Name: La visualización del parénquima vascular y la regeneración después del 70% hepatectomía parcial en ratones normales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Aprende a visualizar la regeneración vascular hepática en ratones tras hepatectomía parcial mediante inyección de contraste, micro-CT y reconstrucción 3D. Este flujo de trabajo permite cuantificar el crecimiento vascular.

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Los autores agradecen la financiación del Ministerio de Educación e Investigación de Alemania (BMBF) a través de la red de biología de sistemas "Virtual Liver", los números de subvención 0315743 (ExMI), 0315765 (Reino Unido, Jena), 0315769 (MEVIS). Los autores también agradecen a Frank Schubert por su apoyo técnico.

Los procedimientos que implican sujetos animales han sido aprobados por la Selva de Landesamt für Verbraucherschutz Abteilung und Tiergesundheit Tierschutz, Alemania. Debido a que el sistema venoso portal se visualizó por separado del sistema venoso hepático, se necesitan animales separados para los diferentes árboles vasculares. 1. Reactivos Preparación <ol><li> solución de heparina-solución salina <ol><li> Añadir 0,1 ml de heparina en 10 ml solución salina (5 UI / ml). </li></ol></li><li> mezcla de compuesto de silicona <ol><li> Añadir 2 ml MV-120 en un tubo de 5 ml. Diluir MV-120 mediante la adición de 3 ml de diluyente MV resultante en una solución de 40%. </li></ol></li></ol> 2. Portal venosa Sistema de Inyección de silicona <ol><li> laparotomía <ol><li> Coloque el ratón en la cámara de inducción de la anestesia y anestesiar con isoflurano al 2% y 0,3 L / min de oxígeno. </li><li> Fijar el ratón anestesiado en la mesa de operaciones usando la cinta con la inhalación continua de 2% esoflurane y 0,3 L / min de oxígeno. Controle la convergencia pizca de retirada refleja el ratón y empezar la operación si el reflejo está ausente. </li><li> Hacer una incisión transversal en el abdomen con unas tijeras para la capa de piel y un coagulador eléctrico para la capa muscular. Mover los intestinos hasta el lado izquierdo utilizando puntas de algodón y cubrir los intestinos con solución salina gasa empapada. </li></ol></li><li> La inserción del catéter <ol><li> Diseccionar la vena porta en el microscopio utilizando micro-pinzas. Coloque una sutura de seda 6-0 por debajo de la vena porta extrahepática, en aproximadamente 1 mm de distancia de su bifurcación y atar sin apretar para su uso posterior. </li><li> Inyectar solución preparada heparina-solución salina a través del pene vena (macho) o vena cava inferior (hembra) para la heparinización sistémica para 5 min. </li><li> Inserte el calibre 26 (26 G) del catéter con la aguja en la vena portal y fijarlo con una abrazadera </li></ol></li><li> La heparina-solución salina y el compuesto de silicona de perfusión <ol><li> Cargar heparina-solución salina sollución en una jeringa de 5 ml y se encienda el dispositivo de perfusión. Llenar el catéter completamente con solución salina de heparina para evitar burbujas de aire. </li><li> Conecte el tubo de extensión al catéter y fijarlos firmemente. Iniciar la perfusión de solución salina de heparina con una velocidad de perfusión de 0,4 ml / min. </li><li> sutura pre-colocada Ligar seda 6-0 para la fijación de doble el catéter y bloqueando el flujo de sangre de la vena esplénica y vena mesentérica. Practicar la eutanasia en el ratón por desangrado a través de la perfusión bajo anestesia. </li><li> Enjuague el hígado utilizando solución salina durante todo el proceso de perfusión con el fin de mantenerlo húmedo. </li><li> Añadir 0,1 ml de agente de curado en el tubo MV-120. Cambiar jeringa de heparina-solución salina para jeringa de silicona. </li><li> Iniciar la perfusión de silicona con una velocidad de perfusión de 0,2 ml / min durante aproximadamente 1 min a llenar previamente el sistema de catéter y para llenar el sistema de la vena porta. Detener la perfusión de silicona cuando los vasos en la superficie se vuelven azules. </li></ol></li><li> Muestreo <ol><li> Mantener el hígado in situ until la silicona se polimeriza completamente después de aproximadamente 15 a 30 min. Diseccionar los ligamentos que conectan el hígado y los órganos adyacentes, con cuidado de mantener intacto el hígado. Explante el hígado y lo puso en formalina para su fijación. </li></ol></li></ol> 3. venosa hepática Sistema de Inyección de silicona <ol><li> Realizar una laparotomía como se realizó en el paso 2.1 y exponer campo operatorio totalmente. </li><li> La inserción del catéter <ol><li> Diseccionar la vena porta en el microscopio utilizando micro-pinzas. Coloque una sutura de seda 6-0 por debajo de la vena porta extrahepática, en aproximadamente 1 mm de distancia de su bifurcación y atar sin apretar para su uso posterior. </li><li> Inyectar solución preparada heparina-solución salina a través del pene vena (macho) o vena cava inferior (hembra) para la heparinización sistémica para 5 min. </li><li> Inserte un catéter de 26 G (sonda 1) con la aguja en la vena portal y fijarlo con una abrazadera. Insertar otro catéter de 26 G (sonda 2) con la aguja en la vena cava inferior y fijarlo con una abrazadera. </li><li> Ligar las ramas de la vena cava inferior (incluyendo venas renales izquierda y derecha) y su extremo distal utilizando 6-0 sintético, monofilamento, sutura de polipropileno no absorbible. </li></ol></li><li> La heparina-solución salina y el compuesto de silicona de perfusión <ol><li> Cargar la solución salina de heparina en una jeringa de 5 ml y se encienda el dispositivo de perfusión. Llenar completamente catéter 1 con solución salina de heparina para evitar burbujas de aire. Conecte el tubo de extensión de catéter 1 y fijarlo firmemente. Iniciar la perfusión de heparina-solución salina a una velocidad de 0,4 ml / min. </li><li> sutura pre-colocada Ligar seda 6-0 para la fijación de doble el catéter y bloqueando el flujo de sangre de la vena esplénica y vena mesentérica. Practicar la eutanasia en el ratón por desangrado a través de la perfusión bajo anestesia. </li><li> Enjuague el hígado utilizando solución salina durante todo el proceso de perfusión con el fin de mantenerlo húmedo. Añadir 0,1 ml de agente de curado en el tubo MV-120. Cambio de heparina-solución salina jeringa con la jeringa de silicona. </li><li> Coloque una abrazadera en el suprahepatic vena cava inferior para obstruir el flujo de salida del hígado. </li><li> Conectar el tubo de extensión al catéter 2 y comenzar la perfusión de silicona con una velocidad de perfusión de 0,2 ml / min durante aproximadamente 2 minutos para llegar a un volumen vascular hepática objetivo como se informó. Detener la perfusión de silicona cuando los vasos en la superficie se vuelven azules. </li></ol></li><li> Muestreo <ol><li> Diseccionar ligamentos hepáticos evitando cualquier daño al hígado. Explante el hígado y lo puso en formalina para su fijación. </li></ol></li></ol> 4. Micro-CT (μCT) Escaneo Para analizar la muestra de hígado extirpado usando μCT, son necesarios los siguientes pasos. <ol><li> Tomar la muestra de hígado de la solución de fijación. Coloque el hígado en la cama μCT. Poner la cama μCT con la muestra de hígado en el μCT. </li><li> Adquirir topograma antes de iniciar la exploración. Utilice uno subexploración para la muestra de hígado pequeño y dos subscans para muestras grandes. </li><li> Seleccione un81; protocolo de TC con una alta resolución (por ejemplo, HQD-6565-390-90). Este protocolo adquiere 720 proyecciones con 1.032 x 1.012 píxeles durante una rotación completa con el tiempo de exploración de 90 segundos por exploración secundaria. Iniciar el análisis μCT. </li></ol> 5. Las secciones histológicas seriadas <ol><li> Incrustar la muestra de hígado en parafina en su conjunto después de μCT de exploración. Cortar toda muestra de parafina en secciones 4 micras, lo que resulta en una serie de 2.000 a 2.500 secciones. </li><li> secciones se tiñen con técnicas de tinción adecuada para visualizar los eventos moleculares de interés como Ki-67 como marcador de proliferación y HMGB1 como marcador de daño isquémico. Determinar la secuencia de la tinción con respecto a la pregunta científica. </li><li> Utilizar un escáner de diapositivas para digitalizar toda las secciones teñidas. </li><li> Realizar reconstrucción 3D del árbol (s) vascular (ya sea factible) y visualizar 3D-distribución de los eventos moleculares con respecto al árbol vascular (investigación en curso). </li></ol>

<ol><li>Bearden, S. E., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurovascular+alignment+in+adult+mouse+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Neurovascular alignment in adult mouse skeletal muscles.</a> Microcirculation. 12 (2), 161-167 (2005).</li>
<li>Brown, R. P., Delp, M. D., Lindstedt, S. L., Rhomberg, L. R., Beliles, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+parameter+values+for+physiologically+based+pharmacokinetic+models%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.Ind.Health%22%5BJournal%5D)">Physiological parameter values for physiologically based pharmacokinetic models.</a> Toxicol.Ind.Health. 13 (4), 407-484 (1997).</li>
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<li>Ehling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCL2-dependent+infiltrating+macrophages+promote+angiogenesis+in+progressive+liver+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">CCL2-dependent infiltrating macrophages promote angiogenesis in progressive liver fibrosis.</a> Gut. , (2014).</li>
<li>Ehling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-CT+imaging+of+tumor+angiogenesis%3A+quantitative+measures+describing+micromorphology+and+vascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Am.J.Pathol%22%5BJournal%5D)">Micro-CT imaging of tumor angiogenesis: quantitative measures describing micromorphology and vascularization.</a> Am.J.Pathol. 184 (2), 431-441 (2014).</li>
<li>Ghanavati, S., Yu, L. X., Lerch, J. P., Sled, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perfusion+procedure+for+imaging+of+the+mouse+cerebral+vasculature+by+X-ray+micro-CT%5BTitle%5D)+AND+%22J.Neurosci.Methods%22%5BJournal%5D)">A perfusion procedure for imaging of the mouse cerebral vasculature by X-ray micro-CT.</a> J.Neurosci.Methods. 221, 70-77 (2014).</li>
<li>Gremse, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+microCT-FMT+imaging+and+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.Vis.Exp%22%5BJournal%5D)">Hybrid microCT-FMT imaging and image analysis.</a> J.Vis.Exp. (100), (2015).</li>
<li>Jing, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiomorphometric+quantitative+analysis+of+vasculature+utilizing+micro-computed+tomography+and+vessel+perfusion+in+the+murine+mandible%5BTitle%5D)+AND+%22Craniomaxillofac.Trauma+Reconstr%22%5BJournal%5D)">Radiomorphometric quantitative analysis of vasculature utilizing micro-computed tomography and vessel perfusion in the murine mandible.</a> Craniomaxillofac.Trauma Reconstr. 5 (4), 223-230 (2012).</li>
<li>Melloul, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+animal+magnetic+resonance+imaging%3A+an+efficient+tool+to+assess+liver+volume+and+intrahepatic+vascular+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22J.Surg.Res%22%5BJournal%5D)">Small animal magnetic resonance imaging: an efficient tool to assess liver volume and intrahepatic vascular anatomy.</a> J.Surg.Res. 187 (2), 458-465 (2014).</li>
<li>Schwier, M., Bohler, T., Hahn, H. K., Dahmen, U., Dirsch, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Registration+of+histological+whole+slide+images+guided+by+vessel+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J.Pathol.Inform%22%5BJournal%5D)">Registration of histological whole slide images guided by vessel structures.</a> J.Pathol.Inform. 4 ((Suppl)), 10(2013).</li>
<li>Selle, D., Preim, B., Schenk, A., Peitgen, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+vasculature+for+liver+surgical+planning%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.Med.Imaging%22%5BJournal%5D)">Analysis of vasculature for liver surgical planning.</a> IEEE Trans.Med.Imaging. 21 (11), 1344-1357 (2002).</li>
<li>Shergill, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+of+VEGF-+and+NO-dependent+angiogenesis+does+not+impair+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Am.J.Physiol+Regul.Integr.Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of of VEGF- and NO-dependent angiogenesis does not impair liver regeneration.</a> Am.J.Physiol Regul.Integr.Comp Physiol. 298 (5), 1279-1287 (2010).</li>
<li>Sueyoshi, R., Ralls, M. W., Teitelbaum, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucagon-like+peptide+2+increases+efficacy+of+distraction+enterogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.Surg.Res%22%5BJournal%5D)">Glucagon-like peptide 2 increases efficacy of distraction enterogenesis.</a> J.Surg.Res. 184 (1), 365-373 (2013).</li>
<li>Wei, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+and+imaging+techniques+to+study+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.Surg.Res%22%5BJournal%5D)">Rodent models and imaging techniques to study liver regeneration.</a> Eur.Surg.Res. 54 (3-4), 97-113 (2015).</li>
<li>Xie, C., Wei, W., Zhang, T., Dirsch, O., Dahmen, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+systemic+and+hepatic+hemodynamic+parameters+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.Vis.Exp%22%5BJournal%5D)">Monitoring of systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice.</a> J.Vis.Exp. (92), e51955(2014).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Contrastando el árbol vascular mediante la inyección de silicona y de exploración μCT se ha introducido en modelos de tumores y modelos de enfermedades neurológicas con frecuencia para estudiar la progresión angiogénico 5,7,8,10. Las mejoras en la metodología de la inyección de silicona se hicieron en el presente estudio para visualizar y cuantificar el crecimiento vascular después de la hepatectomía parcial en ratones. Hay una serie de pasos críticos que requieren atención para l...

La regeneración hepática es a menudo determinado midiendo el aumento de peso del hígado y el volumen y mediante la evaluación de la tasa de proliferación de hepatocitos 16. Sin embargo, la regeneración del hígado no sólo es la inducción de la regeneración del parénquima sino también la regeneración vascular 6. Por lo tanto, el crecimiento vascular debe investigarse más con respecto a su papel en la progresión de la regeneración del hígado. Visualización del sistema vascular hepática es fundamental para avanzar en nuestra comprensión de la regeneración vascular. Numerosos métodos indirectos se han desarrollado para estudiar los mecanismos moleculares subyacentes de la regeneración vascular hepática. Tradicionalmente, la detección de citoquinas (factor de crecimiento endotelial vascular, VEGF) 14, quimiocinas y sus receptores (CXCR4 / cxcr7 / CXCL12) 4 han sido el pilar para el estudio de la regeneración vascular. Sin embargo, un modelo 3D junto con el análisis cuantitativo de la vasculatura añadiría anatómico críticoinformación para obtener una mejor comprensión de la relación importante entre el parénquima hepático y la regeneración vascular. Para visualizar el sistema vascular hepática, lo que requiere de contraste los árboles vasculares, los ratones fueron inyectados con un agente de contraste de caucho de silicona radiopaca directamente en el portal o árbol vascular venosa hepática. Después de la polimerización de la silicona y la explantación del órgano, las muestras de hígado se sometieron a μCT escaneado con un escáner CT. Las exploraciones dieron lugar a representaciones de imágenes voxel de la silicona de inyección de especímenes 9. Para el control de calidad, el sistema vascular se visualizó primero en 3D utilizando software preclínica. La segmentación se realizó mediante el establecimiento de un umbral entre la intensidad de los tejidos blandos y la intensidad del vaso. La máscara buque resultante se visualizan mediante la representación de superficie. El software también permite la determinación manual de los dos parámetros de vascular el crecimiento: la longitud máxima de los vasos y el radio. Después se usó una software preclínico para reconstrucción 3D de árboles vasculares y posterior cálculo de los territorios vasculares que suministran o de drenaje 13. Además, este software determina automáticamente ciertos parámetros de crecimiento vascular, como la longitud total de todas las estructuras vasculares visibles también conocidos como la longitud del borde, total o volumen total del vaso. El procedimiento de perfusión de silicona se realizó en ratones ingenuos y en ratones que se sometieron a 70% de la hepatectomía parcial (PH). Los hígados se recogieron a diferentes puntos de tiempo de observación después de la resección para el análisis vascular y parenquimatoso regeneración hepática mediante la técnica de la visualización y la cuantificación antes mencionada. Los objetivos principales de esta película son los siguientes: (1) demostrar la delicada técnica de inyección requerida para lograr contraste óptimo y (2) muestran el potencial beneficio resultante from un análisis detallado de la muestra de resultantes utilizando μCT y de serie de secciones histológicas. Después de ver esta película, el lector debe tener una mejor comprensión de cómo inyectar compuesto de silicona en un sistema vascular específico y de la utilidad y aplicabilidad de la técnica.

<table><tbody><tr><td>PERFUSOR&reg; VI</td><td>B.BRAUN</td><td>87 222/0</td><td></td></tr><tr><td>Pipetus&reg;-akku</td><td>Hirschmann</td><td>9907200</td><td></td></tr><tr><td>Pipets</td><td>Greiner</td><td>606180</td><td></td></tr><tr><td>micro tijeras</td><td>Fine Science Tools (F&middot; S&middot; L)</td><td>No. 14058-09</td><td></td></tr><tr><td>micro serrefine</td><td>Fine Science Tools (F&middot; S&middot; L)</td> <td>No.18055-05</td><td></td></tr><tr><td>Micro abrazaderas aplicador Fine</td><td>Science Tools (F & middot; S&middot; L)</td><td>No. 18057-14</td><td></td></tr><tr><td>Micro pinzas rectas</td><td>Fine Science Tools (F&middot; S&middot; L)</td><td>No. 00632-11</td><td></td></tr><tr><td>Micro pinzas curvas</td><td>Fine Science Tools (F&middot; S&middot; L)</td><td>Nº 00649-11</td><td></td></tr><tr><td>portaagujas</td><td>Fine Science Tools (F&middot; S&middot; L)</td><td>Nº 12061-01</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 1 ml</td><td>B.Braun</td><td>9161406V</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 5 ml</td><td>B.Braun</td><td>4606051V</td><td></td></tr><tr>líneas de<td>extensión y conexión</td><td>B.Braun</td><td>4256000</td><td>30 cm, interior &oslash; 1,2 mm</td></tr><tr><td>6-0 seda (Perma-Hand Seide)</td><td>Ethicon</td><td>639H</td><td></td></tr><tr><td>6-0 prolene</td><td>Ethicon</td><td>8711H</td><td></td></tr><tr><td>Microfil&reg; diluyente MV</td><td>FLOW TECH, INC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microfil&reg; MV - 120</td><td>FLOW TECH, INC</td><td>MV - 120 (azul)</td><td></td></tr><tr><td>MV agente de curado</td><td>FLOW TECH, INC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heparina 2500 I.E./5 ml</td><td>Rotexmedica</td><td>ETI3L318-15</td><td></td></tr><tr><td>Salina</td><td>Fresenius Kabi Deutschland GmbH</td><td>E15117/D DE</td> Imalytics Software preclínico Imágenes moleculares experimentales, RWTH Universidad de <td></td></tr><tr><td></td><td>Aquisgrán, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HepaVision</td><td>Fraunhofer MEVIS, Bremen, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoZoomer 2.0-HT&nbsp; Escáner digital de diapositivas</td><td>Hamamatsu Electronic Press, Japón&nbsp;</td><td>Tomoscopio C9600</td><td></td></tr><tr><td>Duo CT&nbsp;</td><td>CT Imaging GmbH, Erlangen, Alemania</td><td>TomoScope&reg; &nbsp; Sinergia</td><td></td></tr></tbody></table>

la visualización del parénquima vascular y la regeneración después del 70% hepatectomía parcial en ratones normales

Visualization of Vascular and Parenchymal Regeneration after 70% Partial Hepatectomy in Normal Mice

Un procedimiento de inyección de silicona modificado se utiliza para la visualización del árbol vascular hepática. Este procedimiento consistía en la inyección in vivo del compuesto de silicona, a través de un catéter 26 G, en el portal o vena hepática. Después de la inyección de silicona, los órganos fueron explantados y se prepararon para micro-TC ex-vivo (μCT). El procedimiento de inyección de silicona es un desafío técnico. El logro de un resultado exitoso requiere una amplia experiencia microquirúrgica del cirujano. Uno de los retos de este procedimiento consiste en la determinación de la tasa de perfusión adecuada para el compuesto de silicona. La tasa de perfusión para el compuesto de silicona tiene que ser definido en base a la hemodinámica del sistema vascular de interés. tasa de perfusión inadecuada puede dar lugar a una perfusión incompleta, la dilatación artificial y rotura de árboles vasculares. La reconstrucción 3D del sistema vascular se basa en la TC y se logró utilizandosoftware preclínica como HepaVision. La calidad del árbol vascular reconstruida estaba directamente relacionada con la calidad de la perfusión de silicona. Posteriormente parámetros vasculares calculadas indicativas de crecimiento vascular, como el volumen vascular total, se calculan en base a las reconstrucciones vasculares. Contrastando el árbol vascular con silicona permitido para la posterior elaboración histológico de la muestra después de μCT de exploración. El espécimen se pueden someter a seccionamiento en serie, el análisis histológico y el escaneo de diapositivas conjunto, y, posteriormente, a la reconstrucción 3D de los árboles vasculares a partir de imágenes histológicas. Este es el requisito previo para la detección de eventos moleculares y su distribución con respecto al árbol vascular. Este procedimiento de inyección de silicona modificada también se puede utilizar para visualizar y reconstruir los sistemas vasculares de otros órganos. Esta técnica tiene el potencial de ser aplicado ampliamente para estudios en relación con la anatomía vascular y crecimiento en varios animales unamodelos de enfermedad de Newcastle.

Criterios de calidad La calidad de la inyección de silicona puede ser juzgado a simple vista durante el procedimiento. Los pequeños vasos en la superficie del hígado llenan gradualmente con el compuesto azul. Si se observa la estructura vascular normal en la superficie del hígado, la calidad de la inyección de caucho de silicona era bueno. Si el volumen de perfusión fue insuficiente, los pequeños vasos en la s...

Las herramientas utilizadas para visualizar la regeneración vascular requieren métodos para contrastar los árboles vasculares. Esta película demostró una delicada técnica de inyección utilizada para lograr un contraste óptimo de los árboles vasculares e ilustra los beneficios potenciales resultantes de un análisis detallado de la muestra resultante utilizando μCT y secciones histológicas seriadas.

La visualización del parénquima vascular y la regeneración después del 70% hepatectomía parcial en ratones normales

A modified silicone injection procedure was used for visualization of the hepatic vascular tree. This procedure consisted of in-vivo injection of the ...

Visualización de la regeneración vascular y del parénquima tras una hepatectomía parcial del 70 % en ratones normales. Tradicionalmente, la regeneración hepática se evalúa midiendo el aumento del peso y del volumen del hígado, así como determinando la tasa de proliferación de los hepatocitos. En la actualidad, estamos interesados en la regeneración vascular del hígado en ratones y deseamos visualizar y cuantificar el crecimiento vascular.Por lo tanto, establecemos el flujo de trabajo para la obtención de imágenes de la regeneración vascular. El flujo de trabajo consta de cuatro pasos: contraste del árbol vascular, adquisición de escáneres de TC, reconstrucción 3D y análisis cuantitativo y cualitativo de las imágenes resultantes. El flujo de trabajo comienza con el contraste del árbol vascular.Primero exponemos el hígado, ya sea normal o resecado, y luego inyectamos el compuesto de contraste de silicona polimerizable en la vena porta o en la vena hepática, dependiendo del sistema vascular de interés. A continuación, los hígados extraídos se someten a un escaneo en un MicroCT. Tras el escaneo, realizamos una reconstrucción vascular 3D utilizando el software preclínico Imalytics.Si la calidad técnica de las imágenes resultantes es suficientemente buena, se puede realizar la reconstrucción 3D utilizando HepaVision. Este programa se utiliza en clínicas para planificar cirugías hepatobiliares. Además de la visualización 3D del árbol vascular, este programa permite la visualización y el cálculo del volumen hepático, del hígado total y de cada lóbulo, basándose en los vasos de aporte y de drenaje.Después de la reconstrucción, podemos determinar parámetros adicionales indicativos del crecimiento vascular, como la longitud y el diámetro de un vaso específico, con la ayuda de técnicas computacionales. Esto permitirá una descripción cuantitativa del crecimiento vascular. Por otro lado, las muestras de Microfil fijadas en formalina pueden cortarse en secciones seriadas.Las secciones seriadas pueden teñirse y digitalizarse utilizando un escáner de portaobjetos completo. Después del registro rígido y elástico de las secciones seriadas, se pueden reconstruir los árboles vasculares tridimensionales de ambos sistemas, venoso portal y venoso hepático. En una etapa futura, queremos explorar la distribución espacial de los eventos moleculares.Un ejemplo de un evento molecular de interés en la regeneración hepática es la aparición del marcador de proliferación Ki-67 en los núcleos de los hepatocitos y su distribución espacial en los árboles vasculares reconstruidos en 3D. A continuación, vamos a dar una introducción detallada sobre cómo realizar la inyección de Microfil. Preparación de los reactivos.Para la mezcla compuesta de Microfil, necesitamos diluyente MV, compuesto MV, en nuestro caso, el azul MV-120, y agente de curado. También necesitamos pipetas, tubo y un pipeteador. Prepare dos mililitros de MV-120 en un tubo de cinco mililitros.Luego, dilúyalo agregando tres mililitros de diluyente MV. Mézclelos agitando suavemente. Para la solución salina con heparina, agregue 1 mililitro de heparina a 10 mililitros de solución salina.Preparación de la mesa de operaciones. Primero, necesitamos un microscopio; segundo, se necesita un conjunto de materiales desechables: suturas de seda 6-0 y de polipropileno 6-0, jeringas de cinco mililitros y de un mililitro, agujas de calibre 30 y de calibre 21, tubo de extensión para conectar la jeringa y el catéter, catéter de calibre 26 con aguja de inserción, punteros de algodón y gasa.En tercer lugar, se necesitan instrumentos quirúrgicos. Microinstrumentos, pinzas y electrocoagulador. En cuarto lugar, se requiere una bomba de perfusión.Preparación del animal. Coloque el ratón en la cámara de inducción de anestesia y anestesie al ratón con 2% de isoflurano y 0,3 mililitros por minuto de oxígeno. Fije al ratón anestesiado sobre la mesa de operaciones utilizando cintas, con inhalación continua de 2% de isoflurano y 0,3 mililitros por minuto de oxígeno.Inyección de microfil, sistema venoso portal. Realice una incisión transversal en el abdomen utilizando tijeras para la capa de piel y un coagulador eléctrico para la capa muscular. Desplace los intestinos hacia el lado izquierdo utilizando hisopos de algodón y cúbralos con gasa empapada en solución salina.Disecar la vena porta bajo el microscopio. Colocar una sutura de seda 6-0 debajo de la vena porta extrahepática a una distancia aproximada de un milímetro de su bifurcación. Anudarla de forma suelta para su uso posterior.Injecte la solución salina con heparina mediante una vena peniana para lograr una heparinización sistémica durante cinco minutos. Esta animación demostrará el procedimiento de inserción del catéter. Primero, coloque el hilo de sutura de seda 6-0 debajo de la vena porta extrahepática, luego inserte el catéter de calibre 26 en la vena porta y fíjelo utilizando una pinza.Suture la sutura previamente colocada para fijar el catéter y bloquear el flujo sanguíneo de la vena esplénica y la vena mesentérica. Aquí demostraremos el procedimiento quirúrgico. Inserte el catéter de 26 gauge con aguja.Inserte el catéter más profundamente y retire lentamente la aguja al mismo tiempo. Fije el catéter utilizando una pinza. Llene completamente el catéter con solución salina heparinizada para evitar burbujas de aire.Conecte el tubo de extensión al catéter y fíjelos firmemente. Encienda la bomba de perfusión. Comience la perfusión de solución salina con heparina a un flujo de 0,4 mililitros por minuto.Observe cómo los lóbulos derechos se vuelven pálidos inmediatamente después de la perfusión. Enjuague el hígado utilizando suero salino para mantenerlo húmedo durante todo el procedimiento de perfusión. Eutanalice al ratón mediante exsanguinación a través de la perfusión bajo anestesia.Continúe la perfusión con heparina durante varios minutos hasta que todo el hígado se vuelva pálido. Antes de la perfusión con Microfil, agregue 0,1 mililitro de agente de curado al compuesto de Microfil preparado para acelerar el procedimiento de polimerización. Cargue el compuesto de Microfil en una jeringa de cinco mililitros y en un tubo de extensión.Elimine las burbujas de aire inyectando la solución de heparina salina en el catéter, de la misma manera que antes. Conecte el tubo al catéter y fíjelo firmemente. Comience la inyección de Microfil con un flujo de 0,2 mililitros por minuto durante aproximadamente uno a dos minutos.Observe cómo el agente azul se extiende lentamente hacia las ramas de la vena porta. Detenga la perfusión cuando la estructura vascular azul aparezca en la superficie de cada lóbulo hepático, como se indica con un círculo rojo. Deje el hígado durante al menos 15 minutos para la polimerización del compuesto Microfil.Inyección de microfil, sistema venoso hepático. El procedimiento sigue básicamente los mismos pasos que la inyección en el sistema venoso portal. Coloque una sutura de seda 6-0 debajo de la vena porta extrahepática a una distancia aproximada de un milímetro de su bifurcación.Luego inserte un catéter en la vena porta y fíjelo mediante una pinza. Inserte otro catéter en la vena cava inferior y fíjelo también con una pinza. Ligue el hilo previamente colocado para fijar el catéter y bloquear el flujo sanguíneo proveniente de la vena esplénica y de la vena mesentérica.Coloque una pinza en la vena cava inferior suprahepática para obstruir el flujo de salida del hígado. Ligue las ramas de la vena cava inferior, incluyendo ambas venas renales y el extremo distal de la vena cava inferior. Lave el hígado utilizando solución salina con heparina a través del catéter uno.Perfusión del sistema venoso hepático con el compuesto Microfil mediante el catéter dos. Resultados, reconstrucción de micro-TC. Obtuvimos reconstrucciones vasculares 3D utilizando el software preclínico Imalytics tras el escaneo de micro-TC.La regeneración vascular en ambos sistemas venosos, portal y hepático, se manifestó como un alargamiento y ensanchamiento de las estructuras vasculares principales en combinación con la ramificación de vasos más pequeños. En el segundo día postoperatorio, los árboles vasculares de los lóbulos remanentes se alargaron. Para el séptimo día postoperatorio, se hicieron visibles ramas adicionales más pequeñas provenientes de la misma vena porta principal y de la vena hepática.Resultados, reconstrucción tridimensional codificada por colores del árbol vascular hepático y de los territorios hepáticos dependientes. Cada lóbulo hepático se visualizó fácilmente en las tres dimensiones tras la reconstrucción codificada por colores mediante HepaVision. Como se indica en la tabla, se determinaron los volúmenes hepáticos del hígado total y de cada lóbulo, como se muestra aquí, para el sistema venoso hepático de un hígado normal.Resultados, cortes seriados y reconstrucción. Por otro lado, la muestra de Microfil fijada en formalina se sometió a corte seriado. Los cortes seriados teñidos se digitalizaron utilizando un escáner de portaobjetos completo y se utilizaron para la reconstrucción del árbol vascular de ambos sistemas.Estas son secciones transversales de una serie de cortes seriados de hígado de ratón antes y después del registro rígido y elástico. Después del registro por computadora, los sistemas venoso portal y venoso hepático pueden reconstruirse en un único modelo 3D. Esta etapa, que requiere mucho tiempo tanto manual como computacionalmente, necesita una mayor optimización.El siguiente paso, es decir, la visualización de la distribución espacial de los eventos moleculares con respecto a los árboles vasculares, se encuentra actualmente en desarrollo. Este paso puede concebirse como una fusión de la información de micro-TC obtenida a partir del árbol vascular contrastado con información histológica, o como una visualización tridimensional de información puramente histológica. En este caso, la información de micro-TC serviría como control de calidad para la reconstrucción tridimensional basada en histología, que es un procedimiento exigente.Una vez logrado, disponemos de una herramienta para investigar mejor la regeneración hepática, especialmente la distribución espacial de los eventos moleculares y del parénquima hepático en relación con la regeneración vascular.

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Investigación

JoVE Journal

Medicine

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Hemos descrito un protocolo para la realización de hepatectomía parcial (PHx) y trasplante de la célula vía bazo en cabeceo. SCID (CABECEO. CB17-Prkdcscid/j) ratones. En este protocolo, se realiza una incisión para exponer y resecar el lóbulo izquierdo del hígado, seguido por otra incisión para el intrasplenic trasplante de células.

Intrasplenic trasplante de hepatocitos después de Hepatectomy parcial en cabeceo. Ratones de SCID

Aquí, presentamos un nuevo método para la resección parcial del lóbulo izquierdo hepático en ratones neonatales (día 0). Este nuevo protocolo es adecuado para el estudio de la lesión del higado aguda y la respuesta de lesiones en el ámbito neonatal.

Hepatectomía parcial lobulado: Un modelo quirúrgico para regeneración hepática morfológico

Establecemos una novedosa técnica quirúrgica para un modelo de perfusión en vivo solo lóbulo hepático de rata como requisito previo para el estudio adicional en vivo hígado parcial en el futuro de la ingeniería.

Una novedosa técnica quirúrgica como base para In Vivo parcial ingeniería hígado de rata

Este protocolo describe el procedimiento para eliminar el lóbulo ventral del hígado en el pez cebra adulto para permitir el estudio de la regeneración hepática.

Hepatectomía parcial en pez cebra adulto

Los hepatocitos cargados de lípidos son inherentes a la regeneración hepática, pero generalmente se pierden con la centrifugación por gradiente de densidad. Aquí, presentamos un protocolo de aislamiento celular optimizado que retiene hepatocitos esteatósicos, produciendo poblaciones representativas de hepatocitos regeneradores después de la hepatectomía parcial en ratones.

Aislamiento de hepatocitos regeneradores después de hepatectomía parcial en ratones

En este protocolo, discutimos la implementación de un modelo de trasplante hepático ortotópico (OLT) exitoso en ratones. Además, también se discuten los adyuvantes para analizar más a fondo la permeabilidad del aloinjerto después de una OLT exitosa en un ratón, específicamente utilizando exploraciones de microtomografía computarizada (microCT).

Trasplante hepático ortotópico exitoso en ratones mediante angiografía por microtomografía computarizada

Se ha demostrado que la asociación de la partición hepática y la ligadura de la vena porta para la hepatectomía por etapas (ALPPS) da lugar a una regeneración hepática notable después de varias semanas después de la cirugía de primera etapa. Se han desarrollado modelos animales que se han sometido a ALPPS para explorar la posible capacidad de regeneración hepática y lograr resultados clínicos favorables.

Un modelo de ratón de la partición hepática asociada y la ligadura de la vena porta para el procedimiento de hepatectomía por etapas con ayuda de microscopía

Este protocolo proporciona información técnica para la reconstrucción de vasos mediante la técnica del manguito en el trasplante hepático ortotópico de ratón.

Reconstrucción vascular con la técnica del manguito en el trasplante hepático ortotópico de ratón

Los organoides generados a partir de los tumores de los pacientes se inyectan ortotópicamente en el hígado del ratón. La resección del tejido hepático no tumoral conduce a un entorno regenerativo en el tejido hepático donde se encuentra el tumor.

Un modelo de xenoinjerto de organoide derivado de pacientes con cáncer hepatocelular para investigar el impacto de la regeneración hepática en el crecimiento tumoral

El modelo murino de hepatectomía parcial 2/3 (66%) está bien descrito en la literatura, pero rara vez se han utilizado hepatectomías más extendidas que imitan el síndrome de tamaño pequeño después del trasplante hepático. Describimos un procedimiento de hepatectomía extendida del 78% en un modelo de ratón que resulta en aproximadamente un 50% de letalidad postoperatoria en ratones sanos.

Hepatectomía extendida al 78% en un modelo quirúrgico de ratón

Este protocolo presenta una cadena de imagen completa para visualizar y modelar la morfología de las células estrelladas hepáticas en tejido hepático intacto. Este enfoque combina marcaje fluorescente de fibroblastos usando genética de ratón, preparación tisular in situ basada en perfusión hepática y un método modificado de limpieza de tejidos iDISCO para lograr transparencia óptica.

Mapeo de la morfología de las células estrelladas hepáticas en modelos murinos de fibrosis hepática

Aprende a visualizar la regeneración vascular hepática en ratones tras hepatectomía parcial mediante inyección de contraste, micro-CT y reconstrucción 3D. Este flujo de trabajo permite cuantificar el crecimiento vascular.

La visualización del parénquima vascular y la regeneración después del 70% hepatectomía parcial en ratones normales

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