Protocolo económico y eficiente para aislar y cultivar células dendríticas derivadas de la médula ósea de ratones
July 1st, 2022
Aquí, presentamos un método económico y eficiente para aislar y generar células dendríticas derivadas de la médula ósea de alta pureza a partir de ratones después de 7 días de cultivo con 10 ng / ml GM-CSF / IL-4.
Protocolo económico y eficiente de aislamiento y generación de células dendríticas derivadas de la médula ósea a partir de ratón. Los procedimientos que involucran sujetos animales han sido aprobados por el Comité de Ética Animal de la Institución de la Universidad Médica de Nanjing.One.Introduction. Con el aumento en la investigación de la inmunidad tumoral, la demanda de células DC está aumentando gradualmente.
Sin embargo, los DC son raros en todos los tejidos. El método tradicional de inducir principalmente la diferenciación de la médula ósea en DC es complicado y costoso. Dos. Aislamiento de médula ósea y preparación de células BM Sacrificamos ratones y fijamos en mesa de operaciones de ratón.
Cortar la piel de los músculos expuestos a la izquierda y la arteria femoral. No corte la arteria femoral directamente. De lo contrario, causará sangrado abundante y contaminará el campo de visión.
Corte todos los músculos alrededor del fémur. Estirar lentamente las extremidades inferiores del ratón hacia afuera hasta el prolapso de la cabeza femoral y se puede observar. Separe las extremidades inferiores del cuerpo.
Cortar la pata trasera para obtener un fémur libre y completo. Retire los músculos con una gasa. No rasgue los músculos directamente.
El fémur de los ratones es frágil. Coloque el fémur en alcohol al 75% durante dos a cinco minutos. Tres. Cultivo de inyección de BMDC Enjuague el alcohol residual con PBS.
Sujete la parte media e inferior del fémur con pinzas hemostáticas, y pince el extremo inferior del fémur con otras pinzas hemostáticas. Las pinzas hemostáticas se aplican literalmente al fémur y el fémur se rompe por la línea epifisaria. Use una jeringa de ml para perforar la cavidad de la médula ósea desde la línea epifisaria.
Use un medio completo de dos partes que enjuaguen la cavidad de la médula ósea hasta que el hueso se vuelva blanco. Recoger los líquidos de lavado. Suplementando el medio completo que contiene GM CSF / IL-4 a 24 ml, y la semilla en una placa de 6 pocillos con 4 ml por pocillo. Cuatro.Resultados.
Después de dos días, reemplace todo el medio que contenga GM-CSF/IL-4. La mitad reemplazó el medio completo que contenía GM-CSF/IL-4, en el cuarto, sexto y octavo día. El número de células alcanzó un pico en el séptimo día y luego disminuyó gradualmente.
Las células DC formaron un gran número de sinapsis mostrando una morfología típica de células DC maduras. Los análisis submétricos de flujo muestran que la relación de CD11c impuso lo que el 71% en el sexto día, el aumento de la relación amplia al 96,1% en el día 10. La expresión de CD11c, CD80 y MSC2, aumentó gradualmente con el aumento del tiempo de cultivo. Cinco.Conclusión.
En resumen, establecimos un protocolo económico y eficiente para aislar y generar células dendríticas derivadas de la médula ósea a partir de ratones, que solo toma 10 minutos para separar las células de la médula ósea. Se cosechó un alto número de DC de alta pureza después de seis a siete días de cultivo con 10 ng por ml, GM-CSF e IL-4.
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Visión general
Este artículo presenta un método económico y eficiente para aislar y generar células dendríticas derivadas de la médula ósea de alta pureza a partir de ratones. El protocolo implica un cultivo de 7 días con GM-CSF/IL-4.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Inmunología
- Biología celular
Antecedentes
- Las células dendríticas (CD) son cruciales para la investigación de inmunidad tumoral.
- Las CD son raras en los tejidos, lo que dificulta su aislamiento.
- Los métodos tradicionales para la diferenciación de CD son complejos y costosos.
- Este estudio tiene como objetivo simplificar el proceso de generación de CD a partir de la médula ósea.
Propósito del estudio
- Desarrollar un método rentable para aislar CD.
- Mejorar la eficiencia de la generación de CD a partir de la médula ósea de ratón.
- Apoyar la investigación en inmunidad tumoral proporcionando CD de alta pureza.
Métodos utilizados
- Aislamiento de médula ósea de ratones.
- Cultivo de células de médula ósea con GM-CSF/IL-4.
- Evaluación de la pureza y viabilidad celular.
- Aprobación del Comité Institucional de Ética Animal.
Principales resultados
- Aislamiento exitoso de CD de médula ósea de alta pureza.
- Eficiencia demostrada del nuevo protocolo.
- Potencial para una aplicación más amplia en la investigación de inmunidad tumoral.
- Reducción en tiempo y costo en comparación con los métodos tradicionales.
Conclusiones
- El método desarrollado es una alternativa viable para la generación de CD.
- Este enfoque puede facilitar más investigaciones en inmunología.
- Estudios futuros pueden explorar aplicaciones en varios contextos terapéuticos.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
This protocol addresses the bottleneck in dendritic cell supply for immunology and tumor immunity research by providing an economical, high-yield method for isolating bone marrow-derived dendritic cells from mice. It enables scalable generation of phenotypically characterized DCs with reduced reagent consumption and hands-on time, supporting early-stage target validation and mechanistic studies in immunotherapy pipelines. The approach improves predictive confidence in preclinical models by delivering a reproducible, disease-relevant system for evaluating immune modulation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of dendritic cell function in antigen presentation and T-cell activation pathways.
- Operational Value: Reduces cost and complexity of DC generation using standardized GM-CSF/IL-4 differentiation.
- Scientific Value: Supports functional target validation through phenotypic characterization of CD11c, CD80, and MHC II expression over time.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces high-purity dendritic cell populations (80%-95% CD11c+) suitable for standardized immune assays.
- Operational Value: Yields up to 2.7 x 107 cells per mouse, enabling high-throughput screening formats.
- Scientific Value: Provides a consistent biological system for assessing compound effects on dendritic cell maturation and immune function.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Generates a disease-relevant system for modeling dendritic cell responses in tumor immunity contexts.
- Operational Value: Supports preclinical evaluation of immunomodulatory agents with defined cellular inputs.
- Scientific Value: Facilitates mechanistic de-risking by linking dendritic cell phenotype to functional outcomes in co-culture systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, providing a renewable source of dendritic cells for immune-focused assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on dendritic cell-dependent immune pathways and target engagement.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative cellular outputs for assessing immunomodulatory activity.
- Analytics: Enables flow cytometry-based measurement of CD11c, CD80, and MHC II as maturation readouts.
- Translational Research: Connects in vitro dendritic cell generation to preclinical models of immune activation and tolerance.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable protocol for dendritic cell production across immunology projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation through phenotypically defined dendritic cell inputs.
- Operational Value: Reduces time and cost via 10-minute bone marrow harvest and low cytokine dosing (10 ng/mL GM-CSF/IL-4).
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing reliable dendritic cell models for immunotherapy screening.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of immunomodulatory candidates using standardized immune effector cells.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine bone marrow isolation and aseptic cell culture techniques.
- Depends on access to 6-well plates, hemolytic forceps, and flow cytometry for phenotypic validation.
- Necessitates standardization of cytokine concentration and medium exchange schedule across users.
- Involves adaptation considerations when translating to other mouse strains or genetic backgrounds.
- Limited by the 7–10 day culture window and associated decline in cell viability post-peak.
