La visualización del parénquima vascular y la regeneración después del 70% hepatectomía parcial en ratones normales

Visualización de la regeneración vascular y parenquimatosa tras una hepatectomía parcial del 70% en ratones normales. Tradicionalmente, la regeneración hepática se evalúa midiendo el aumento del peso y el volumen del hígado, así como mediante la determinación de la tasa de proliferación de hepatocitos. Hoy en día, estamos interesados en la regeneración vascular del hígado en ratones y queremos visualizar y cuantificar el crecimiento vascular.

Por lo tanto, establecemos el flujo de trabajo para la regeneración vascular por imágenes. El flujo de trabajo consta de cuatro pasos: contraste del árbol vascular, adquisición de tomografías computarizadas, reconstrucción 3D y análisis cuantitativo y cualitativo de las imágenes resultantes. El flujo de trabajo comienza con el contraste del árbol vascular.

Primero exponemos el hígado, ya sea uno normal o resecado, luego inyectamos el compuesto de contraste de silicona polimerizante en la vena porta o en la vena hepática, dependiendo del sistema vascular de interés. A continuación, los hígados explantados se someten a un escaneo en una microtomografía computarizada. Después de la exploración, realizamos una reconstrucción vascular en 3D utilizando el software preclínico Imalytics.

Si la calidad técnica de las imágenes resultantes es lo suficientemente buena, se puede realizar una reconstrucción en 3D con HepaVision. Este programa se utiliza en las clínicas para planificar la cirugía hepatobiliar. Además de la visualización en 3D del árbol vascular, este programa permite la visualización y cálculo del volumen hepático, del hígado total y de cada lóbulo, en función de los vasos de suministro y drenaje.

Después de la reconstrucción, podemos determinar parámetros adicionales indicativos de crecimiento vascular, como la longitud y el diámetro de un vaso específico, con la ayuda de técnicas computacionales. Esto permitirá una descripción cuantitativa del crecimiento vascular. Por otro lado, las muestras de Microfil fijadas en formol se pueden cortar en secciones seriadas.

Las secciones en serie se pueden teñir y digitalizar utilizando un escáner de portaobjetos completo. Después del registro rígido y elástico de las secciones seriadas, se pueden reconstruir árboles vasculares en 3D de los sistemas venoso portal y hepático. En un paso futuro, queremos explorar la distribución espacial de los eventos moleculares.

Un ejemplo de un evento molecular de interés en la regeneración hepática es la aparición del marcador de proliferación Ki-67 en los núcleos de los hepatocitos y su distribución espacial en los árboles vasculares reconstruidos en 3D. A continuación, vamos a dar una introducción detallada de cómo realizar la inyección de Microfil. Preparación de los reactivos.

Para la mezcla de compuesto Microfil, necesitamos diluyente MV, compuesto MV, en nuestro caso, el MV-120 azul, y agente de curado. También necesitamos pipetas, tubo y una pipeta. Prepare dos mililitros MV-120 en un tubo de cinco mililitros.

A continuación, dilúyelo añadiendo tres mililitros de diluyente MV. Mézclalos agitando suavemente. Para la solución salina de heparina, agregue 1 mililitro de heparina en solución salina de 10 mililitros.

Preparación de la mesa de operaciones. En primer lugar, necesitamos un microscopio, en segundo lugar, se necesita un conjunto de consumibles. Suturas de seda 6-0 y polipropileno 6-0, jeringas de cinco mililitros y un mililitro, agujas de calibre 30 y 21, tubo de extensión para conexión jeringa y catéter, catéter de calibre 26 con inserción de aguja, puntas de algodón y gasa.

En tercer lugar, se necesitan instrumentos quirúrgicos. Micro instrumentos, pinzas y coagulador eléctrico. En cuarto lugar, se necesita una bomba de perfusión.

Preparación del animal. Coloque el ratón en la cámara de inducción de anestesia y anestesie al ratón con isoflurano al 2% y oxígeno de 0,3 mililitros por minuto. Fijar el ratón anestesiado en la mesa de operaciones mediante cintas, con inhalación continua de isoflurano al 2% y 0,3 mililitros por minuto de oxígeno.

Inyección de Microfil, sistema venoso portal. Realice una incisión transversal en el abdomen con unas tijeras para la capa de piel y un coagulador eléctrico para la capa muscular. Saque los intestinos hacia el lado izquierdo con puntas de algodón y cubra los intestinos con una gasa empapada en solución salina.

Disecciona la vena porta bajo el microscopio. Coloque la sutura de seda 6-0 debajo de la vena porta extra hepática a una distancia aproximada de un milímetro hasta su bifurcación. Átalo sin apretar para usarlo más tarde.

Inyecte la solución salina de heparina por una vena del pene para la heparinización sistémica durante cinco minutos. Esta animación demostrará el procedimiento de inserción del catéter. Primero, coloque la sutura de seda 6-0 debajo de la vena porta extra hepática, luego inserte el catéter de calibre 26 en la vena porta y fíjelo con una pinza.

Lime la sutura precolocada para fijar el catéter y bloquear el flujo sanguíneo de la vena esplénica y la vena mesentérica. Aquí demostraremos el procedimiento quirúrgico. Inserte el catéter de calibre 26 con aguja.

Inserte el catéter más y saque la aguja lentamente al mismo tiempo. Fije el catéter con una pinza. Llene completamente el catéter con solución salina de heparina para evitar burbujas de aire.

Conecte el tubo de extensión al catéter y fíjelos firmemente. Encienda la bomba de perfusión. Iniciar la perfusión salina con heparina con un caudal de 0,4 mililitros por minuto.

Observe que los lóbulos derechos se ponen pálidos inmediatamente después de la perfusión. Enjuague el hígado con solución salina para mantenerlo húmedo durante todo el procedimiento de perfusión. Eutanasia del ratón por exanguinación vía perfusión bajo anestesia.

Continúe la perfusión de heparina durante varios minutos hasta que todo el hígado se ponga pálido. Antes de la perfusión de Microfil, agregue 0,1 mililitros de agente de curado en el compuesto Microfil preparado para acelerar el procedimiento de polimerización. Cargue el compuesto Microfil en una jeringa de cinco mililitros y un tubo de extensión.

Deshazte de las burbujas de aire inyectando la solución salina de heparina en el catéter, igual que antes. Conecte el tubo con el catéter y fíjelo firmemente. Inicie la inyección de Microfil con un caudal de 0,2 mililitros por minuto durante aproximadamente uno o dos minutos.

Observe cómo el agente azul se extiende lentamente por las ramas de la vena porta. Detenga la perfusión cuando la estructura azul de los vasos aparezca en la superficie de cada lóbulo hepático como se indica en un círculo rojo. Deje el hígado durante al menos 15 minutos para la polimerización del compuesto Microfil.

Inyección de Microfil, sistema venoso hepático. El procedimiento sigue básicamente los mismos pasos que la inyección en el sistema venoso portal. Coloque una sutura de seda 6-0 debajo de la vena porta extra hepática a una distancia aproximada de un milímetro hasta su bifurcación.

A continuación, inserte un catéter en la vena porta y fíjelo mediante una pinza. Inserte otro catéter en la vena cava inferior y fíjelo también con una pinza. Lime la sutura precolocada para fijar el catéter y bloquear el flujo sanguíneo de la vena esplénica y la vena mesentérica.

Colocar una pinza en la vena cava inferior suprahepática para obstruir el flujo de salida del hígado. Ramas ligatas de la vena cava inferior, incluyendo ambas venas renales y el extremo distal de la vena cava inferior. Enjuague el hígado con solución salina de heparina a través del catéter uno.

Perfundir el sistema venoso hepático con el compuesto Microfil a través del catéter dos. Resultados, reconstrucción con micro TC. Obtuvimos reconstrucciones vasculares en 3D utilizando el software preclínico Imalytics después de la exploración Micro CT.

La regeneración vascular en los sistemas venoso portal y hepático apareció como elongación y ensanchamiento de las principales estructuras vasculares en combinación con una ramificación de vasos más pequeños. En el segundo día postoperatorio, los árboles vasculares de los lóbulos remanentes se alargaron. Al séptimo día postoperatorio, se hicieron visibles pequeñas ramas adicionales de la misma vena porta principal y la vena hepática.

Resultados: reconstrucción 3D codificada por colores del árbol vascular hepático y los territorios hepáticos dependientes. Cada lóbulo del hígado se visualizó fácilmente en las tres dimensiones después de la reconstrucción codificada por colores por HepaVision. Como se indica en la tabla, se determinaron los volúmenes hepáticos del hígado total y de cada lóbulo, como se muestra aquí, para el sistema venoso hepático de un hígado normal.

Resultados, cortes seriados y reconstrucción. Por otro lado, la muestra de Microfil fijada en formol se sometió a un corte seriado. Las secciones seriadas teñidas se digitalizaron utilizando un escáner de portaobjetos completo y se utilizaron para la reconstrucción del árbol vascular de ambos sistemas.

Se trata de secciones transversales de una pila de secciones seriadas de hígado de ratón antes y después del registro rígido y elástico. Después del registro informático, los sistemas venoso portal y venoso hepático se pueden reconstruir en un solo modelo 3D. Este paso que requiere mucho tiempo de forma manual y computacional necesita una mayor optimización.

El siguiente paso, es decir, la visualización de la distribución espacial de los eventos moleculares con respecto a los árboles vasculares, está actualmente en desarrollo. Este paso puede concebirse como una fusión de la información de la Micro TC derivada del árbol vascular contrastado con la información histológica o como una visualización 3D de la información puramente histológica. En este caso, la información de la micro TC serviría como control de calidad para la exigente reconstrucción 3D basada en histología.

Una vez conseguido, tenemos una herramienta para investigar mejor la regeneración hepática. Especialmente la distribución espacial de los eventos moleculares y el parénquima hepático con respecto a la regeneración vascular.