Identificación de las pequeñas proteínas de unión a la molécula-celular en un entorno nativo de Células vivas marcado por fotoafinidad

Describimos aquí un método para la identificación de proteínas de unión a moléculas pequeñas utilizando el marcaje de fotoafinidad. La ventaja de esta técnica es que la unión y el marcaje covalente de las proteínas diana se producen dentro del entorno celular vivo, lo que elimina el riesgo de alterar la estructura de la proteína nativa y las condiciones de unión durante la lisis celular.

El objetivo general de este procedimiento es identificar las proteínas de unión de moléculas pequeñas mediante el uso de una sonda de fotoafinidad, que puede unirse a su objetivo en células vivas, permitiendo el posterior aislamiento e identificación del objetivo. Este método se puede utilizar para dilucidar el mecanismo molecular de acción de fármacos u otras moléculas pequeñas. La principal ventaja de esta técnica es que la unión y el marcaje covalente de las proteínas diana se producen dentro del entorno celular nativo, lo que elimina el riesgo de alterar la estructura de la proteína nativa y las condiciones de unión durante la lisis celular.

Comience este procedimiento, preparando placas estériles de cultivo celular de seis centímetros, para el número de muestras deseado. Por lo general, se usa un plato de células por condición de tratamiento. Se prepararán tres placas de células para esta demostración, y el control negativo con DMSO solamente, marcado como D, solo tratamiento con sonda, etiquetado como P y sonda más competidor, etiquetado C.To cada placa de cultivo, agregue 3,5 millones de células T HEK 293 en cuatro mililitros de medio de cultivo.

Incuba las células durante la noche. Antes de tratar las células, pre-alícuota los medicamentos necesarios en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Para el pretratamiento de la competencia, agregue cuatro microlitros de DMSO a cada uno de los dos tubos, y cuatro microlitros de 10 milimolares competidores a un tubo.

Para el tratamiento de la sonda, agregue 16 microlitros de DMSO a un tubo y 16 microlitros de sonda de fotoafinidad de 15 micromolares a cada uno de los dos tubos. Coloque las placas de cultivo celular en la campana de cultivo celular para la adición de los medicamentos prealícuidos. Aspire un mililitro de medio de cultivo de la placa de tratamiento de la competencia, transfiéralo al tubo de microcentrífuga que contiene el competidor prealícuota y vuelva a suspender el medicamento en el medio.

Agregue suavemente el medio y la mezcla de medicamentos gota a gota nuevamente al plato. De la misma manera, agregue DMSO tanto a la placa de control negativo como a la placa de sonda. Regrese los platos a la incubadora durante 30 minutos.

Después de 30 minutos, lleve los platos a la campana de cultivo y atenúe las luces. Agregue el DMSO prealícuota a la placa de control negativo y la sonda a la sonda y a las antenas de competencia. Regrese los platos a la incubadora durante una hora.

Después de una hora, coloque los platos sobre hielo. Lave las celdas de cada plato suavemente con cinco mililitros de PBS helado para eliminar el exceso de sonda. Vuelva a cubrir las celdas con cuatro mililitros de PBS helado.

Coloque un plato de células, centrado tres centímetros debajo de la lámpara UV encima de una bolsa de hielo, para minimizar el calentamiento de la lámpara, e irradie durante tres minutos. Retira el plato y colócalo sobre hielo. De esta manera, irradie todas las muestras.

Después de la irradiación de todas las muestras, aspire el PBS de las células y agregue 200 microlitros de PBS helado con inhibidores de la proteasa a cada placa. Separe las celdas del plato con un raspador de goma y transfiéralas a tubos de microcentrífuga preetiquetados en hielo. Añadir SDS a cada muestra hasta una concentración final del 0,4%Lisar las células sonicando la suspensión durante 10 pulsos, incubando en hielo durante un minuto y, a continuación, sonicando durante otros 10 pulsos.

Hervir las muestras en un bloque de calor a 95 grados centígrados durante cinco minutos para completar la lisis celular y desnaturalizar todas las proteínas. Después de medir la concentración de proteínas en cada muestra, como se describe en el protocolo de texto, normalice la concentración de proteínas a 2,5 miligramos por mililitro, agregando PBS PH 8,5 más 0,4% SDS según sea necesario. Para comenzar este procedimiento, transfiera 40 microlitros de cada lisado celular, preparado en el segmento anterior a un nuevo tubo de microcentrífuga.

Agregue los siguientes reactivos en este orden, 0,2 microlitros de harina-azida, 0,58 microlitros de TCEP y 3,38 microlitros de TBTA. Vórtice para mezclar. Añadir 1,14 microlitros de sulfato de cobre pentahidratado para iniciar la reacción.

Agite brevemente e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos en la oscuridad. Agregue 50 microlitros de tampón de muestra SDS 2X para apagar la reacción. Coloque las muestras en un gel SDS-PAGE y, cuando el frente del tinte haya llegado al final del gel, continúe ejecutando el gel durante cinco minutos adicionales para asegurarse de que todo el exceso de harina-azida sin reaccionar haya salido completamente del gel.

Después de lavar todo el exceso de harina-azida, coloque el gel en una placa de vidrio y escanee el gel con un escáner de gel fluorescente, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para la fijación de una etiqueta de biotina, utilice la cantidad máxima de lisados celulares después de la normalización de la proteína, de modo que todas las muestras tengan el mismo volumen. Aclare previamente los lisados agregando cada muestra a un nuevo tubo, que contiene 50 microlitros de perlas de estreptavidina agarosa de alta capacidad prelavadas.

Incubar durante una hora a cuatro grados centígrados con rotación. Granular las perlas por centrifugación. Retire el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga en hielo y deseche las perlas.

Por cada 500 microlitros de lisado, agregue los siguientes reactivos, 1,38 microlitros de biotina-azida, 5,5 microlitros de TCEP y 32,5 microlitros de TBTA. Vórtice para mezclar. Añadir 11 microlitros de sulfato de cobre pentahidratado por cada 500 microlitros de lisado y vórtice brevemente.

Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Agregue cuatro volúmenes de muestra de acetona, enfriados a 20 grados Celsius, agite las muestras e incube durante la noche a 80 grados Celsius, para precipitar completamente las proteínas y eliminar la biotina-azida sin reaccionar. Al día siguiente, centrifugar las muestras a 17.000 x g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados para granular las proteínas precipitadas.

Aspirar completamente el sobrenadante, añadir 150 microlitros de PBS PH 7,4 y 1%SDS a cada muestra, y resoluabilizar las proteínas por sonicación. Agregue 600 microlitros de PBS a cada muestra, para diluir la concentración de SDS al 0.2%, luego agregue la muestra a un nuevo tubo que contenga 30 microlitros de perlas de estreptavidina agarosa de alta capacidad prelavadas. Incubar durante una hora a cuatro grados centígrados con rotación.

Después de una hora, granule las perlas por centrifugación a 1000 x g durante tres minutos. Aspire y deseche el sobrenadante, que contiene proteínas no unidas. Agregue un mililitro de tampón de lavado a las perlas e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente con rotación.

Centrifugar, desechar el sobrenadante y volver a lavar con tampón de lavado. Después del lavado final, aspire completamente el tampón de lavado de las perlas y agregue 30 microlitros de tampón de muestra 2X SDS. Incubar durante cinco minutos en un bloque térmico a 95 grados centígrados, para liberar las proteínas de las perlas.

Centrifugar las perlas a 13000 x g a temperatura ambiente durante un minuto. Pipetee cuidadosamente el tampón de muestra, que contiene proteínas de las perlas, para SDS-PAGE. La visualización de las proteínas después del marcaje con la etiqueta fluorescente se ilustra mediante este gel fluorescente escaneado.

La banda principal de la proteína de unión específica, a aproximadamente 35 kilodaltons, solo está presente en el carril de la sonda y es eliminada por el exceso de compuesto padre. La misma banda de 35 kilodalton se visualizó mediante tinción de plata después de la extracción de biotina, y posteriormente se identificó por espectrometría de masas como la proteína de membrana VDAC1. La identidad de la proteína se validó aún más, utilizando un anticuerpo específico para VDAC1.

La señal está presente en el carril de sonda y disminuye en el carril de competencia. Incluir la fracción de entrada, asegura que el anticuerpo funcione y la proteína de interés pueda ser detectada en el lisado. El ligero aumento en el peso molecular de las muestras pulldown se debe a la sonda colocada codiciosamente.

Se ilustran las consecuencias de no realizar correctamente ciertos pasos del protocolo. La eliminación incompleta del exceso de harina-azida da como resultado grandes manchas negras en el fondo del gel fluorescente escaneado, mientras que la limpieza previa insuficiente de los lisados o el lavado de las perlas dan como resultado un gel teñido de plata con una tinción de fondo muy alta. De principio a fin, el experimento pulldown tarda de dos a tres días en completarse.

Una vez que la proteína diana ha sido aislada e identificada por espectrometría de masas o Western blot, se deben realizar más experimentos de validación específicos de la diana para evaluar la relevancia de la diana para el fenotipo inducido por el fármaco.