Studiare gli effetti di rigidità Matrix sulla funzione cellulare utilizzando acrilamide a base di idrogeli

Per modellare la compliance tissutale in vivo utilizzando idrogel di acrilammide. Ciò si ottiene generando prima vetrini coprioggetti inferiori reattivi e vetrini coprioggetti superiori siliconati. Il secondo passo della procedura consiste nel versare e creare gli idrogel di acrilammide.

La terza fase della procedura consiste nel reticolare la proteina della matrice extracellulare scelta all'idrogel. La fase finale della procedura è l'incubazione e l'analisi delle cellule. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano come la variazione della compliance della matrice extracellulare in vitro regoli il comportamento cellulare attraverso l'analisi mediante microscopia a immunofluorescenza, PCR quantitativa in tempo reale e western blotting.

Oggi vi mostreremo la procedura per la generazione e l'uso di idrogel di acrilammide. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare la rigidità della nostra matrice extracellulare che regola la morfologia cellulare, la segnalazione cellulare e la proliferazione. Quindi iniziamo.

Iniziare questa procedura generando vetrini di copertura reattivi. Per prima cosa posizionare uno strato di paraform sulla metà inferiore di una piastra di Petri da 150 millimetri. Quindi trasferire fino a nove vetrini di copertura in autoclave da 25 millimetri sulla pellicola para e coprirli con un millilitro di idrossido di sodio molare da 0,1

Incubare i vetrini coprioggetto per tre minuti Dopo l'incubazione, aspirare l'idrossido di sodio con una linea a vuoto funzionante in una pipetta chimica a cappuccio 0,5 millilitri di tre trimetili a profilo amminico o tre A-P-T-M-S su ciascun vetrino coprioggetti. Incubare i vetrini coprioggetto per tre minuti e poi aspirare i tre A-P-T-M-S. Fare attenzione a non incubare troppo a lungo per evitare la formazione di schiuma sul coperchio.

Scivola dopo il trattamento. Sciacquare una volta i vetrini coprioggetto con 20 millilitri di acqua deionizzata nello stesso piatto. Rimuovere i vetrini coprioggetto dal piatto utilizzando una pinza curva e trasferirli con il lato trattato rivolto verso l'alto su un nuovo piatto da 150 millimetri.

Quindi lavare nuovamente i vetrini coprioggetto con acqua deionizzata e posizionarli sul bilanciere per 10 minuti. Dopo l'incubazione, rimuovere l'acqua e lavare altre due volte. È molto importante rimuovere tutti e tre gli A-P-T-M-S in modo che non reagiscano con la glutaraldeide e lascino un precipitato bianco torbido 10 minuti prima dell'uso per la glutaraldeide.

Utilizzando una pinza curva, trasferire i vetrini coprioggetti in un piatto pulito stratificato con param e aspirare il liquido rimanente utilizzando una linea sottovuoto, quindi coprire completamente ogni vetrino coprioggetti con 0,5 millilitri di glutaraldeide allo 0,5% in acqua deionizzata sterile per reticolare i tre A-P-T-M-S e il gel di poliacrilammide. Incubare i vetrini coprioggetto per 30 minuti in una cappa chimica. Quindi aspirare la glutaraldeide, risciacquare e lavare nuovamente i vetrini coprioggetti con acqua deionizzata.

Quindi asciugare completamente i vetrini copricopertina. Aggiungere nuovi vetrini coprioggetti a una provetta Falcon da 50 millilitri contenente una soluzione di tenuta superficiale al 10% in cloroformio e roccia per almeno 10 minuti. Decantare la soluzione di tenuta superficiale e asciugare all'aria.

Il coperchio scivola sulle salviette Kim nell'armadio di sicurezza biologica dove verranno preparati gli idrogel per iniziare la preparazione dell'idrogel. Utilizzare una pinza curva per trasferire il lato reattivo del vetrino coprioggetto su un foglio di paraforma che è stato fissato con nastro adesivo sulla superficie della cabina di sicurezza biologica. Assicurarsi che i vetrini coprioggetti siano piatti sulla superficie paraform.

Quindi preparare un coadiuvante CIN saturo e idrossilato o una soluzione NHS in toluene sciogliendo una piccola quantità di NHS in una quantità sufficiente di toluene. Per gli esperimenti specifici, aggiungere piccole quantità di NHS fino a quando il NHS non si dissolve più. La soluzione satura è solitamente torbida e rosa.

Successivamente, preparare l'acrilammide BIS acrilammide acqua e un PS per raggiungere la percentuale di acrilammide desiderata. Aggiungere i reagenti alle provette microuso come indicato nel protocollo scritto. Poi un'aliquota alla volta.

Aggiungi il NHS e TM me. Agitare brevemente e immediatamente il tubo Versare da tre a cinque gel utilizzando 140 microlitri per vetrino di copertura nelle cappe di sicurezza biologica. Posizionare rapidamente il vetrino coprioggetto SILICONATO da 25 millimetri sopra ogni gel prima che inizi a polimerizzare.

L'aggiunta del vetrino coprioggetto superiore consentirà all'acrilammide di coprire completamente il vetrino coprioggetto inferiore. Incubare questo sandwich a temperatura ambiente fino a quando l'acrilammide polimerizza per determinare quando è avvenuta la polimerizzazione. Controllare la soluzione di acrilammide residua nella provetta della microcentrifuga.

La polimerizzazione richiederà alcuni minuti per i gel rigidi e un po' più a lungo per i gel morbidi. Una volta avvenuta la polimerizzazione, prelevare con cura il sandwich indossando guanti sterili. Quindi sfilare il vetrino coprioggetto superiore fino a quando non sporge dal gel polimerizzato.

Quindi fare leva sul coperchio. Sfilare il gel, scartare il vetrino coprioggetti superiore. Posizionare ogni vetrino coprinte in gel inferiore d'ora in poi chiamato idrogel in una piastra a sei pozzetti.

Quindi, aggiungere due millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato o PBS per pozzetto di una piastra a sei pozzetti. Quindi lavare gli idrogel con PBS e incubare su un bilanciere per cinque minuti. Ripetere questo lavaggio due volte.

Per iniziare l'esperimento, coprire ogni idrogel con due millilitri di una soluzione di fibronectina o di un'altra proteina della matrice extracellulare. Incubare la proteina sull'idrogel durante la notte a quattro gradi Celsius per consentirle di legarsi in modo covalente all'idrogel dopo l'incubazione notturna, aspirare la soluzione ECM. Quindi bloccare l'NHS non reattivo con un milligrammo per millilitro di albumina sierica bovina priva di acidi grassi attivati riscaldati in terreni privi di siero e incubare per almeno 30 minuti a 37 gradi Celsius.

Dopo l'incubazione, lavare una volta gli idrogel con PBS sterile. Quindi piastrate le cellule nel terreno di coltura appropriato contenente siero fetale bovino. Sull'idrogel qui.

Stabilire che vengono utilizzati fibroblasti embrionali di topo. Determinare il numero di cellule da seminare sull'idrogel in base al grado di diffusione e confluenza delle cellule richiesto per la sperimentazione. Circa 10-5 cellule necessarie per il western blot e l'analisi quantitativa della PCR.

Quindi incubare le cellule nelle condizioni appropriate per il tipo di cellula specifico. Dopo il periodo di incubazione. Estrarre la proteina cellulare o l'mRNA in base alle necessità.

Pipettare 100 microlitri di goccioline di tampone di lisi su un foglio di paraform sul banco da laboratorio, lasciando circa due o tre centimetri tra ogni gocciolina. Quindi, rimuovere con cura ciascun idrogel sollevando il vetrino del coperchio inferiore dal pozzo. Usando una pinza curva e posizionando il lato della cella rivolto verso il basso sopra le goccioline.

Incubare le cellule con il tampone di lisi per un minuto esatto. Infine, rimuovere i vetrini di copertura e trasferire il tampone di lisi in una provetta per microcentrifuga. In alternativa, durante l'estrazione dell'RNA, trasferire ciascun idrogel in una nuova piastra a sei pozzetti e aggiungere un millilitro di triazolo per pozzetto.

Incubare i gel per tre minuti dopo l'incubazione. Rimuovere la soluzione di triazolo per la conservazione in una provetta per microcentrifuga. Il lavaggio accurato dei vetrini coprioggetti dopo l'aggiunta di A-P-T-M-S è un passo importante nella produzione di vetrini protettivi reattivi.

I vetrini coprioggetti adeguatamente lavati e asciutti sono privi di residui di precipitati. A-P-T-M-S reagirà con la glutaraldeide e produrrà un precipitato bianco nuvoloso. In caso di precipitazione, l'intera procedura deve essere ripetuta poiché il vetrino coprioggetto non è più utilizzabile.

Dopo la formazione di idrogel e il rivestimento con le proteine della MEC, le cellule vengono seminate durante la notte. C'è una netta differenza tra le cellule che si diffondono su idrogel rigidi rispetto a quelli morbidi, come si può vedere dal foide nella colorazione, e le cellule dei fibroblasti embrionali di topo si diffondono in misura maggiore su idrogel rigidi rispetto agli idrogel morbidi. In effetti, la maggior parte delle cellule che si attaccano a un idrogel morbido rimarranno compatte e si attaccheranno in modo meno efficiente.

I risultati rappresentativi della PCR quantitativa dei livelli di mRNA del ciclo D 1 nei fibroblasti embrionali di topo mostrano che il ciclo D one è significativamente sovraregolato su una matrice rigida, ma non su una matrice morbida. Ciò suggerisce che la rigidità della matrice regola la progressione del ciclo cellulare in vitro. Ti abbiamo appena mostrato come generare idrogel che recide la rigidità, modellando in vivo le condizioni fisiologiche Quando si esegue questa procedura è importante ricordare di fare vetrini di copertura extra reattivi poiché si verificheranno incidenti ed errori.

Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.