Come studiare membrana basale Rigidità come biofisica trigger nel cancro alla prostata e altre patologie legate all'età o malattie metaboliche

L'obiettivo generale di questo modello è studiare in che modo la rigidità e lo spessore della membrana basale, causati dalla glicosilazione avanzata e dall'esposizione a prodotti correlati, possano modulare il comportamento invasivo delle cellule corrispondenti alle fasi iniziali e avanzate del cancro alla prostata metastatico. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle patologie legate all'invecchiamento, ad esempio come l'aumento della rigidità e dello spessore della membrana basale contribuisca alla progressione tumorale e a disturbi metabolici come il diabete.

Il principale vantaggio di questa tecnica è che fornisce un metodo semplice per riprodurre il livello di rigidità misurato nei tumori della prostata umana in ambito clinico. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia e alla diagnosi del cancro alla prostata, migliorando la comprensione di come la rigidità della membrana basale promuova cambiamenti molecolari e cellulari. Le persone alle prime esperienze con questo metodo potrebbero incontrare difficoltà, poiché il modello è multidisciplinare.

Combinazione di tecniche provenienti dai campi della chimica, della fisica e della biologia. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo ipotizzato che la rigidità della membrana basale nella ghiandola prostatica possa promuovere un comportamento invasivo *de novo* in cellule epiteliali trasformate note. La dimostrazione video di questo metodo è fondamentale, poiché è necessario descrivere passaggi interdisciplinari.

Inclusione del reticolo incrociato della membrana basale, seguito da coltura cellulare tridimensionale. Iniziare preparando una superficie uniforme di ghiaccio e utilizzarla per raffreddare una piastra in vetro con otto camere a quattro gradi Celsius. Successivamente, tagliare l'estremità di una punta per pipetta da 200 microlitri e raffreddare anche la punta a quattro gradi Celsius.

Dopo averlo raffreddato, posizionare la punta su un ausilio per pipettatura da 200 microlitri e utilizzarlo per trasferire 40 microlitri di soluzione di matrice BM ghiacciata in ciascun pozzetto della camera in vetro da otto pozzetti pre-raffreddata. Quindi, posizionare la camera in vetro a 37 gradi Celsius per 30 minuti per favorire la polimerizzazione della membrana basale.

Chiudere con molta attenzione la porta dell'incubatrice per evitare di disturbare il reagente liquido di membrana basale ricostruita. Dopo esattamente 30 minuti, aggiungere 250 microlitri di una soluzione di glicolaldeide preparata per ricoprire la membrana basale ricostruita polimerizzata. Successivamente, preparare un controllo negativo aggiungendo 250 microlitri di PDS sterile a un gel di membrana basale ricostruita nativa.

Inoltre, preparare due controlli aggiuntivi aggiungendo alla soluzione di glicolaldeide rispettivamente 50 millimoli di cianoboroidrato di sodio oppure 250 millimoli di aminoguanidina, prima di aggiungere la soluzione al gel della membrana basale. Quindi, incubare i gel a 37 gradi Celsius per sei ore per ottenere un gel semi-rigido oppure per 14 ore per ottenere un gel rigido.

Dopo l'incubazione, rimuovere con attenzione le soluzioni dai gel e aggiungere 250 microlitri di glicina etilestere uno molare a ciascun gel. Incubarli a 37 gradi Celsius per un'ora. Lavare ogni gel 10 volte in 500 microlitri di PBS per rimuovere ogni traccia della soluzione di glicolaldeide e del glicina etilestere.

Quindi aggiungere 400 microlitri di PBS per prevenire la disidratazione e incubare le membrane basali ricostituite tutta la notte a 37 gradi Celsius. Quando si è pronti per proseguire, rimuovere il PBS dalle membrane basali ricostituite e aggiungere 250 microlitri di acqua distillata doppia fredda a ogni pozzetto. Incubare i gel a quattro gradi Celsius per 16-24 ore per assicurare che la matrice sia completamente liquefatta.

Quindi trasferire la membrana basale liquefatta in una provetta da 1,5 millilitri e misurare l'emissione fluorescente della soluzione utilizzando uno spettrofotometro. Successivamente centrifugare la soluzione ed eliminare il soprannatante ottenuto. Ri-sospendere il pellet in 500 microlitri di una soluzione contenente 20 milligrammi per millilitro di bromuro di cianogeno e acido formico al 70%.

Incubare i campioni tutta la notte a temperatura ambiente. Successivamente, utilizzare una siringa monouso da un millilitro per trasferire il gel della membrana basale ri-sospeso in una cassetta per dialisi con un cutoff di peso molecolare di 3,5 chilodalton. Immergere la cassetta in un becher di vetro da 500 millilitri contenente 500 millilitri di acqua doppio-distillata.

E agitare l'acqua con una barra magnetica. Lasciare questo apparato tutta la notte a quattro gradi Celsius per rimuovere ogni traccia di bromuro di cianogeno e acido formico. Utilizzare una siringa monouso da un millilitro per trasferire la soluzione dializzata dalla cassetta in un tubo da 1,5 millilitri.

Quindi analizzare la soluzione eseguendone l'elettroforesi su un gel di poliacrilammide al 12%. Colorare il gel con la colorazione argentica per visualizzare il profilo elettroforetico dei peptidi matriciali derivati dal bromuro di cianogeno. A partire dai gel di membrana basale ricoperti con PBS, lavare i gel altre due volte con 300 microlitri di PBS contenente 0,1 millimoli di cloruro di calcio.

E 0,5 millimoli di cloruro di magnesio. Per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi, rimuovere il PBS e aggiungere 300 microlitri di paraformaldeide al 4% per coprire ciascun gel di membrana basale ricostituito.

Incubare i gel per 30 minuti a temperatura ambiente per fissare i componenti della membrana basale ricostituita. Successivamente, rimuovere il fissativo e aggiungere 300 microlitri di una soluzione di blocco contenente 75 millimoli di cloruro di ammonio e 0,5 millimoli di cloruro di magnesio. Incubare la soluzione per cinque minuti a temperatura ambiente, quindi rimuovere la soluzione e ripetere il risciacquo altre quattro volte.

Dopo il risciacquo finale, aggiungere 300 microlitri di buffer per immunofluorescenza ai gel di membrana basale ricostruiti per prevenire reazioni non specifiche. Incubare i gel nella soluzione per due ore a temperatura ambiente su una piattaforma agitatrice. Successivamente, rimuovere il buffer bloccante per immunofluorescenza.

Aggiungere 300 microlitri di anticorpo primario diluito nel buffer di blocco. Incubare i gel di membrana basale ricostruiti a quattro gradi Celsius per 16 ore. Il giorno successivo, rimuovere l'anticorpo primario e lavare i gel tre volte con 300 microlitri di buffer per immunofluorescenza.

Agitare i gel a temperatura ambiente su una piastra agitatrice per 10 minuti dopo ogni aggiunta di tampone. Rimuovere quindi il tampone e aggiungere 300 microlitri dell'anticorpo secondario marcato con fluorocromo, diluito nel tampone di blocco. Posizionare i campioni su una piastra agitatrice e incubare i gel per due ore a temperatura ambiente.

Rimuovere l'anticorpo secondario. Lavare il campione in un buffer per immunofluorescenza, seguito da PBS, quindi fissare e quenchare i campioni una seconda volta. Infine, montare i gel e utilizzare un microscopio per analizzare la formazione di fasci densi.

Per formare acini ghiandolari prostatici, diluire 5.000 cellule RWPE-1 in 300 microlitri di KSFM completo, integrato con il 2% della soluzione di membrana basale. Per aggregati di cellule tumorali prostatiche, diluire 2.500 cellule PC3 in 300 microlitri di mezzo di coltura RPMI-1640, integrato con il 2% della soluzione di membrana basale. Dopo l'incubazione notturna dei gel di membrana basale ricostituiti in PBS, lavarli due volte con 500 microlitri di mezzo di coltura.

Prima di seminare le cellule. Seminare delicatamente le cellule sui membrane basali ricostituite native e indurite dai prodotti finali della glicazione avanzata. Quindi posizionare con attenzione le colture in un incubatore per garantire una distribuzione uniforme degli acini e dei sferoidi in crescita.

Per le cellule che formano acini, cambiare il mezzo ogni due giorni con mezzo di coltura fresco, contenente il 2% della soluzione di membrana basale. Per garantire che le cellule ricevano i fattori di crescita necessari per l'omeostasi normale degli acini. Dopo sei giorni di coltura, le cellule epiteliali della prostata formano acini sulla membrana basale ricostruita nativa.

Sono organizzati in sferoidi uniformi di cellule epiteliali. Questi acini presentano anche le caratteristiche di cellule epiteliali prostatiche altamente organizzate con polarità apicale-basale e uno spazio luminale visibile. Quando coltivati per sei giorni su una membrana indurita, le cellule mostrano un'architettura alterata.

E il cambiamento dalla forma sferoidale a quella poligonale. Inoltre, questi acini sono altamente disorganizzati e hanno perso la loro polarità apicobasale, con uno spazio luminale ridotto o addirittura assente.

Questo vale anche per le cellule derivate da una ghiandola prostatica affetta da iperplasia prostatica benigna. Quando sono state misurate le cellule tumorali della prostata, si è osservato che erano più allungate sul membrana basale riconstituita rigida, si spostavano più velocemente e mostravano una maggiore persistenza cellulare. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come modellare gli effetti della rigidità della membrana basale sul comportamento delle cellule epiteliali e tumorali.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che deve essere indotta la rigidità desiderata della membrana basale e che gli acini singoli o gli s-sferoidi siano correttamente formati. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'oncologia per esplorare l'induzione dell'invasione delle cellule tumorali da parte della rigidità della membrana basale nella ghiandola prostatica. Seguendo questo protocollo, è possibile eseguire altri metodi, come l'immunoblotting dei lisati cellulari, per rispondere ad ulteriori domande relative alle vie di segnalazione modulate dalla rigidità della membrana basale.

Non dimenticare che lavorare con cianoboroidruro di sodio, bromuro di cianogeno e acido formico può essere estremamente pericoloso, e si devono sempre adottare precauzioni come indossare camice da laboratorio, guanti, schermo facciale e respiratore quando si lavora sotto cappa chimica durante l'esecuzione di questa procedura.