Patrones microfluídicos y seguimiento basado en fluorescencia del crecimiento bacteriano unicelular

Comience con un cultivo bacteriano marcado con fluorescencia agregado a un tampón libre de carbono.

Centrifugar para granular las bacterias y desechar el sobrenadante.

Vuelva a suspender el gránulo en un tampón fresco sin carbono que contenga un detergente suave.

La falta de una fuente de carbono detiene el crecimiento, mientras que el detergente evita la formación de grumos y mantiene las células suspendidas.

Cargue la suspensión bacteriana en una jeringa y conéctela a una bomba.

Inyecte la suspensión en la entrada de un chip microfluídico que contiene un canal con trampas incrustadas en el piso.

Retire lentamente el líquido de la salida del canal.

A medida que el líquido retrocede, las fuerzas capilares guían a las bacterias hacia la salida.

En este proceso, las células bacterianas individuales se asientan en las trampas, lo que da como resultado un patrón bacteriano.

Enjuague el canal con un caldo precalentado y rico en nutrientes continuamente.

Las bacterias reanudan el crecimiento y forman microcolonias dentro de las trampas.

Utilice la microscopía de fluorescencia para capturar imágenes de lapso de tiempo y analizar el crecimiento bacteriano en un entorno controlado.

Pipetear un mililitro de medio MOPS en un vial de centrífuga y añadir 10 microlitros de fosfato potásico 0,132 molar.

Alícuotas 100 microlitros del cultivo nocturno en el vial de centrífuga y centrifugue el cultivo a 2.300 veces g durante dos minutos. Deseche suavemente el sobrenadante para volver a suspender el sedimento en un mililitro de medio MOPS fresco con 0,015% de Tween 20 y 0,01% de fosfato de potasio y cargue la suspensión bacteriana en una jeringa de un mililitro. Para asegurar la jeringa y la conexión del tubo, inserte directamente una aguja en el tubo.

Ahora monte la jeringa en la bomba de jeringa e inyecte la suspensión en el chip microfluídico a través de la entrada ubicada en la parte aguas arriba del canal hasta que la suspensión cubra la región de la plantilla con trampas. Ajuste la bomba de jeringa a un caudal de 0,07 a 0,2 microlitros por minuto para extraer la suspensión bacteriana y monitorear el proceso de modelado a través del software del microscopio. Una vez que la plantilla se haya modelado con células, aumente el caudal de extracción para vaciar rápidamente el canal microfluídico y enjuagarlo con LB fresco que se desgasificó previamente durante al menos 30 minutos y se precalentó a 30 grados Celsius.

Ahora ajuste la bomba de jeringa a un caudal de dos microlitros por minuto para enjuagar suavemente el canal. Una vez que se haya llenado el canal, vuelva a aumentar el caudal. Adquiera imágenes de bacterias en crecimiento con el aumento y el intervalo de tiempo deseados.