavemente la superficie ventral y eliminar los gránulos de yema.Si la solución de PBST se obstruye con exceso de yema o comienza a evaporarse, agregue una o dos gotas frescas y arrastre el embrión hacia este tampón fresco. Una vez que se haya eliminado satisfactoriamente la yema, transfiera suavemente el embrión nuevamente a una placa de Petri con PBST para un enjuague final. A continuación, transfiera el embrión a una placa de Petri que contenga glicerol al 100% e incube durante cinco minutos.Para montar el embrión en un portaobjetos de vidrio, transfiéralo a un portaobjetos limpio. Coloque una o dos gotas de glicerol al 100 % y colóquelo con el lado ventral del vitelo enfrentado al portaobjetos. Utilizando una herramienta de pestaña, arrastre el embrión hacia el borde de la gota de glicerol para que permanezca en una posición plana contra el portaobjetos.Si el eje embrionario está curvado, use la pinza fina para hacer pequeñas incisiones en la yema restante con suavidad y aliviar la tensión, de modo que pueda colocarse plano sobre el portaobjetos. Coloque pequeñas porciones de arcilla plástica en los cuatro rincones de un cubreobjetos de vidrio de 18 por 18.Coloque lentamente la cubreobjetos sobre el embrión, inclinándola para minimizar las burbujas de aire en la glicerol. Finalmente, agregue una gota adicional de glicerol al 100% al costado de la cubreobjetos para llenar el espacio entre el vidrio y eliminar la deriva; utilice un microscopio estereoscópico o compuesto para obtener la imagen que se muestra aquí. Se utilizó una combinación de sondas junto con un marcado de dos colores para etiquetar los progenitores renales en desarrollo que darán origen al riñón, y los embriones se montaron planos en estadios tempranos.En la etapa de somita, los precursores renales se delimitan en un patrón en forma de U mediante la expresión de los transcritos PAX2a que rodean al mesodermo parial, el cual expresa simultáneamente delta C, mostrado en rojo. Cuando delta C fue marcado conjuntamente con Ccrox20, se reveló un subdominio rostral de los precursores renales que expresa delta C. Analizando la expresión de PAX2a, SLC4a4, SLC12a3 y S-M-Y-H-C1 en la etapa de 14 somitas, es posible trazar el mapa de todo el dominio de precursores renales mediante PAX2a, y se descubrió que un subconjunto de células en el subdominio rostral expresaba SLC4a4.Que no se superpuso con el subdominio coddle de los progenitores renales que expresaban SLC12A3. En esta figura, embriones con mutaciones en el gen Retin aldehído deshidrogenasa 2, necesario para la biosíntesis del ácido retinoico, o embriones tratados con DEAB e inhibidor de ALDH, se desarrollaron con expresión reducida o abrogada, respectivamente, de WT1A, demostrando que la técnica de hibridación in situ de dos colores con preparaciones en montaje plano es valiosa para el estudio de dominios celulares durante la organogénesis. En pez cebra con mutaciones genéticas o cuando se exponen químicamente a moléculas pequeñas, una vez dominada, esta técnica puede tardar de 10 a 15 minutos si se realiza adecuadamente.Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la obtención de imágenes para responder preguntas adicionales, como dónde se ubican los límites de los segmentos renales. Después de ver el video, debería tener una buena comprensión de cómo montar plano un embrión de pez cebra teñido con el fin de visualizar mejor las estructuras deseadas mediante la eliminación de la yema.

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Los procesos de desarrollo tales como la proliferación, el patrón, la diferenciación, y guía de axones se pueden modelar fácilmente en la médula espinal pez cebra. En este artículo se describe un procedimiento de montaje para los embriones de pez cebra, que optimiza la visualización de estos eventos.

La disección y de montaje lateral de embriones de pez cebra: Análisis para el Desarrollo de la médula espinal

El desarrollo de pez cebra se puede seguir durante días con la microscopía de lámina de luz cuando los embriones están inmersos en tubos de polímero ópticamente claros con agarosa de baja concentración.

Multicapa de montaje para microscopía de luz Hoja de largo plazo del pez cebra

Aquí, presentamos un método de montaje versátil que permite la obtención de imágenes a largo plazo del desarrollo posterior del cuerpo de embriones vivos de pez cebra sin perturbar el desarrollo normal.

Un método de montaje versátil para largo plazo de imágenes de Desarrollo de pez cebra

Desarrollo de cilios es vital para la correcta organogénesis. Este protocolo describe un método optimizado para la etiqueta y visualizar las células ciliadas del pez cebra.

Visualización de las células Multiciliated en el pez cebra a través de un protocolo combinado de todo Monte fluorescente In Situ hibridación e inmunofluorescencia

Este artículo describe un método para montar embriones frágiles de pez cebra para microscopía confocal de lapso de tiempo extendido. Este método de bajo costo es fácil de realizar utilizando platos regulares de microscopía de fondo de vidrio para obtener imágenes en cualquier microscopio invertido. El montaje se realiza en capas de agarosa a diferentes concentraciones.

Un método de montaje en capas para la microscopía confocal de lapso de tiempo extendido de embriones enteros de pez cebra

Aquí, presentamos un protocolo para la detección de proteínas mediadas por anticuerpos fluorescentes en preparaciones enteras de embriones y larvas de peces cebra.

Inmunohistoquímica de montaje completo en embriones y larvas de pez cebra

Se describe una estrategia de preparación de muestras para obtener imágenes de embriones tempranos de pez cebra dentro de un corion intacto utilizando un microscopio de lámina de luz. Analiza las diferentes orientaciones que adquieren los embriones dentro del corion en las etapas de epibolia y yema del 70% y detalla estrategias de imagen para obtener una resolución a escala celular en todo el embrión utilizando el sistema de lámina de luz.

Imágenes de microscopía de lámina de luz y estrategias de montaje para embriones tempranos de pez cebra

Aprende a realizar montajes planos de embriones de pez cebra teñidos con hibridación in situ para mejorar la visualización dorsal. Este método elimina el vitelo y facilita el estudio de la organogénesis en biología del desarrollo.

Preparativos Piso en observación y análisis de embrión de pez cebra muestras teñidas por todo el montaje

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