Protocolo económico y eficiente para aislar y cultivar células dendríticas derivadas de la médula ósea de ratones
1 de julio de 2022
Aquí, presentamos un método económico y eficiente para aislar y generar células dendríticas derivadas de la médula ósea de alta pureza a partir de ratones después de 7 días de cultivo con 10 ng / ml GM-CSF / IL-4.
Protocolo económico y eficiente de aislamiento y generación de células dendríticas derivadas de la médula ósea a partir de ratón. Los procedimientos que involucran sujetos animales han sido aprobados por el Comité de Ética Animal de la Institución de la Universidad Médica de Nanjing.One.Introduction. Con el aumento en la investigación de la inmunidad tumoral, la demanda de células DC está aumentando gradualmente.
Sin embargo, los DC son raros en todos los tejidos. El método tradicional de inducir principalmente la diferenciación de la médula ósea en DC es complicado y costoso. Dos. Aislamiento de médula ósea y preparación de células BM Sacrificamos ratones y fijamos en mesa de operaciones de ratón.
Cortar la piel de los músculos expuestos a la izquierda y la arteria femoral. No corte la arteria femoral directamente. De lo contrario, causará sangrado abundante y contaminará el campo de visión.
Corte todos los músculos alrededor del fémur. Estirar lentamente las extremidades inferiores del ratón hacia afuera hasta el prolapso de la cabeza femoral y se puede observar. Separe las extremidades inferiores del cuerpo.
Cortar la pata trasera para obtener un fémur libre y completo. Retire los músculos con una gasa. No rasgue los músculos directamente.
El fémur de los ratones es frágil. Coloque el fémur en alcohol al 75% durante dos a cinco minutos. Tres. Cultivo de inyección de BMDC Enjuague el alcohol residual con PBS.
Sujete la parte media e inferior del fémur con pinzas hemostáticas, y pince el extremo inferior del fémur con otras pinzas hemostáticas. Las pinzas hemostáticas se aplican literalmente al fémur y el fémur se rompe por la línea epifisaria. Use una jeringa de ml para perforar la cavidad de la médula ósea desde la línea epifisaria.
Use un medio completo de dos partes que enjuaguen la cavidad de la médula ósea hasta que el hueso se vuelva blanco. Recoger los líquidos de lavado. Suplementando el medio completo que contiene GM CSF / IL-4 a 24 ml, y la semilla en una placa de 6 pocillos con 4 ml por pocillo. Cuatro.Resultados.
Después de dos días, reemplace todo el medio que contenga GM-CSF/IL-4. La mitad reemplazó el medio completo que contenía GM-CSF/IL-4, en el cuarto, sexto y octavo día. El número de células alcanzó un pico en el séptimo día y luego disminuyó gradualmente.
Las células DC formaron un gran número de sinapsis mostrando una morfología típica de células DC maduras. Los análisis submétricos de flujo muestran que la relación de CD11c impuso lo que el 71% en el sexto día, el aumento de la relación amplia al 96,1% en el día 10. La expresión de CD11c, CD80 y MSC2, aumentó gradualmente con el aumento del tiempo de cultivo. Cinco.Conclusión.
En resumen, establecimos un protocolo económico y eficiente para aislar y generar células dendríticas derivadas de la médula ósea a partir de ratones, que solo toma 10 minutos para separar las células de la médula ósea. Se cosechó un alto número de DC de alta pureza después de seis a siete días de cultivo con 10 ng por ml, GM-CSF e IL-4.
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Descripción general
Este artículo presenta un método económico y eficiente para aislar y generar células dendríticas derivadas de médula ósea con alta pureza a partir de ratones. El protocolo implica un cultivo de 7 días con GM-CSF/IL-4.
Componentes Principales del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Inmunología
- Biología Celular
Antecedentes
- Las células dendríticas (DC) son cruciales para la investigación de la inmunidad tumoral.
- Las DC son raras en los tejidos, lo que dificulta su aislamiento.
- Los métodos tradicionales para la diferenciación de DC son complejos y costosos.
- Este estudio tiene como objetivo simplificar el proceso de generación de DC a partir de médula ósea.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método rentable para el aislamiento de DCs.
- Mejorar la eficiencia de la generación de DCs a partir de médula ósea de ratón.
- Apoyar la investigación en inmunidad tumoral mediante el suministro de DCs de alta pureza.
Métodos Utilizados
- Aislamiento de médula ósea de ratones.
- Cultivo de células de la médula ósea con GM-CSF/IL-4.
- Evaluación de la pureza y viabilidad celular.
- Aprobación del Comité Institucional de Ética en Experimentación Animal.
Resultados principales
- Aislamiento exitoso de DC procedentes de médula ósea con alta pureza.
- Eficiencia demostrada del nuevo protocolo.
- Potencial para aplicaciones más amplias en la investigación de inmunidad tumoral.
- Reducción del tiempo y costo en comparación con los métodos tradicionales.
Conclusiones
- El método desarrollado es una alternativa viable para la generación de CC.
- Este enfoque puede facilitar investigaciones futuras en inmunología.
- Estudios futuros podrían explorar aplicaciones en diversos contextos terapéuticos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo aborda el cuello de botella en el suministro de células dendríticas para la investigación en inmunología e inmunidad tumoral, proporcionando un método económico y de alto rendimiento para aislar células dendríticas derivadas de médula ósea de ratones. Permite la generación escalable de DCs fenotípicamente caracterizadas con menor consumo de reactivos y menos tiempo de manipulación manual, apoyando la validación temprana de dianas y estudios mecanicistas en líneas de investigación de inmunoterapia. El enfoque mejora la confianza predictiva en modelos preclínicos al ofrecer un sistema reproducible y relevante para la enfermedad, útil para evaluar la modulación inmunitaria.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar la función de las células dendríticas en las vías de presentación de antígenos y activación de linfocitos T.
- Valor operativo: Reduce el costo y la complejidad de la generación de CD mediante la diferenciación estandarizada con GM-CSF/IL-4.
- Valor científico: Apoya la validación funcional de objetivos mediante la caracterización fenotípica de la expresión de CD11c, CD80 y MHC II a lo largo del tiempo.
Desarrollo de pruebas y cribado
- Valor científico: Produce poblaciones de células dendríticas de alta pureza (80%-95% CD11c+) adecuadas para ensayos inmunológicos estandarizados.
- Valor operativo: Obtiene hasta 2,7 x 107 células por ratón, lo que permite formatos de cribado de alto rendimiento.
- Valor científico: Proporciona un sistema biológico consistente para evaluar los efectos de compuestos sobre la maduración de las células dendríticas y la función inmune.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Genera un sistema relevante para la enfermedad que permite modelar las respuestas de las células dendríticas en contextos de inmunidad tumoral.
- Valor operativo: Permite la evaluación preclínica de agentes inmunomoduladores con entradas celulares definidas.
- Valor científico: Facilita la reducción mecanicista de riesgos al vincular el fenotipo de las células dendríticas con resultados funcionales en sistemas de co-cultivo.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos activos y la evaluación preclínica, proporcionando una fuente renovable de células dendríticas para ensayos centrados en la respuesta inmunitaria.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre vías inmunitarias dependientes de células dendríticas y la interacción con dianas.
- Selección: Proporciona resultados celulares cuantitativos y reproducibles para evaluar la actividad inmunomoduladora.
- Análisis: Permite la medición basada en citometría de flujo de CD11c, CD80 y MHC II como indicadores de maduración.
- Investigación Traducional: Conecta la generación in vitro de células dendríticas con modelos preclínicos de activación e inducción de tolerancia inmunitaria.
- Reutilización Empresarial: Establece un protocolo estandarizado y ampliable para la producción de células dendríticas en diversos proyectos de inmunología.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos mediante entradas de células dendríticas definidas fenotípicamente.
- Valor operativo: Reduce el tiempo y el costo mediante una recolección de médula ósea de 10 minutos y dosis bajas de citoquinas (10 ng/mL GM-CSF/IL-4).
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar modelos confiables de células dendríticas para la selección de inmunoterapias.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos inmunomoduladores utilizando células efectoras inmunes estandarizadas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el aislamiento de médula ósea murina y en técnicas de cultivo celular asépticas.
- Depende del acceso a placas de 6 pocillos, pinzas hemostáticas y citometría de flujo para la validación fenotípica.
- Necesita la estandarización de la concentración de citocinas y del programa de cambio de medio entre diferentes usuarios.
- Implica consideraciones de adaptación al trasladar el protocolo a otras cepas de ratón o fondos genéticos.
- Está limitado por la ventana de cultivo de 7 a 10 días y por la consiguiente disminución de la viabilidad celular tras el pico.
