Caracterización de las células dendríticas derivadas de monocitos humanos mediante imágenes de Citometría de Flujo: una comparación entre dos protocolos de aislamiento de monocitos

Este estudio compara dos métodos diferentes de aislamiento de monocitos humanos para obtener células dendríticas (CD) in vitro. Los monocitos se seleccionan por adherencia o se enriquecen negativamente por separación magnética. Se comparará el rendimiento y la viabilidad de los monocitos junto con la viabilidad, la proliferación y la expresión de marcadores de superficie CD11c/CD14 entre ambos métodos.

El objetivo general de este estudio es comparar dos métodos diferentes de aislamiento de monocitos humanos para la generación de células dendríticas in vitro y caracterizar la expresión de la superficie celular CT11c, CT14 de las poblaciones derivadas de monocitos resultantes mediante citometría de flujo por imágenes. Estos protocolos de aislamiento de monocitos pueden contribuir al desarrollo de métodos fiables para la purificación de células dendríticas humanas para aplicaciones clínicas y de investigación. La principal ventaja de estos protocolos es que facilitan el aislamiento de monocitos humanos y su diferenciación en células derivadas de monocitos viables y funcionales.

Además, este es el primer estudio que caracteriza la población específica de células dendríticas derivadas de monocitos mediante citometría de flujo de imágenes de una sola célula. Este método también se puede aplicar como una alternativa para el aislamiento de otras células raras con un rendimiento adecuado para aplicaciones de investigación posteriores. La demostración visual de estos métodos es fundamental, ya que puede ser un desafío manipular las muestras de sangre de manera segura sin la instrucción y la experiencia adecuadas.

Comience diluyendo la muestra de sangre en una proporción de uno a uno con PBS en un matraz T75. Luego, agregue 15 mililitros de solución de gradiente de densidad en un tubo de centrífuga de 50 mililitros y coloque cuidadosamente de 25 a 30 mililitros de sangre diluida sobre el gradiente. Para lograr una separación adecuada de las células mononucleares de sangre periférica, cargue la sangre en la solución de gradiente de densidad rápidamente, pero con cuidado y sin mezclar las capas.

Separe las células por centrifugación, seguida de la transferencia de la capa de interfaz de glóbulos blancos a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros. Lavar las células dos veces en PBS, volviendo a suspender el pellet final en 10 mililitros de tampón de lisado de cloruro de amonio y potasio durante 15 minutos a 4 grados centígrados. A continuación, lave las células dos veces más en PBS.

Para aislar monocitos por el método de adherencia, se cultivó cinco veces 10 a las siete celdas del pellet de PBMC resultante por 10 mililitros de medio completo en un matraz T75 nuevo durante dos horas a 37 grados centígrados y cinco por ciento de dióxido de carbono en una incubadora humidificada. Al final de la incubación, deseche las células flotantes no adherentes y lave suavemente las células adherentes dos veces con PBS. A continuación, alimente las células adherentes con un medio de cultivo celular completo suplementado con GMCSF humano e IL4 y devuelva el cultivo a la incubadora durante cinco a siete días.

Para aislar los monocitos por separación magnética, después de recolectar el PBMC por separación en gradiente de densidad, transfiera la capa de glóbulos blancos a un tubo de poliestireno de cinco mililitros y vuelva a suspender las células en PBS a una concentración de cinco veces 10 a siete células por mililitro. A continuación, agregue 50 microlitros de un cóctel de enriquecimiento de monocitos humanos por mililitro a las células con mezcla e incube las células con el cóctel a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Luego agregue 50 microlitros de partículas magnéticas por mililitro de células con una mezcla cuidadosa e incube las células a 4 grados centígrados durante cinco minutos.

Al final de la segunda incubación, agregue PBS a las celdas para llevar el volumen total a dos coma cinco mililitros y mezcle pipeteando dos o tres veces. A continuación, coloque el tubo de poliestireno en un dispositivo magnético adecuado a temperatura ambiente. Después de dos minutos y medio, con el tubo aún en el imán, decantar la fracción de monocitos purificada en un nuevo tubo cónico de 15 mililitros.

A continuación, cultive los monocitos purificados y el medio de cultivo celular completo suplementado con GMCSF e IL4 durante cinco a siete días, como se acaba de demostrar. Después de siete días de diferenciación, dispense una vez 10 a las seis células de las células dendríticas derivadas de monocitos en el número apropiado de tubos de un punto cinco mililitros, y agregue 50 microlitros de suero humano inactivado por calor a cada muestra para bloquear cualquier hallazgo inespecífico. Después de 10 minutos, centrifugar las células y volver a suspender los gránulos en los anticuerpos primarios conjugados con fluorescencia apropiados durante 20 minutos a cuatro grados centígrados protegidos de la luz.

A continuación, lavar las células dos veces en un mililitro de PBS, resuspendiendo los gránulos en 100 microlitros de PBS por una vez diez a las seis células. Justo antes del análisis, agregue un microlitro de DAPI a cada tubo. Luego, lea las muestras en un citómetro de flujo de imágenes de una sola celda de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

En promedio, los monocitos aislados por el método de adherencia representan aproximadamente el seis punto dos por ciento de la población total de células de monocitos de sangre periférica, o PBMC, mientras que los monocitos aislados por separación magnética representan hasta el 25 por ciento del total de PBMC. Los monocitos aislados por cualquiera de los dos métodos son igualmente viables. Los MDDC diferenciados de los monocitos purificados por ambos métodos se controlaron primero en función de las células negativas o viables para DAPI a partir del total de células individuales, seguido de la activación de cada población celular.

Ambos métodos de aislamiento arrojaron una población baja de CD14 positivo y ambos métodos produjeron una población total alta de CD11c positivo. Se realizó un análisis fenotípico adicional en todas las células CD11c positivas y, aunque el aislamiento magnético proporciona un mayor porcentaje de células CD11c positivas dobles positivas para CD14, este efecto no fue significativo en comparación con el método de adherencia. Estas células CD11c positivas y CD14 positivas pueden ser MDDC diferenciados en etapa temprana que aún no han eliminado el marcador monocítico CD14.

Al analizar las células CD11c positivas individuales, el método de adherencia proporciona el mayor rendimiento de células CD11c positivas y CD14 negativas. Estas células positivas individuales pueden ser MDDC diferenciados en etapa tardía. Una vez dominadas, las técnicas de adherencia y aislamiento magnético pueden completarse en tres o cuatro horas y en una o dos horas respectivamente si se realizan correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar tener citocinas frescas de diferenciación de células dendríticas cada 48 horas cuando se repone el medio. Trabajar con fluidos de riesgo biológico, como la sangre, puede ser extremadamente dañino, y siempre se debe usar equipo de protección personal y métodos de eliminación adecuados al realizar estos procedimientos. Este estudio allana el camino para que los investigadores en el campo de la inmunología exploren el uso de monocitos humanos y células dendríticas para el tratamiento terapéutico.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo optimizar el aislamiento de monocitos humanos para generar diferentes poblaciones de células derivadas de monocitos in vitro.