Name: Protocolo económico y eficiente para aislar y cultivar células dendríticas derivadas de la médula ósea de ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 29 s
Description: Aprende a aislar y cultivar células dendríticas derivadas de médula ósea de ratones con GM-CSF/IL-4. Este protocolo económico genera células de alta pureza en siete días para investigación inmunológica.

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Este trabajo fue apoyado por el Programa del Plan de Ciencia y Tecnología de Tianjin (20JCQNJC00550), el Proyecto de Ciencia y Tecnología de la Salud de Tianjin (TJWJ202021QN033 y TJWJ202021QN034).

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica de Nanjing.
1. Aislamiento de la médula ósea y preparación de células BM
<ol><li>Sacrifice ratones C57BL/6 (18-22 g, 6-8 semanas de edad) a través de la asfixia por CO2 . Fije el ratón en la mesa de operaciones del ratón. Desinfectar las superficies con etanol al 70%.</li>
	<li>Cortar la piel de la pierna para exponer los músculos y la arteria femoral. Pinza y arranca la arteria femoral con dos fórceps, luego tira del extremo proximal hacia el abdomen. NOTA: No corte la arteria femoral directamente. De lo contrario, causará sangrado excesivo y contaminará el campo de visión.</li>
	<li>Corte todos los músculos alrededor del fémur.</li>
	<li>Estire lentamente las extremidades inferiores del ratón hacia afuera hasta que se escuche el sonido de la dislocación de la articulación de la cadera y el prolapso de la cabeza femoral sea visible.</li>
	<li>Separe las extremidades inferiores del cuerpo usando tijeras a lo largo del interior de la cabeza femoral.</li>
	<li>Cortar las patas traseras desde el extremo de la articulación de la rodilla para obtener un fémur libre y completo.</li>
	<li>Retire los músculos unidos al fémur con una gasa. NOTA: No rasgue los músculos directamente. El fémur de los ratones es delicado, su integridad debe mantenerse.</li>
	<li>Sumergir el fémur en alcohol al 75% durante 2-5 min.</li>
</ol>2. Cultivo de inducción de BMDC
<ol><li>Enjuague el alcohol residual con PBS. Use fórceps hemostáticos para sujetar la parte media e inferior del fémur y otro conjunto para sujetar el extremo inferior del fémur. Las pinzas hemostáticas se aplican lateralmente al fémur, y el fémur se separa de la línea epifisaria. NOTA: La línea epifisaria no es fácilmente visible hasta que el fémur se fractura. Este y los siguientes pasos se realizan en un ambiente estéril.</li>
	<li>Use una jeringa de 1 ml (aguja: 0,6 mm x 25 mm) para penetrar en la cavidad de la médula ósea desde la rotura de la línea epifisaria y gire la aguja para penetrar en la cabeza femoral y a través de la cavidad de la médula ósea. Pulse y enjuague la cavidad de la médula ósea utilizando 1 ml del medio completo que contiene GM-CSF/IL-4 hasta que el hueso se vuelva blanco. NOTA: Medio de cultivo completo: 10% FBS, 1% penicilina-estreptomicina, 55 μM β-Mercaptoetanol, 10 ng/mL GM-CSF y 10 ng/mL IL-4.</li>
	<li>Resuspendir todas las células en 24 mL de medio de cultivo completo (~5 x 105 células/mL). Después de la mezcla, todo el medio se sembró en una placa de 6 pocillos con 4 ml / pozo, luego se incubó a 37 ° C con 5% de CO2 durante 2 días. NOTA: No es necesario lisar eritrocitos.</li>
	<li>Reemplace todo el medio después de 2 días por un medio que contenga GM-CSF/IL-47. En el cuarto, sexto y octavo día, reemplace la mitad del medio con el medio completo que contiene 10 ng/ ml GM-CSF/IL-4. NOTA: En este paso, se eliminan las células suspendidas como los eritrocitos y los linfocitos.</li>
	<li>Tome fotografías todos los días para registrar el crecimiento celular. A partir del sexto día, recolecte un pocillo de células por día para contar el número de células y detectar la expresión de CD11c, CD80 y MHC II 6,7.</li>
</ol>3. Detección citométrica de flujo de la expresión de CD11c, CD80 y MHC II
<ol><li>Después de lavar los DC con PBS, resuspenda 1 x 106 células en 100 μL de tampón FACS, agregue 0.5 μg de anticuerpo CD16/32 anti-ratón e incube durante 10 minutos en hielo para bloquear los sitios de antígenos no específicos.</li>
	<li>Añadir 1 μg de Percp/cy5.5-CD11c, 0,5 μg de PE-CD80 y 0,04 μg de anticuerpos APC-MHC II, e incubar en hielo durante 30 min.</li>
	<li>Centrifugar a 1.000 x g durante 3 min a 4 °C, retirar el sobrenadante, añadir 1 ml de paraformaldehído al 4%, fijar durante 30 min a 4 °C y volver a suspender en 300 μL de tampón FACS.</li>
	<li>Realizar citometría de flujo.</li>
</ol>

<ol><li>Huang, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-loaded+monocyte+administration+induces+potent+therapeutic+antitumor+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Antigen-loaded monocyte administration induces potent therapeutic antitumor T cell responses.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 774-788 (2020).</li>
<li>Wang, P., Dong, S., Zhao, P., He, X., Chen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+loading+of+CTL+epitopes+onto+MHC+class+I+complexes+on+dendritic+cell+surface+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Direct loading of CTL epitopes onto MHC class I complexes on dendritic cell surface in vivo.</a> Biomaterials. 182, 92-103 (2018).</li>
<li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).</li>
<li>Jiang, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galactosylated+liposome+as+a+dendritic+cell-targeted+mucosal+vaccine+for+inducing+protective+anti-tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Galactosylated liposome as a dendritic cell-targeted mucosal vaccine for inducing protective anti-tumor immunity.</a> Acta Biomaterialia. 11, 356-367 (2015).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+immunotherapies+to+improve+anticancer+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Next-generation immunotherapies to improve anticancer immunity.</a> Frontiers in Pharmacology. 11, 566401(2020).</li>
<li>Lutz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+advanced+culture+method+for+generating+large+quantities+of+highly+pure+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow.</a> Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).</li>
<li>Son, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+bulk-culture+method+for+generating+mature+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel bulk-culture method for generating mature dendritic cells from mouse bone marrow cells.</a> Journal of Immunological Methods. 262 (1-2), 145-157 (2002).</li>
<li>Guo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+protein+vaccine+based+on+Ag85B+and+STEAP1+induces+a+protective+immune+response+against+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Fusion protein vaccine based on Ag85B and STEAP1 induces a protective immune response against prostate cancer.</a> Vaccines. 9 (7), 786(2021).</li>
<li>Olweus, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+ontogeny%3A+A+human+dendritic+cell+lineage+of+myeloid+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell ontogeny: A human dendritic cell lineage of myeloid origin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (23), 12551-12556 (1997).</li>
<li>Martin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concept+of+lymphoid+versus+myeloid+dendritic+cell+lineages+revisited%3A+both+CD8alpha%28-%29+and+CD8alpha%28%2B%29+dendritic+cells+are+generated+from+CD4%28low%29+lymphoid-committed+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Concept of lymphoid versus myeloid dendritic cell lineages revisited: both CD8alpha(-) and CD8alpha(+) dendritic cells are generated from CD4(low) lymphoid-committed precursors.</a> Blood. 96 (-), 2511-2519 (2000).</li>
<li>Anderson, D. A., Dutertre, C. A., Ginhoux, F., Murphy, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+models+of+human+and+mouse+dendritic+cell+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">Genetic models of human and mouse dendritic cell development and function.</a> Nature Reviews: Immunology. 21 (2), 101-115 (2021).</li>
<li>Vu Manh, T. P., Bertho, N., Hosmalin, A., Schwartz-Cornil, I., Dalod, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+evolutionary+conservation+of+dendritic+cell+subset+identity+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Investigating evolutionary conservation of dendritic cell subset identity and functions.</a> Frontiers in Immunology. 6, 260(2015).</li>
<li>Scheicher, C., Mehlig, M., Zecher, R., Reske, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow%3A+in+vitro+differentiation+using+low+doses+of+recombinant+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells from mouse bone marrow: in vitro differentiation using low doses of recombinant granulocyte-macrophage colony-stimulating factor.</a> Journal of Immunological Methods. 154 (2), 253-264 (1992).</li>
<li>Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+murine+dendritic+cells+from+flt3-ligand-supplemented+bone+marrow+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures.</a> Blood. 96 (9), 3029-3039 (2000).</li>
<li>Mayordomo, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow-derived+dendritic+cells+pulsed+with+synthetic+tumour+peptides+elicit+protective+and+therapeutic+antitumour+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">marrow-derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity.</a> Nature Medicine. 1 (12), 1297-1302 (1995).</li>
<li>Condon, C., Watkins, S. C., Celluzzi, C. M., Thompson, K., Falo, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-based+immunization+by+in+vivo+transfection+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">DNA-based immunization by in vivo transfection of dendritic cells.</a> Nature Medicine. 2 (10), 1122-1128 (1996).</li>
<li>Brunner, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-prandial+administration+of+the+insulin+analogue+insulin+aspart+in+patients+with+type+1+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetic+Medicine%22%5BJournal%5D)">Post-prandial administration of the insulin analogue insulin aspart in patients with type 1 diabetes mellitus.</a> Diabetic Medicine. 17 (5), 371-375 (2000).</li>
<li>Koido, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+antitumor+immunity+by+vaccination+of+dendritic+cells+transfected+with+MUC1+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Induction of antitumor immunity by vaccination of dendritic cells transfected with MUC1 RNA.</a> Journal of Immunology. 165 (10), 5713-5719 (2000).</li>
<li>Jonasson, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strength+of+the+porcine+proximal+femoral+epiphyseal+plate%3A+The+effect+of+different+loading+directions+and+the+role+of+the+perichondrial+fibrocartilaginous+complex+and+epiphyseal+tubercle+-+An+experimental+biomechanical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Orthopaedics%22%5BJournal%5D)">Strength of the porcine proximal femoral epiphyseal plate: The effect of different loading directions and the role of the perichondrial fibrocartilaginous complex and epiphyseal tubercle - An experimental biomechanical study.</a> Journal of Experimental Orthopaedics. 1 (1), 4(2014).</li>
<li>Labeur, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+tumor+immunity+by+bone+marrow-derived+dendritic+cells+correlates+with+dendritic+cell+maturation+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage.</a> Journal of Immunology. 162 (1), 168-175 (1999).</li>
<li>Hinkel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+dendritic+cells+generated+from+nonfractionated+bulk+peripheral+blood+mononuclear+cell+cultures+induce+growth+of+cytotoxic+T+cells+against+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory dendritic cells generated from nonfractionated bulk peripheral blood mononuclear cell cultures induce growth of cytotoxic T cells against renal cell carcinoma.</a> Journal of Immunotherapy. 23 (1), 83-93 (2000).</li>
</ol>

Todos los autores declaran que no tienen conflictos de intereses y que no tienen nada que revelar.

Los seres humanos y los ratones tienen diferentes subconjuntos de DC, incluidos los DC clásicos (cDC, incluidos los cDC1 y cDC2), los DC plasmocitoides (pDC) y los DC derivados de monocitos (MoDC)9,10,11. En general, se acepta que los cDC1 regulan las respuestas de los linfocitos T citotóxicos (CTL) a los patógenos intracelulares y al cáncer, y los cDC2 regulan las respuestas inmunes a los patógenos, parásitos y alérgenos extrac...

Las células dendríticas (CD) son las células presentadoras de antígenos (APC) más potentes para activar las células T naïve e inducir respuestas específicas de linfocitos T citotóxicos (CTL) contra enfermedades infecciosas, alergias y células tumorales 1,2,3. Los DC son el vínculo principal entre la inmunidad innata y la inmunidad adaptativa y desempeñan un papel esencial en la defensa inmunológica y el mantenimiento de la tolerancia inmune. En los últimos 40 años, muchos investigadores han tratado de definir los subconjuntos de DC y sus funciones en la inflamación y la inmunidad. Según esos estudios, los DC se desarrollan a lo largo de los linajes mieloides y linfoides de las células de la médula ósea. Las vacunas contra tumores han ganado hitos significativos en los últimos años y tienen un futuro prometedor. Mecánicamente, las vacunas tumorales modulan la respuesta inmune y previenen el crecimiento tumoral mediante la activación de linfocitos T citotóxicos utilizando antígenos tumorales. La vacuna basada en CD juega un papel importante en la inmunoterapia tumoral y ha sido identificada como una de las terapias antitumorales más prometedoras 1,4. Además, los DC se han utilizado ampliamente en las pruebas de nuevos fármacos dirigidos molecularmente e inhibidores del punto de control inmunitario5.
Los investigadores necesitan urgentemente un alto número de DC de alta pureza para estudiar más a fondo el papel de los DC. Sin embargo, los DC son raros en varios tejidos y sangre, representando solo el 1% de las células sanguíneas en humanos y animales. El cultivo in vitro de células dendríticas de la médula ósea (BMDC) es un método importante para obtener grandes cantidades de células DC. Mientras tanto, el protocolo Lutz para generar DC a partir de la médula ósea ha sido ampliamente utilizado por los investigadores6. Aunque el protocolo es efectivo en la obtención de células DC, es complejo y costoso, ya que implica la adición de altas concentraciones de citoquinas y la lisis de los glóbulos rojos.
En este estudio, informamos un método para aislar casi todas las células de la médula ósea de la médula ósea del ratón (BM) e inducir la diferenciación en BMDC después de 7-9 días de incubación in vitro, con una menor concentración de GM-CSF e IL-4. Este procedimiento solo toma 10 minutos para cosechar casi todas las células de la médula ósea y suspenderlas en un medio completo. En resumen, proporcionamos un método de cultivo eficiente y rentable para BMDC en esta investigación.

<table><tbody><tr><td>&beta;-Mercaptoetanol</td><td>Solarbio</td><td>M8211</td><td></td></tr><tr><td>placa de 6 pocillos</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>APC-MHC II</td><td>Biolegend</td><td>116417</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10100</td><td></td></tr><tr><td>PE-CD80</td><td>Biolegend</td><td>104707</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Solarbio</td><td>P1400</td><td></td></tr><tr><td>Percp/cy5.5-CD11c</td><td>Biolegend</td><td>117327</td><td></td></tr><tr><td>PRMI-1640</td><td>Thermo</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Ratón Recombinante GM-CSF</td><td>Solarbio</td><td>P00184</td><td></td></tr><tr><td>Ratón Recombinante IL-4</td><td>Solarbio</td><td>P00196</td><td></td></tr><tr><td>TruStain Fc PLUS (anti-ratón CD16/32) Anticuerpo</td><td>Biolegend</td><td>156603</td><td></td></tr></tbody></table>

protocolo económico y eficiente para aislar y cultivar células dendríticas derivadas de la médula ósea de ratones

Economical and Efficient Protocol for Isolating and Culturing Bone Marrow-derived Dendritic Cells from Mice

La demanda de células dendríticas (DC) está aumentando gradualmente a medida que avanza la investigación en inmunología. Sin embargo, los DC son raros en todos los tejidos. El método tradicional para aislar los DC consiste principalmente en inducir la diferenciación de la médula ósea (BM) en DC mediante la inyección de grandes dosis (>10 ng / ml) de factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos / interleucina-4 (GM-CSF / IL-4), lo que hace que el procedimiento sea complejo y costoso. En este protocolo, utilizando todas las células BM cultivadas en medio GM-CSF/IL-4 de 10 ng/mL, después de 3-4 intercambios de semicultivo, se cosecharon hasta2,7 x 10 7 células CD11c+ (DC) por ratón (dos fémures) con una pureza del 80%-95%. Después de 10 días en cultivo, la expresión de CD11c, CD80 y MHC II aumentó, mientras que el número de células disminuyó. El número de células alcanzó su punto máximo después de 7 días de cultivo. Además, este método solo tardó 10 minutos en cosechar todas las células de la médula ósea, y se obtuvo un alto número de DC después de 1 semana de cultivo.

Las células 1 x 10 7-1.7 x 107 fueron extraídas de dos fémures y fueron re-suspendidas en 24 mL de medio antes de ser plantadas en una placa de 6 pocillos (Figura 1A). Después de 2 días, las células no adherentes se eliminaron cambiando completamente el medio de cultivo. Antes de cambiar el medio, se observó un número significativo de células suspendidas (Figura 1B). Después de 3 días de cultivo, comenzaron a formarse colonias de células pe...

Aquí, presentamos un método económico y eficiente para aislar y generar células dendríticas derivadas de la médula ósea de alta pureza a partir de ratones después de 7 días de cultivo con 10 ng / ml GM-CSF / IL-4.

Protocolo económico y eficiente para aislar y cultivar células dendríticas derivadas de la médula ósea de ratones

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method ...

Protocolo económico y eficiente de aislamiento y generación de células dendríticas derivadas de la médula ósea a partir de ratón. Los procedimientos que involucran sujetos animales han sido aprobados por el Comité de Ética Animal de la Institución de la Universidad Médica de Nanjing.One.Introduction. Con el aumento en la investigación de la inmunidad tumoral, la demanda de células DC está aumentando gradualmente.Sin embargo, los DC son raros en todos los tejidos. El método tradicional de inducir principalmente la diferenciación de la médula ósea en DC es complicado y costoso. Dos. Aislamiento de médula ósea y preparación de células BM Sacrificamos ratones y fijamos en mesa de operaciones de ratón.Cortar la piel de los músculos expuestos a la izquierda y la arteria femoral. No corte la arteria femoral directamente. De lo contrario, causará sangrado abundante y contaminará el campo de visión.Corte todos los músculos alrededor del fémur. Estirar lentamente las extremidades inferiores del ratón hacia afuera hasta el prolapso de la cabeza femoral y se puede observar. Separe las extremidades inferiores del cuerpo.Cortar la pata trasera para obtener un fémur libre y completo. Retire los músculos con una gasa. No rasgue los músculos directamente.El fémur de los ratones es frágil. Coloque el fémur en alcohol al 75% durante dos a cinco minutos. Tres. Cultivo de inyección de BMDC Enjuague el alcohol residual con PBS.Sujete la parte media e inferior del fémur con pinzas hemostáticas, y pince el extremo inferior del fémur con otras pinzas hemostáticas. Las pinzas hemostáticas se aplican literalmente al fémur y el fémur se rompe por la línea epifisaria. Use una jeringa de ml para perforar la cavidad de la médula ósea desde la línea epifisaria.Use un medio completo de dos partes que enjuaguen la cavidad de la médula ósea hasta que el hueso se vuelva blanco. Recoger los líquidos de lavado. Suplementando el medio completo que contiene GM CSF / IL-4 a 24 ml, y la semilla en una placa de 6 pocillos con 4 ml por pocillo. Cuatro.Resultados.Después de dos días, reemplace todo el medio que contenga GM-CSF/IL-4. La mitad reemplazó el medio completo que contenía GM-CSF/IL-4, en el cuarto, sexto y octavo día. El número de células alcanzó un pico en el séptimo día y luego disminuyó gradualmente.Las células DC formaron un gran número de sinapsis mostrando una morfología típica de células DC maduras. Los análisis submétricos de flujo muestran que la relación de CD11c impuso lo que el 71% en el sexto día, el aumento de la relación amplia al 96,1% en el día 10. La expresión de CD11c, CD80 y MSC2, aumentó gradualmente con el aumento del tiempo de cultivo. Cinco.Conclusión.En resumen, establecimos un protocolo económico y eficiente para aislar y generar células dendríticas derivadas de la médula ósea a partir de ratones, que solo toma 10 minutos para separar las células de la médula ósea. Se cosechó un alto número de DC de alta pureza después de seis a siete días de cultivo con 10 ng por ml, GM-CSF e IL-4.

economical-efficient-protocol-for-isolating-culturing-bone-marrow

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video muestra el procedimiento para la diferenciación de células dendríticas mieloides de la médula ósea de ratón. El aislamiento de la tibia y el fémur de ratón, y el procesamiento de la médula ósea se demuestran. Imágenes que demuestran la morfología celular, antes y después de la diferenciación, y figuras que representan el fenotipo celular y la IL-12 después de la maduración de la producción con CpG se muestran.

Cultura de células dendríticas mieloides a partir de precursores de médula ósea

Este video describe un protocolo para la generación de células dendríticas--células presentadoras de antígenos clave que activan las células T-- a partir de la médula ósea de un ratón adulto.

Generación de células dendríticas derivadas de la médula ósea: un método para generar células dendríticas a partir de médula ósea de ratón

Se describe un protocolo para el aislamiento y purificación de los neutrófilos de médula ósea de ratón por centrifugación en gradiente de densidad y para el etiquetado de neutrófilos usando colorantes CellTracker. Esto representa un método sencillo, rápido, reproducible y económico para la obtención de un gran número de neutrófilos para los estudios funcionales aguas abajo o experimentos de transferencia adoptivos y seguimiento.

Aislamiento, Purificación y Etiquetado de neutrófilos de médula ósea de ratón de Estudios funcionales y experimentos de transferencia adoptivos

Aquí presentamos un protocolo que genera grandes cantidades de monocitos murinos a partir de médula ósea heterogénea para aplicaciones traslacionales. En comparación con otros, este nuevo método ayuda a reducir el número de animales sacrificados y reduce los costos al evitar métodos costosos como la separación de células magnéticas (MACS) de alto gradiente.

Aislamiento y la inyección intravenosa de murino médula ósea derivados monocitos

Existen distintos subconjuntos de células dendríticas como poblaciones raras en los órganos linfoides y, por lo tanto, son difíciles de aislar en número y pureza suficientes para los experimentos inmunológicos. Aquí describimos un método de alta eficiencia y alto rendimiento para el aislamiento de todos los principales subconjuntos actualmente conocidos de células dendríticas esplénicas de ratón.

Un método de rendimiento eficiente y de alta para el aislamiento de ratón subconjuntos de células dendríticas

Derivados de monocitos DC (MoDC) puede detectar pequeñas cantidades de moléculas asociadas de peligro y por lo tanto son fácilmente preparada. Proporcionamos un protocolo detallado para el aislamiento de MoDC de sangre y los tumores y su activación con complejos inmunes mientras destacando medidas claves que deben considerarse para evitar su activación prematura.

Protocolo de aislamiento de células dendríticas derivadas de monocitos de ratón y su activación posterior In Vitro con complejos inmunes Tumor

Aquí, presentamos un protocolo para desarrollar y caracterizar células dendríticas tolerogénicas (TolDCs) y evaluar su utilidad de la inmunoterapia.

Desarrollo y caracterización funcional de células dendríticas tolerogénicas murino

El presente protocolo describe el aislamiento y cultivo de macrófagos derivados de la médula ósea de ratones.

Aislamiento y cultivo de macrófagos derivados de la médula ósea a partir de ratones

Aquí, describimos las condiciones de cultivo in vitro , el aislamiento y el aumento de la generación de vesículas extracelulares (EV) de Echinococcus granulosus. Los pequeños vehículos eléctricos se caracterizaron mediante dispersión dinámica de la luz y microscopía electrónica de transmisión. La captación por las células dendríticas derivadas de la médula ósea y su modulación fenotípica se estudiaron mediante microscopía confocal y citometría de flujo.

Aislamiento y absorción de células dendríticas de pequeñas vesículas extracelulares de Echinococcus granulosus

Presentamos nuestra optimizado de alto rendimiento protocolo nucleofection como una forma eficiente de la transfección de primaria monocitos humanos derivados de células dendríticas, ya sea con el ADN de plásmido o siRNA sin causar la maduración celular. Nos proporcionan evidencia adicional para silenciar siRNA éxito de gen diana RIG-I tanto en el mRNA y los niveles de proteína.

Protocolo optimizado para la transfección eficiente de células dendríticas, sin maduración de las células

Aprende a aislar y cultivar células dendríticas derivadas de médula ósea de ratones con GM-CSF/IL-4. Este protocolo económico genera células de alta pureza en siete días para investigación inmunológica.

Protocolo económico y eficiente para aislar y cultivar células dendríticas derivadas de la médula ósea de ratones

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