Correlativa Microscopia óptica y electrónica para estudiar las interacciones microgliales con placas de beta-amiloide

El objetivo general de este procedimiento es identificar placas de beta-amiloide en secciones del cerebro de modelos de ratones con enfermedad de Alzheimer antes de la inmunotinción previa y el procesamiento de tejidos para la microscopía electrónica. Este método puede ayudar a responder a las preguntas clave en el campo de la neuroinmunología, como la interacción de la célula microglial con la sinapsis cerca de los diagramas de beta amiloide. La principal ventaja de esta técnica es que permite preseleccionar secciones de tejido cerebral que contienen diagramas de beta amiloide en las regiones y capas de interés.

Aunque este método se puede aplicar a la enfermedad de Alzheimer, también se puede aplicar a cualquier otra enfermedad o tejido donde la amiloidosis esté presente. Primero, prepare una solución de cinco miligramos por mililitro de compuesto metoxi X04. Usando una balanza microscópica, pesa cinco miligramos de metoxi X04.

Bajo una campana extractora, disuelva el metoxi X04 en 100 microlitros de DMSO y revuelva hasta obtener una solución clara y verdosa. Agregue sucesivamente 450 microlitros de propilenglicol y 450 microlitros de solución salina tamponada con fosfato mientras revuelve. Mantenga la solución mezclando a cuatro grados centígrados durante la noche.

Al día siguiente, se debe ver una emulsión de color verde amarillento. Después de inyectar metoxi X04, agregar una dosis de 10 miligramos por kilogramo de peso corporal y sacrificar al animal en el punto de tiempo deseado de acuerdo con los métodos aprobados, lavar el cerebro fijado con paraormaldehído tres veces con PBS enfriado. Luego, con una cuchilla de afeitar afilada, retire el bulbo olfativo y corte el cerebro coronalmente en dos o tres piezas de aproximadamente la misma altura, todas las cuales se pueden seccionar simultáneamente para acelerar el procedimiento.

Pegue los trozos de tejido cerebral en la placa de muestra asegurada en la bandeja. Asegúrese de que la superficie de corte lisa se adhiera firmemente a la placa de muestra. Agregue la solución de PBS a la bandeja hasta que toda la superficie del cerebro esté completamente sumergida.

Coloque la bandeja en el vibratomo y ajuste la configuración del vibratomo para producir secciones de 50 micras de grosor. Comience a cortar y, si se trata de una criba, transfiera inmediatamente las secciones a PBS con un pincel fino. Alternativamente, las secciones se pueden colocar en viales de vidrio que contienen solución crioprotegida para su almacenamiento a 20 grados centígrados.

Con la ayuda de un atlas estereotáxico del cerebro de ratón, seleccione secciones del cerebro que contengan la región de interés y coloque cada sección en crioprotector en un pocillo de una placa de cultivo de 24 pocillos. A continuación, utilice una pipeta desechable para añadir una gota de PBS en un portaobjetos de microscopio y, a continuación, coloque la sección sobre la gota. Examine la sección bajo un microscopio fluorescente para identificar las regiones que contienen placas a-beta marcadas con metoxi X04.

Sin mover la platina del microscopio, capture imágenes de las regiones de interés en campo claro, así como en modo de fluorescencia. Cada imagen debe mostrar la misma región en ambos campos para correlacionar la placa con la región estructural de la sección de tejido. Guarde y asigne un nombre a las imágenes tomadas de acuerdo con el número de animal.

También registre el número de pocillo en la placa y el campo de las fotografías tomadas. Vuelva a colocar la sección en el pocillo designado una vez que se hayan completado las imágenes. Examine la siguiente sección de la secuencia utilizando el mismo procedimiento para evitar secar las secciones.

Para alinear las imágenes, abra las imágenes de campo claro y de campo UV para obtener el mismo ROI en ImageJ. A continuación, utiliza el plugin MosaicJ para alinear los bordes de las dos imágenes. Guarde la imagen alineada y combinada de acuerdo con el número de pozo en una carpeta con el número del animal en particular.

Combine las imágenes de diferentes secciones del mismo animal para identificar y localizar las placas en la región de interés. Una vez completado el proceso de cribado, almacene las secciones examinadas a 20 grados centígrados en una placa de cultivo de 24 pocillos que contiene crioprotector hasta que se lleve a cabo la inmunotinción o el procesamiento posterior. Primero, prepare una solución de tetróxido de osmio al 1% en tampón de fosfato en un vial de vidrio.

Como el tetróxido de osmio es fotosensible, cubra el frasco de vidrio con papel de aluminio para proteger la solución de la luz. Después de lavar en tampón de fosfato, retire el tampón de las secciones y extiéndalas con un pincel fino. Asegúrese de aplanar las secciones inmediatamente antes de agregar tetróxido de osmio, ya que cualquier pliegue en las secciones se volverá permanente y tratar de aplanar el tejido después de la fijación del osmio solo romperá las secciones.

Utilice una pipeta de transferencia para añadir tetróxido de osmio a las secciones, gota a gota, hasta que la sección esté sumergida. Cubra el pocillo con papel de aluminio para proteger las secciones de la luz e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente. Durante esta incubación, prepare resina plástica en un vaso de precipitados desechable.

Combine los componentes en orden y mezcle bien con una pipeta serológica de 10 mililitros hasta obtener un color uniforme. Transfiera la mezcla preparada a platos de pesaje de aluminio. Estos recibirán las secciones de tejido una vez que se hayan deshidratado.

Una vez transcurrido el tiempo de incubación, deshidratar las secciones en concentraciones crecientes de etanol durante dos minutos cada una. Transfiera las secciones deshidratadas de la placa de cultivo de 24 pocillos a viales de vidrio de 20 mililitros. A continuación, sumerja las secciones en óxido de propileno tres veces durante dos minutos cada vez para eliminar el etanol residual.

A continuación, utilice una punta de pipeta de vidrio doblada o un pincel fino para transferir las secciones de la solución de óxido de propileno a la resina plástica y déjela toda la noche para que se infiltre a temperatura ambiente. Después de la infiltración, coloque los platos de pesaje de aluminio que contienen las muestras en un horno de 50 a 60 grados centígrados durante 10 a 15 minutos. Para incrustar secciones en láminas de película de policlorotrifluoroetileno, primero use un pincel fino para pintar una capa delgada de resina sobre la sección.

Luego, mueva una sección de tejido a la vez desde un plato de pesaje de aluminio hasta la lámina de película PCTFE. Retire el exceso de resina alrededor del tejido, teniendo cuidado de no alterarlo. Después de mover todas las secciones de un plato de pesaje a la hoja de película de PCTFE, coloque una segunda hoja de PCTFE sobre la primera creando un sándwich de tejido y resina entre las dos hojas.

Polimerizar la resina en una incubadora durante tres días a 55 a 60 grados centígrados. A continuación, el tejido está listo para el corte ultrafino y el examen ultraestructural. Las siguientes imágenes muestran imágenes duales de una sección del hipocampo utilizando los modos de campo claro y fluorescencia.

Las regiones y capas de interés se visualizan en campo claro. Mientras que las placas a-beta se localizan con éxito utilizando un filtro UV en un rango de 340 a 380 nanómetros. Esta imagen muestra una sección del hipocampo antes de la inmunotinción previa para IBA1.

Una placa visible está delineada por la línea de puntos. Esta imagen muestra la misma sección después de la inmunotinción previa para IBA1 y el procesamiento para la microscopía electrónica de transmisión. Tenga en cuenta que la placa rodeada por una línea de puntos todavía es visible en el procesamiento de tejidos para microscopía electrónica.

Una vez dominado, este protocolo se puede completar en una semana si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que cada paso debe realizarse rigurosamente para reducir la probabilidad de contaminación y otros degradados estructurales que afectarán la calidad de las muestras. No olvide que trabajar con osmio puede ser extremadamente peligroso, por lo que siempre debe tomar precauciones, como usar una bata de laboratorio y guantes mientras realiza este procedimiento.

Asegúrese de desechar después de usarlo al final de su experimento de acuerdo con las pautas de su instalación.