Name: Split-BioID: Análisis proteómico de complejos de proteínas específicos de contexto en su entorno celular nativo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-20T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Aprende el protocolo split-BioID para analizar complejos proteicos específicos de contexto en células vivas mediante biotinilación dependiente de proximidad. Esta técnica permite identificar interacciones proteicas con alta resolución en su entorno celular nativo.

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Este trabajo fue financiado por el Consejo de investigación alemán (DFG) a través de la iniciativa de excelencia alemán (CellNetworks DFG-EXC 81) y un financiamiento parcial por el centro de investigación en colaboración SFB638.

<ol><li>Scott, D. E., Bayly, A. R., Abell, C., Skidmore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecules%2C+big+targets%3A+drug+discovery+faces+the+protein-protein+interaction+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Small molecules, big targets: drug discovery faces the protein-protein interaction challenge.</a> Nat Rev Drug Discov. 15 (8), 533-550 (2016).</li>
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<li>Udeshi, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+biotin+enable+large-scale+detection+of+biotinylation+sites+on+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Antibodies to biotin enable large-scale detection of biotinylation sites on proteins.</a> Nat Methods. 14 (12), 1167-1170 (2017).</li>
<li>Chapat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cap-binding+protein+4EHP+effects+translation+silencing+by+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Cap-binding protein 4EHP effects translation silencing by microRNAs.</a> P Natl Acad Sci USA. 114 (21), 5425-5430 (2017).</li>
<li>Luker, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+regulated+protein-protein+interactions+revealed+with+firefly+luciferase+complementation+imaging+in+cells+and+living+animals%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Kinetics of regulated protein-protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals.</a> P Natl Acad Sci USA. 101 (33), 12288-12293 (2004).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El procedimiento describe cómo clonar genes de interés en split-BioID plásmidos probar la Biotinilación inducida por la interacción y aislar las proteínas biotiniladas para el análisis de espectrometría de masas. Aquí describimos un procedimiento basado en la transfección transitoria. Mientras que la expresión de las proteínas de fusión puede ser afinada por la cantidad de dox añadido al medio, transitorios de la transfección pueden conducir a la expresión de la proteína no homogéneo con algunas células que sobreexpresan groseramente las proteínas de fusión comparado con el endógeno contrapartes. Esto puede conducir a distorsiones de la interactomes correspondiente y a PPI que no reflejan fielmente las interacciones que implican las proteínas endógenas. Así es generalmente recomendable para construir líneas celulares estables una vez BioID split se ha establecido con el sistema transitorio. La plásmidos son compatible con el sistema de recombinación mediada por el Flp y coloque ambos genes de interés en la regulación de un mismo elemento sensible al TTE. Si es necesario y cuando se usa con compatible de células de mamífero, que permiten la fácil creación de líneas celulares inducibles estable. Por ejemplo, utilizamos la línea HeLa-EM2-11 que expresa el activador de transcripción activado por tetraciclina rtTA y un único locus genómico targetable de que expresión génica mediada por la tetraciclina puede ser bien regulado12. Usando esta línea celular y recombinación mediada por Flp, líneas celulares estables que contienen solamente una copia del transgén pueden obtenerse dentro de dos o tres semanas. Alternativamente, uno puede usar técnicas actuales de la edición del genoma para introducir los fragmentos de BirA * en los loci genómicos nativos de los genes de interés.
Como en cualquier análisis que se basa en la selección de una proteína, es necesario considerar si la proteína de fusión resultante es funcional. Los datos disponibles en que las proteínas de interés fueron etiquetadas (por ejemplo GFP para estudios por imágenes) y funcionalmente probados son útiles decidir si los BirA * fragmentos clonados aguas arriba o aguas abajo los genes de interés. Si estos datos no están disponibles, uno debe probar N-terminal o con la etiqueta proteínas C-terminal en un análisis funcional. Por ejemplo, la actividad de las proteínas de fusión se puede probar en una línea celular en el cual la proteína endógena ha sido golpeado-hacia fuera y en comparación con la situación de tipo salvaje. Si las proteínas de interés toleran ambas etiquetas N - y C-terminal, ambos deben analizarse. De hecho, en experimentos BioID, la orientación de la proteína de fusión puede influir en la eficacia del etiquetado22. Además, hemos observado al aplicar BioID split a un par de proteínas, que de las dos proteínas se anexa al ya sea el NBirA * o CBirA * fragmento también influencia la eficacia del etiquetado9. En el split-BioID plásmidos, lo 16 aminoácidos largo glicina/serina rico enlazadores acoplamiento de las proteínas de interés en los BirA * fragmentos fueron tomadas de otra PCA23 y trabajó para nosotros todas las proteínas interactúan hemos probado hasta ahora. Sin embargo, uno debe considerar que algunos pares de proteínas podrían funcionar mejor con enlazadores más cortos o más largo. De la nota final, un ensayo fue descrito por el Bollen grupo24. En este ensayo, BirA * se divide en otro sitio (e140 con/Q141) que el nuestro (E256/G257). Hemos probado ambos split BioID sabores por lado y encontró que E256/G257, descrito en el presente Protocolo, conduce a la reactivación más fuerte cuando junto a dos proteínas de interacción9.
Una desventaja general de este método es la lenta velocidad de etiquetado. Por lo general, tiempo de incubación de 6 a 24 h con la biotina es necesaria para obtener Biotinilación apreciable6, imposibilitando el uso de esta técnica para estudiar la dinámica remodelación de complejos de la proteína. Mientras que este ensayo aborda parcialmente esta advertencia sólo es activado cuando interactúan dos proteínas, la lenta velocidad de etiquetado imposibilita su uso para el estudio de respuesta a procesos muy dinámicos o para analizar proteínas de corta vida. La peroxidasa ingeniería APEX2 es conocido por promover el etiquetado eficiente de proteínas proximal dentro de 1 minuto3. Un AAC basado en APEX2 así podría abordar las limitaciones de la velocidad de etiquetado lento de ensayos derivados BioID. Un estudio de prueba de principio había descrito tal split APEX2 ensayo25. Sin embargo, aunque una proteína homodimerizing con éxito fue biotinilado, si el ensayo también puede utilizarse para etiquetar e identificar proteínas que alrededor de un par de interacción de proteínas queda por demostrarse. Muy recientemente, evolución dirigida se utiliza para crear TurboID y miniTurbo, dos variantes de la BirA con actividad mejorada que permiten etiquetado mucho más corto tiempo windows, hasta 10 minutos26. Adaptación de split-BioID a estas nuevas variantes más se extenderá el uso de esta técnica a un campo más amplio de aplicaciones.

Como funciones más celulares son realizadas por proteínas que dinámicamente complejos macromoleculares, la identificación de las interacciones proteína-proteína (PPI) es un esfuerzo importante en la investigación biomédica. De hecho, PPI son a menudo desregulado en la enfermedad y representan potenciales dianas terapéuticas1. El más utilizado método para la identificación de PPI es el enfoque de purificación (AP) de afinidad en la que, tras la lisis celular, una proteína de interés específicamente se purifica en una matriz y las proteínas asociadas posteriormente identificadas por espectrometría de masas (MS). AP-MS es un enfoque potente, por lo general no realiza bien en complejos poco solubles de la proteína, interacciones muy transitorias o PPI que requieren una estructura subcelular intacta. Por otra parte, la naturaleza dinámica de las redes PPI, puede complicar la interpretación de los datos como una única proteína es a menudo parte de varios complejos de distintas proteínas.
Recientemente se desarrollaron técnicas de etiquetado de proximidad como BioID2 o3,de APEX24 para abordar algunas de las limitaciones de los enfoques de AP-MS. En BioID, la enzima BirA * (que corresponde a una variante G115R de la enzima de e. coli de tipo salvaje) cataliza la formación de lábil biotinil AMP (bio-AMP) que puede reaccionar con aminas primarias. A diferencia de la enzima de tipo salvaje, que conserva bio-AMP en su centro activo, BirA * libera bio-AMP permitiendo su difusión a su entorno vecino. Por lo tanto, unida a una proteína de interés y expresado en las células, proteínas proximal puede biotinilado dentro de un rango estimado de 10 nm5. Estos marcan proximal proteínas son aisladas por estreptavidina telecine e identificadas por MS. A diferencia de AP-MS, BioID requiere la expresión de una proteína de fusión. Se puede así sólo aplicar a las proteínas cuya función no es obstaculizado por etiquetado. Por otra parte, la velocidad de etiquetado es lenta, por lo general 6-24 h2,6, haciendo difícil la detección de proteínas de vida corta. Sin embargo, comparado con el AP-MS, MS BioID ofrece varias ventajas claves: primero, su captura las interacciones en su entorno celular nativo; proteínas en segundo lugar, el etiquetado, en lugar de complejos montados se aíslan tras la lisis celular; en tercer lugar, jalones de estreptavidina permiten el uso de búferes de desnaturalización y las condiciones de lavado áspero. Por lo tanto, el método es más sensible para detectar transitorios o interacciones débiles7 o interacciones que se producen en un específico y difícil de aislar la estructura subcelular8.
Sin embargo, la mayoría de las proteínas generalmente forman parte de complejos más grandes que puede remodelar según señales de celulares o a la función que debe realizar. Por lo tanto, una sola proteína suele ser parte de varios complejos, correspondientes a distintas unidades funcionales, que implican distintas o superposición de PPI. Ambos enfoques dan un resumen de todas las asociaciones que puede tener una determinada proteína, pero no abordar el contexto de cada PPI. Para aumentar la resolución de este último, hemos diseñado un ensayo de complementación de fragmentos de proteína (ACP) en la cuales dos fragmentos inactivos de BirA * (NBirA *, que contiene el dominio catalítico, y CBirA * que puede ser visto como el dominio de reactivación) puede volver a montar en una enzima activa cuando cerca de dos interactuar las proteínas9. El ensayo resultante de split-BioID enfoca el biotinylation de proximidad dependiente proteínas que montan alrededor de un par de interacción de proteínas y permite así la identificación del contexto ensamblados dependientes de la proteína. Recientemente hemos demostrado el poder de resolución excepcional de split-BioID por resolución de dos complejos de distintas proteínas implicadas en la mediada por miRNA-silenciamiento génico vía9.
En conjunto, en un análisis simple y sencillo, split-BioID permite descubrir y asignar específicamente PPI a unidades funcionales definidas en el cual una determinada proteína es implicado, proporciona que una proteína de interacción adicional de la proteína correspondiente complejo es conocida.

<table><tbody><tr><td>Ácido acético (glacial)</td><td>VWR</td><td>20104.298</td><td>Para fabricar el tampón TAE</td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td>Tome geles de TAE-agarosa para el análisis y la extracción</td></tr><tr><td>de ADN Solución de amoníaco 25% NH3</td><td>Bernd Kraft</td><td>6012</td><td>Para disolver la biotina</td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Sigma</td><td>A9518</td><td>Para seleccionar bacterias transformadas</td></tr><tr><td>Bioruptor plus dispositivo de sonificación</td><td>Diagenode</td><td>B01020001</td><td>Otros dispositivos de sonificación también están bien</td></tr><tr><td>Biotina</td><td>Sigma</td><td>B4639</td><td>Se añade al medio de crecimiento para estimular la biotinilación eficiente</td></tr><tr><td>Fracción V de albúmina sérica bovina Carl</td><td>Roth</td><td>8076</td><td>Se utiliza en tampones Western blot y un estándar de proteínas en los ensayos</td></tr> Bradford <tr><td>Reactivo Bradford Ultra</td><td>Expedeon BFU05L</td><td></td><td>Cualquier otro método/kit para la determinación de proteínas está bien, este reactivo en particular es más tolerante al detergente que otros reactivos Bradford</td></tr><tr><td>Raspadores celulares</td><td>TPP</td><td>99002</td><td>Cualquier otro modelo también está bien</td></tr><tr><td>ClaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0197</td><td>Enzima de restricción para clonar en los plásmidos BioID divididos (fusión NBirA*)</td></tr><tr><td>Medio DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6046</td><td>Si utiliza otra línea celular, utilice el medio de crecimiento óptimo correspondiente</td></tr><tr><td>Kit de minipreparación de ADN</td><td>Sigma</td><td>PLN350</td><td>Cualquier otro kit también está bien</td></tr><tr><td>Doxiciclina</td><td>Applichem</td><td>A2951</td><td>Dox es sensible a la luz</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Applichem</td><td>A2948</td><td>Haga 1M de solución calzada, almacene a -20 & deg; C y utilice siempre</td></tr><tr><td>estreptavidina conjugada DyLight 680</td><td>fresca Thermo scientific</td><td>21848</td><td>para utilizarla con un dispositivo de exploración de Western blot LiCor</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td><td>Invitrogen</td><td>65002</td><td>Las perlas C1 no están recubiertas de BSA, lo que es preferible para aplicaciones posteriores de MS (sin fugas de BSA en la elución final)</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Applichem</td><td>A5097</td><td>Haga un caldo de 500 mM, ajuste el pH a 8 mientras disuelve el polvo de EDTA</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma</td><td>32205</td><td>Haga una solución madre al 70% en la que la doxiciclina se pueda disolver a 10 mg.mL-1</td></tr><tr><td>Fastgene Gel/PCR Kit de extracción de ADN</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-91302</td><td>Cualquier otro kit también está bien</td></tr><tr><td>HCl 37%</td><td>Merck</td><td>1.00317.1000</td><td>Para ajustar el pH de la solución madre de biotina</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth</td><td>6763</td><td>Haga una solución madre de 500 mM, ajuste el pH a 7,4</td></tr><tr><td>Membrana de PVDF Immobilon-FL, 0,45&nbsp; y micro; m</td><td>Millipore</td><td>IPFL00010</td><td>Esta membrana muestra una autofluorescencia mínima cuando se utiliza con un dispositivo de escaneo de Western blot LiCl</td></tr><tr><td></td><td>Gr&uuml; ssing GmbH</td><td>12083</td><td>Hacer una solución madre 5M</td></tr><tr><td>Sistema de imagen Odyssey CLx</td><td>LI-COR</td><td>N/A</td><td>Para escanear membrana Western blot decorada con anticuerpo marcado con fluoróforos</td></tr><tr><td>Polietilenina lineal (PEI)</td><td>Polysciences</td><td>23966-2</td><td>Cualquier otro reactivo de transfección también está bien</td></tr><tr><td>Leche en polvo</td><td>Carl Roth</td><td>T145</td><td>Para bloquear membranas de Western blot</td></tr><tr><td>MluI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3198</td><td>Enzima de restricción para la clonación en plásmidos divididos de BioID (fusión NBirA*)</td></tr><tr><td>Na-desoxicolato</td><td>Sigma</td><td>30970</td><td>Hacer una solución madre al 10% (p/v)</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>31434</td><td>Hacer una solución madre de 5M</td></tr><tr><td>NP-40 (sustituto de Nonidet P40)</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td>Hacer una solución madre al 20% (v/v)</td></tr><tr><td>PacI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0547</td><td>Enzima de restricción para la clonación en plásmidos BioID divididos (fusión CBirA*)</td></tr><tr><td>Tampón de fosfato salino (PBS)</td><td>Sigma</td><td>806552</td><td>Para lavar las células antes de desechar</td></tr><tr><td>PmeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0560</td><td>Enzima de restricción para la clonación en los plásmidos BioID divididos (fusión CBirA*)</td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de proteasa</td><td>Roche 4693132001</td><td></td><td>Añadido al tampón de lisis para prevenir la proteína degradación</td></tr><tr><td>pSF3-Flag-CBir-FRB_Myc-NBir-FKBP</td><td>Addgene</td><td>90003</td><td>Split-BioID plásmido, media la co-expresión de NBirA*-FKBP y CBirA*-FRB, FKBP y FRB pueden ser reemplazados por otros dos ORFs</td></tr><tr><td>pSF3-Flag-CBir-FRB_FKBP-Myc-Nbir</td><td>Addgene</td><td>90004</td><td>Split-BioID plásmido, media la co-expresión de FKBP-NBirA* y CBirA*-FRB, FKBP y FRB pueden ser reemplazados por otros dos ORFs</td></tr><tr><td>pSF3-Flag-FRB-Cbir_ Myc-NBir-FKBP</td><td>Addgene</td><td>90008</td><td>Plásmido Split-BioID, media la coexpresión de NBirA*-FKBP y FRB-CBirA*, FKBP y FRB pueden ser reemplazados por otros dos ORFs</td></tr><tr><td>pSF3-Flag-FRB-Cbir_FKBP-Myc-Nbir</td><td>Addgene</td><td>90009</td><td>Plásmido Split-BioID, media la coexpresión de FKBP-NBirA* y FRB-CBirA*, FKBP y FRB pueden ser reemplazados por otros dos ORFs</td></tr><tr><td>Q5 Kit de PCR de alta fidelidad</td><td>New England Biolabs</td><td>E0555S</td><td>Amplificar la codificación ORF de las proteínas que se van a probar. Cualquier otra ADN polimerasa termoestable está bien.</td></tr><tr><td>Kit de ligadura rápida</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200S</td><td>Para ligar fragmentos de ADN en los plásmidos BioID divididos, cualquier otro sistema de ligadura de ADN está bien.</td></tr><tr><td>Geles prefabricados RunBlue 4-20% SDS</td><td>Expedeon</td><td></td><td>BCG42012 Para usar cuando se procesan muestras para</td></tr><tr>análisis<td>de MS RunBlue LDS Sample Buffer</td><td>Expedeon</td><td>NXB31010</td><td>Tampón de ejecución para los geles prefabricados RunBlue</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>5030</td><td>Se presenta como una solución madre al 20%</td></tr><tr><td>Suero sin tet</td><td>Biowest</td><td>S181T</td><td>Utilizamos suero libre de tet para minimizar la expresión basal de las proteínas de fusión</td></tr><tr><td>Sistema de transferencia Trans-Blot Turbo</td><td>Bio-Rad 1704150</td><td></td><td>Sistema de transferencia Western blot de alta velocidad, cualquier otro sistema de transferencia también está bien</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Carl Roth</td><td>4855</td><td>Hacer soluciones madre de 1M con pH adecuado (7.4 y 8)</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Applichem</td><td>A4975</td><td>Hacer una solución madre al 20% (v/v)</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Carl Roth</td><td>9127</td><td>Utilizado en tampones Western blot, Tween 20 conduce a una alta fluorescencia de fondo y debe omitirse en el paso de bloqueo y último lavado</td></tr></tbody></table>

split-bioid: análisis proteómico de complejos de proteínas específicos de contexto en su entorno celular nativo

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Para complementar la actual purificación de la afinidad (AP) enfoques para la identificación de las interacciones proteína-proteína (PPI), se han introducido las enzimas que permiten el etiquetado de proximidad dependiente de proteínas en células vivas. Una tal enzima, BirA * (utilizado en el enfoque BioID), media el biotinylation de proteínas dentro de un rango de aproximadamente 10 nm. Por lo tanto, cuando unida a una proteína de interés y expresado en las células, permite el etiquetado de proteínas proximal en su ambiente nativo. En contraposición a la AP que se basa en la purificación de complejos de proteína ensambladas, BioID detecta las proteínas que se han marcado dentro de las células no importa si ellos todavía interactúan con la proteína de interés cuando están aislados. Puesto que biotinylates proximal proteínas, uno puede además aprovechar la excepcional afinidad de streptavidin para biotina aislarlos de manera muy eficiente. Mientras BioID realiza mejor que AP para identificación transitoria o interacciones débiles, ambos métodos de espectrometría de masa AP y BioID proporcionan una visión general de todas las interacciones posibles de que una proteína dada puede tener. Sin embargo, no proporcionan información sobre el contexto de cada PPI identificado. De hecho, la mayoría de las proteínas suelen parte de varios complejos, correspondientes a pasos de maduración distintos o diferentes unidades funcionales. Para solucionar esta limitación común de ambos métodos, hemos diseñado un ensayo de complementación de fragmentos de proteína basado en la BirA * enzima. En este ensayo, pueden volver a montar en una enzima activa cuando cerca de dos proteínas de interacción a la que se fusionan dos fragmentos inactivos de la BirA. El análisis de split-BioID resultante así permite el etiquetado de proteínas que se montan alrededor de un par de interacción de proteínas. Siempre estos dos sólo interactúan en un contexto determinado, split-BioID permite el análisis de las unidades funcionales de dependiente del contexto específicos en su entorno celular nativo. Presentamos un protocolo paso a paso para probar y aplicar BioID split a un par de interacción de proteínas.

Para ilustrar cómo funciona este método, los marcos de lectura abierta (ORFs) de las proteínas antes2, TNRC6C y Dicer (todos los involucrados en el vía de silenciamiento del gen mediada por miRNA) se clonaron en split-BioID plásmidos. Antes2 es conocida para interactuar con TNRC6C dentro de un inducido por miRNA silenciamiento complejo (miRISC) que reprime la traducción y estimular el decaimiento del objetivo mRNAs14. Antes de montar el miRISC, antes2 interactuar con Dicer, la enzima que produce miRNAs maduros, dentro de un complejo en el que puede llegar cargado con un miRNA15. Por lo tanto split BioID se aplicó al par antes2/Dicer o el par de antes2/TNRC6C. Para cada par de proteínas probadas, antes2 fue bien fundido a NBirA * o CBirA * utilizar nuestros plásmidos de split-BioID (figura 2), y Dicer y TNRC6C a la correspondiente cognada BirA * fragmento. Además, cada proteína fue fundido a la CBirA y emparejado con un NBirA *-fusión de GFP como control negativo. El resultado en la prueba cuatro iteraciones para cada par de proteínas probadas (tabla 1).
Para probar si BioID split se activa con la interacción del par de proteínas probadas, hemos seguido el esquema representado en la figura 1. La plásmidos fueron transfectada transitoriamente en una línea celular HeLa compatible de tet-sistema. La expresión de las proteínas de fusión fue inducida con doxiciclina (dox) y Biotinilación fue estimulada por agregar biotina exceso al medio de crecimiento. Después de un tiempo de incubación de 20 h con dox y biotina, las células fueron lisadas y analizadas por Western Blot utilizando conjugado estreptavidina para detectar proteínas biotiniladas. En células de mamíferos, dos bandas principales son detectados típicamente por la estreptavidina conjugada en la muestra untransfected (figura 3, estrellas) y corresponden a endógeno biotinilado proteínas (carboxilasas mitocondriales probablemente). Estas dos bandas están presentes en todas las muestras y pueden ser utilizadas convenientemente como controles de carga interna, por lo tanto, la detección de una proteína de limpieza para controlar la carga de cantidades de proteína igual es superflua. Típico de un experimento BioID/split-BioID, las bandas principales adicionales que se pueden observar son las proteínas de fusión que tiene uno mismo-biotinilado. Aunque es vista no hay otra proteína biotinilada, detección de Biotinilación de las proteínas de fusión en esta etapa ya indica que las dos proteínas probadas interactuaron en las células. En el experimento representado en la figura 3, está claro que tener un NBirA *-proteína de fusión antes2 con CBirA * fusiones TNRC6C o Dicer es más eficaz que las combinaciones opuestas en que CBirA *-antes2 está emparejado a las NBirA * fusiones de los otros dos proteínas (figura 3, panel superior, comparar las intensidades de 2 a 3 carriles a carriles 6 y 7). Por otra parte, la activación fue específica como podría activar ninguna de las fusiones CBirA * NBirA *-proteína de la fusión de GFP control a niveles apreciables (figura 3, comparar los carriles 1, 4-5 en el carril 8 que corresponde a las células untransfected). Ya que en los plásmidos, NBirA * tiene una etiqueta de myc y CBirA * tiene una etiqueta de bandera (figura 2), los niveles de expresión de cada proteína de fusión pueden ser analizados con los anticuerpos contra estos dos etiquetas (figura 3, panel inferior).
Cuando se observa la Biotinilación inducida por la interacción, el experimento puede ampliarse, y las proteínas biotiniladas aislaron en granos de estreptavidina acoplado como se indica en el párrafo 4 del Protocolo (figura 4). Al realizar el aislamiento de la primera vez, todos los pasos de la purificación pueden ser analizados por Western Blot (figura 5). Por lo general, vinculante a los granos debe ser casi cuantitativa y prácticamente fugas a través de no deben ser observados en los lavados. Antes de procesar las muestras para espectrometría de masas, se recomienda ejecutar un Western blot para asegurar inducida-Biotinilación trabajado como se esperaba y que las proteínas de fusión fueron expresadas. Es la falta de expresión de las proteínas de fusión debido a la eficiencia de transfección deficiente o defectuosa dox inducción. Si se expresan las proteínas de fusión pero no Biotinilación es observado, compruebe si exceso biotina (50 μM) realmente fue agregada al medio y que la biotina stock aún está activa. Cuando el material eluído se analiza en un gel teñido de Coomassie de la proteína (figura 6), por lo general, la banda más fuerte para ser observado funciona en alrededor de 17 kDa y corresponde a estreptavidina monomérica. También se pueden observar bandas correspondientes a las proteínas endógenas biotinilado y las proteínas de fusión. Suele suprimir la zona del carril de la muestra por encima de la banda de estreptavidina hasta la carga bien (figura 6). La banda suprimida puede ser almacenada en un tubo de 1,5 mL y enviada a un centro de espectrometría de masas. Alternativamente, encuadernadas proteínas también pueden ser digerido por la tripsina en las cuentas de estreptavidina acoplado y los digeridos péptidos eluidos forman la columna. Habitualmente utilizamos el software de MaxQuant16 (usando sobre todo los parámetros por defecto y añadiendo lisina Biotinilación como una posible modificación poste-de translación, ver referencia 9 para más detalles y resultados típicos de MS) para analizar los datos raws de MS y la Perseus suite17 para el análisis estadístico posterior, ambos son software libre. Las muestras normalmente se ejecutan en tres réplicas biológicas. Mediante cuantificación de etiqueta-libre, específicamente las proteínas enriquecidas pueden ser identificadas por las condiciones de control. Para filtrar endógeno biotinilado las proteínas y las proteínas que están etiquetados no específicamente por la enzima BirA *, consideramos sólo las proteínas que se enriquecen significativamente en golpes de seis conjuntos de datos generados con seis proteínas no relacionadas. Además, consideramos sólo hits que se enriquecen por un conjunto de datos BioID split en el que las proteínas de fusión de NBirA * han sido reemplazadas por NBirA *-GFP. Se han propuesto otras estrategias de análisis de datos en particular utilizando isótopos estables de etiquetado con aminoácidos en cultura de célula (SILAC) para proteómica cuantitativa18. Además, se han descrito diversas estrategias para el aislamiento directo de péptidos biotinilados usando una variante de estreptavidina con débil afinidad biotina18, las condiciones de elución especial usando disolventes orgánicos19 o biotina específicos anticuerpos20,21. Mientras que no necesariamente conduce al descubrimiento de más proteínas, la identificación de sitios de Biotinilación añadir más confianza en cuanto a la especificidad de los golpes y es útil cuando a la topología de una interacción.
<img alt="Flujo de trabajo de análisis proteómico: Split-BioID, clonación, transfección, biotinilación, MS, Western blot." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: Resumen del procedimiento split BioID. 1 la proteína interactúa con la proteína 2 como parte del complejo A, o con proteína 3 como parte del complejo B. A prueba específicamente la composición del complejo, split-BioID puede aplicarse a las proteínas 1 y 2. La fotografía del espectrómetro de masas está bajo una licencia Creative Commons Atribución Compartir igual 3.0 Unported y fue descargada de https://commons.wikimedia.org con nombre de archivo de ThermoScientificOrbitrapElite.JPG. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Mapas de plásmidos de edición de genes con sitios de restricción BamHI, MluI, ClaI; Diagrama para clonar configuraciones." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2: cassettes de expresión de la plásmidos de split-BioID. Ofrecemos cuatro plásmidos para realizar las pruebas de todas las combinaciones de NBirA * y CBirA * proteínas de fusión. Los plásmidos y mapas completos están disponibles en addgene.org bajo el número indicado. La plásmidos tienen un elemento sensible al tet (7 x tetO) y puede ser empleado en una línea celular que sea compatible con el sistema de expresión de TTE. También cuenta que en plásmidos todos los ORFs de FKBP y FRB se fusionan a la NBirA * CBirA * fragmentos respectivamente. Estas dos proteínas interactúan sólo en presencia de la rapamicina y por lo tanto, la plásmidos pueden utilizarse para probar rápidamente el sistema de la presencia o ausencia de este químico9. Los sitios de restricción indicada son únicos. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Resultados de electroforesis de proteínas; Análisis de Western blot de Dicer, TNRC6C, Ago2 con anticuerpos." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3: típico Western blot para un experimento de split-BioID. Panel superior: detección de proteínas biotiniladas con estreptavidina marcada fluorescencia. Panel inferior: detección de las proteínas de fusión con los anticuerpos anti-Myc y de anti-FLAG. Se probaron dos pares de proteínas: antes2/TNRC6C y antes2/Dicer. En los carriles 2 y 3, antes2 fue anexa al fragmento de CBirA *. En los carriles 6 y 7, antes2 fue anexado al fragmento de NBirA *. Ninguna señal significativa fue observada cuando cualquiera de las tres proteínas se combinaron con NBirA *-GFP (carriles 1, 4-5). Las estrellas indican las bandas correspondientes a endógeno biotinilado proteínas que pueden servir como controles de carga interna. Esta figura es una adaptación de la figura 5B de Schopp et al. 9 bajo una licencia Creative Commons Atribución 4.0 International. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Flujo de trabajo de purificación celular mediante perlas magnéticas; Resultados de SDS-PAGE; método de análisis de proteínas." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figura 4: Resumen del procedimiento de desconexión de estreptavidina. Se representan pasos importantes para el aislamiento de proteínas biotiniladas para el análisis de espectrometría de masas. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Resultado de la purificación de la proteína SDS-PAGE, interacción estreptavidina conjugada, gel de electroforesis." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Figura 5: típico Western blot para un experimento de telecine estreptavidina. Iguales volúmenes de cada muestra indicado fueron cargadas en un gel de SDS-poliacrilamida. Tras borrar occidental, proteínas biotiniladas fueron detectadas con streptavidin HRP-juntado. Bandas correspondientes a la NBirA-TNRC6C y CBirA *-se indican antes2. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Gel SDS-PAGE, separación de bandas de proteínas, Split-BioID, estreptavidina, marcadores de peso molecular." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig6.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> Figura 6: gel de proteína teñido de Coomassie típica para el análisis de espectrometría de masas. La muestra eluída de granos estreptavidina acoplado fue cargada en un gel de proteínas prefabricados y hasta que la muestra migra 2-3 cm. La banda principal en cerca de 17 kDa es estreptavidina. El área directamente sobre esa banda es suprimido y enviado a un centro de espectrometría de masas. Bandas correspondientes a la NBirA-TNRC6C y CBirA *-se indican antes2. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Muestra de transfección</td>
			<td colspan="3">Condición de prueba</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td colspan="3">NBirA *-protein1 / CBirA *-protein2</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td colspan="3">CBirA *-protein1 / NBirA *-protein2</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td colspan="3">NBirA *-GFP / CBirA *-protein1</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td colspan="3">NBirA *-GFP / CBirA *-protein2</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td colspan="3">no la transfección</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Prueba típicamente condiciones al aplicar BioID split a dos proteínas.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Cartilla de la secuencia</td>
			<td>secuencia de</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer revés de cassette 1 (CBirA * fusión)</td>
			<td>TATACTTTCTAGAGAATAGGAAC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer revés de cassette 2 (NBirA * fusión)</td>
			<td>GTGGTTTGTCCAAACTCATC</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: Secuencia cartillas para el split BioID plásmidos.

Proporcionamos un protocolo paso a paso para split-BioID, un ensayo de complementación de fragmentos de proteína basado en la técnica de etiquetado de proximidad BioID. Activa en la interacción de dos proteínas determinadas, permite el análisis de Proteómica de los complejos de la proteína dependiente de contexto en su entorno celular nativo. El método es simple, rentable y sólo requiere equipo normal de laboratorio.

Split-BioID: Análisis proteómico de complejos de proteínas específicos de contexto en su entorno celular nativo

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

El objetivo general de este procedimiento es sondear la composición de complejos proteicos que se ensamblan específicamente alrededor de un par de proteínas de interés que interactúan utilizando BioID dividido, un ensayo de complementación de fragmentos de proteínas que induce la biotinilación de proteínas dependiente de la proximidad dentro de las células vivas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en biología celular, como cómo los complejos de proteínas se remodelan dinámicamente para regular diferentes funciones celulares. La principal ventaja de esta técnica es que permite la fácil identificación de complejos proteicos específicos del contexto en sus entornos celulares nativos y con muy alta resolución.Para el análisis final de espectrometría de masas, se deben realizar los siguientes pasos en condiciones libres de queratina y todo el material y los reactivos deben estar lo más libres posible de queratina. Después de clonar los ORF de dos proteínas de interés en el plásmido BioID dividido, llevar a cabo una transfección transitoria y luego agregar un medio suplementado con biotina de acuerdo con el protocolo de texto, use PBS para lavar las células dos veces. Agregue 1.5 mililitros de PBS a cada plato y use un raspador para recolectar las células, luego transfiera las celdas para cada condición a un tubo separado de 15 mililitros y haga girar los tubos a 1.200 veces la gravedad y cuatro grados Celsius durante cinco minutos.Retire los sobrenadantes y congele los gránulos en nitrógeno líquido. A continuación, almacene los tubos a menos 80 grados centígrados hasta su posterior procesamiento. Para preparar los lisados celulares, use un mililitro de tampón de lisis RT para resuspender los gránulos.Luego pase las células a través de una aguja de calibre 25 de 10 a 20 veces. A continuación, sonique las muestras. A continuación, añada 100 microlitros de Triton X-100 al 20% por cada 900 microlitros de lisado sonicado recuperado para una concentración final del 2%Añada 2,3 mililitros de Tris de 50 milimolares, pH 7,4, por mililitro de lisado para ajustar la concentración de NaCl a 150 milimolar para unirse a las perlas de estreptavidina.A continuación, distribuya los lisados ajustados en tubos de 1,5 mililitros y centrifugue a 16.000 veces la gravedad y cuatro grados centígrados durante diez minutos. Transfiera los sobrenadantes a un tubo de 15 mililitros y guarde de 50 a 100 microlitros como material de entrada. Para realizar una reducción de estreptavidina, para cada condición transfiera 200 microlitros de suspensión de perlas magnéticas acopladas a estreptavidina a un tubo de 1.5 mililitros.Coloque los tubos en una rejilla magnética y espere aproximadamente un minuto antes de retirar el tampón de almacenamiento. Con un mililitro de tampón de equilibrio, lave las cuentas mezclando suavemente. A continuación, envíe uniformemente las perlas equilibradas en el número necesario de tubos y vuelva a colocarlas en el bastidor magnético.Después de quitar el tampón de equilibrio, vuelva a suspender cada conjunto de cuentas con cantidades iguales de los lisados de celdas correspondientes. A continuación, incubar las muestras a cuatro grados centígrados en una rueda giratoria durante la noche. Al día siguiente, coloque los tubos en una rejilla magnética.Espere hasta que las cuentas se peguen al costado de los tubos y transfiera los sobrenadantes a un tubo de 15 mililitros etiquetado como de flujo. Con 200 microlitros de tampón de lavado, vuelva a suspender las perlas en cada tubo y combine cada conjunto de perlas resuspendidas correspondientes a una condición en tubos de 1,5 mililitros. Use un mililitro de tampón de lavado uno para lavar las cuentas dos veces en una rueda giratoria durante ocho minutos.A continuación, realice dos lavados cada uno para los tampones de lavado dos, tres y cuatro. Para asegurarse de que el tampón de lavado se elimine por completo después del último paso de lavado, después de eliminar la mayor parte del sobrenadante, centrifugar las muestras. A continuación, vuelva a colocarlos en la rejilla magnética y retire el tampón restante.Agregue 30 microlitros de tampón de elución a las perlas, luego incube las muestras a 98 grados Celsius durante quince minutos e inmediatamente mueva los tubos al estante magnético. Transfiera la muestra eluida a un tubo nuevo y almacene los tubos a menos 20 grados centígrados hasta su posterior procesamiento. Para cada muestra de entrada, prepare una muestra PAGE mezclando cantidades iguales de proteína con el volumen apropiado de tampón de carga 3X SDS en un volumen total de 28 microlitros.A continuación, prepare las muestras de PAGE mezclando cinco microlitros de cada muestra de elución con 2,5 microlitros de tampón de carga 3X SDS. Cargue las muestras en un gel de poliacrilamida SDS. A continuación, proceda a la electroforesis y al western blot de acuerdo con el protocolo de texto.Para llevar a cabo el análisis SDS-PAGE para MS, agregue 6,25 microlitros de tampón de muestra 4X a 18,75 microlitros de cada muestra de elución y ejecute las muestras en un gel SDS prefabricado del cuatro al 20% hasta que migren de dos a tres centímetros en el gel. En una placa de Petri de 15 centímetros, tiñe el gel con tinte coloidal Coomassie Brilliant Blue G250. Utilice un bisturí limpio para extirpar todos los carriles de cada muestra, excluyendo la banda de estreptavidina, y transfiera las bandas extirpadas a tubos de 1,5 mililitros para el análisis de EM.Además de las proteínas biotiniladas endógenas identificadas en un experimento BioID, las bandas principales adicionales observadas por Western blot son las proteínas de fusión que se autobiotinilaron, lo que indica que las dos proteínas probadas, en este ejemplo Ago2 y TNRC6C o Ago2 y Dicer interactuaron en las células. Además, los resultados del Western blot indican que tener una proteína de fusión NBirA*Ago2 emparejada con fusiones CBirA* a TNRC6C o Dicer es más eficiente que las combinaciones opuestas en las que CBirA*Ago2 se empareja con fusiones NBirA* de las otras dos proteínas. Además, la activación fue específica, ya que ninguna de las fusiones CBirA* pudo activar la proteína de fusión de control NBirA*GFP a niveles apreciables.Al realizar el aislamiento por primera vez, todos los pasos de la purificación deben analizarse mediante Western blot. Como se ilustra aquí, la unión a las cuentas debe ser casi cuantitativa y prácticamente no se debe observar ninguna fuga en los lavados. Cuando el material eluido se ejecuta en un gel teñido con Coomassie después de la expresión de la proteína y la biotinilación inducida, la banda más fuerte observada corre a unos 17 kilodaltons y corresponde a la estreptavidina monomérica.El área del carril de muestra por encima de la banda de estreptavidina hasta el pocillo de carga generalmente se extirpa para el análisis de MS. Al aplicar este procedimiento a dos proteínas dadas, es importante probar diferentes combinaciones de proteínas de fusión. De hecho, a menudo hemos observado que la eficiencia general de la biotinilación puede depender estrechamente de qué proteína se agrega a los fragmentos de BirA terminal N o C.Es igualmente importante añadir al menos un experimento de BioID dividido de control negativo. Por ejemplo, en un par de proteínas que interactúan y que no están relacionadas con el par de proteínas de interés. Siguiendo este procedimiento y la espectrometría de masas, se debe aplicar un análisis computacional para puntuar los péptidos identificados frente a los experimentos de control negativo.Utilizamos, por ejemplo, el software MaxQuant y Perseus que fueron desarrollados por los laboratorios de Cox y Mann en Múnich, Alemania.

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