Split-BioID: Análisis proteómico de complejos de proteínas específicos de contexto en su entorno celular nativo

El objetivo general de este procedimiento es sondear la composición de complejos proteicos que se ensamblan específicamente alrededor de un par de proteínas de interés que interactúan utilizando BioID dividido, un ensayo de complementación de fragmentos de proteínas que induce la biotinilación de proteínas dependiente de la proximidad dentro de las células vivas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en biología celular, como cómo los complejos de proteínas se remodelan dinámicamente para regular diferentes funciones celulares. La principal ventaja de esta técnica es que permite la fácil identificación de complejos proteicos específicos del contexto en sus entornos celulares nativos y con muy alta resolución.

Para el análisis final de espectrometría de masas, se deben realizar los siguientes pasos en condiciones libres de queratina y todo el material y los reactivos deben estar lo más libres posible de queratina. Después de clonar los ORF de dos proteínas de interés en el plásmido BioID dividido, llevar a cabo una transfección transitoria y luego agregar un medio suplementado con biotina de acuerdo con el protocolo de texto, use PBS para lavar las células dos veces. Agregue 1.5 mililitros de PBS a cada plato y use un raspador para recolectar las células, luego transfiera las celdas para cada condición a un tubo separado de 15 mililitros y haga girar los tubos a 1.200 veces la gravedad y cuatro grados Celsius durante cinco minutos.

Retire los sobrenadantes y congele los gránulos en nitrógeno líquido. A continuación, almacene los tubos a menos 80 grados centígrados hasta su posterior procesamiento. Para preparar los lisados celulares, use un mililitro de tampón de lisis RT para resuspender los gránulos.

Luego pase las células a través de una aguja de calibre 25 de 10 a 20 veces. A continuación, sonique las muestras. A continuación, añada 100 microlitros de Triton X-100 al 20% por cada 900 microlitros de lisado sonicado recuperado para una concentración final del 2%Añada 2,3 mililitros de Tris de 50 milimolares, pH 7,4, por mililitro de lisado para ajustar la concentración de NaCl a 150 milimolar para unirse a las perlas de estreptavidina.

A continuación, distribuya los lisados ajustados en tubos de 1,5 mililitros y centrifugue a 16.000 veces la gravedad y cuatro grados centígrados durante diez minutos. Transfiera los sobrenadantes a un tubo de 15 mililitros y guarde de 50 a 100 microlitros como material de entrada. Para realizar una reducción de estreptavidina, para cada condición transfiera 200 microlitros de suspensión de perlas magnéticas acopladas a estreptavidina a un tubo de 1.5 mililitros.

Coloque los tubos en una rejilla magnética y espere aproximadamente un minuto antes de retirar el tampón de almacenamiento. Con un mililitro de tampón de equilibrio, lave las cuentas mezclando suavemente. A continuación, envíe uniformemente las perlas equilibradas en el número necesario de tubos y vuelva a colocarlas en el bastidor magnético.

Después de quitar el tampón de equilibrio, vuelva a suspender cada conjunto de cuentas con cantidades iguales de los lisados de celdas correspondientes. A continuación, incubar las muestras a cuatro grados centígrados en una rueda giratoria durante la noche. Al día siguiente, coloque los tubos en una rejilla magnética.

Espere hasta que las cuentas se peguen al costado de los tubos y transfiera los sobrenadantes a un tubo de 15 mililitros etiquetado como de flujo. Con 200 microlitros de tampón de lavado, vuelva a suspender las perlas en cada tubo y combine cada conjunto de perlas resuspendidas correspondientes a una condición en tubos de 1,5 mililitros. Use un mililitro de tampón de lavado uno para lavar las cuentas dos veces en una rueda giratoria durante ocho minutos.

A continuación, realice dos lavados cada uno para los tampones de lavado dos, tres y cuatro. Para asegurarse de que el tampón de lavado se elimine por completo después del último paso de lavado, después de eliminar la mayor parte del sobrenadante, centrifugar las muestras. A continuación, vuelva a colocarlos en la rejilla magnética y retire el tampón restante.

Agregue 30 microlitros de tampón de elución a las perlas, luego incube las muestras a 98 grados Celsius durante quince minutos e inmediatamente mueva los tubos al estante magnético. Transfiera la muestra eluida a un tubo nuevo y almacene los tubos a menos 20 grados centígrados hasta su posterior procesamiento. Para cada muestra de entrada, prepare una muestra PAGE mezclando cantidades iguales de proteína con el volumen apropiado de tampón de carga 3X SDS en un volumen total de 28 microlitros.

A continuación, prepare las muestras de PAGE mezclando cinco microlitros de cada muestra de elución con 2,5 microlitros de tampón de carga 3X SDS. Cargue las muestras en un gel de poliacrilamida SDS. A continuación, proceda a la electroforesis y al western blot de acuerdo con el protocolo de texto.

Para llevar a cabo el análisis SDS-PAGE para MS, agregue 6,25 microlitros de tampón de muestra 4X a 18,75 microlitros de cada muestra de elución y ejecute las muestras en un gel SDS prefabricado del cuatro al 20% hasta que migren de dos a tres centímetros en el gel. En una placa de Petri de 15 centímetros, tiñe el gel con tinte coloidal Coomassie Brilliant Blue G250. Utilice un bisturí limpio para extirpar todos los carriles de cada muestra, excluyendo la banda de estreptavidina, y transfiera las bandas extirpadas a tubos de 1,5 mililitros para el análisis de EM.

Además de las proteínas biotiniladas endógenas identificadas en un experimento BioID, las bandas principales adicionales observadas por Western blot son las proteínas de fusión que se autobiotinilaron, lo que indica que las dos proteínas probadas, en este ejemplo Ago2 y TNRC6C o Ago2 y Dicer interactuaron en las células. Además, los resultados del Western blot indican que tener una proteína de fusión NBirA*Ago2 emparejada con fusiones CBirA* a TNRC6C o Dicer es más eficiente que las combinaciones opuestas en las que CBirA*Ago2 se empareja con fusiones NBirA* de las otras dos proteínas. Además, la activación fue específica, ya que ninguna de las fusiones CBirA* pudo activar la proteína de fusión de control NBirA*GFP a niveles apreciables.

Al realizar el aislamiento por primera vez, todos los pasos de la purificación deben analizarse mediante Western blot. Como se ilustra aquí, la unión a las cuentas debe ser casi cuantitativa y prácticamente no se debe observar ninguna fuga en los lavados. Cuando el material eluido se ejecuta en un gel teñido con Coomassie después de la expresión de la proteína y la biotinilación inducida, la banda más fuerte observada corre a unos 17 kilodaltons y corresponde a la estreptavidina monomérica.

El área del carril de muestra por encima de la banda de estreptavidina hasta el pocillo de carga generalmente se extirpa para el análisis de MS. Al aplicar este procedimiento a dos proteínas dadas, es importante probar diferentes combinaciones de proteínas de fusión. De hecho, a menudo hemos observado que la eficiencia general de la biotinilación puede depender estrechamente de qué proteína se agrega a los fragmentos de BirA terminal N o C.

Es igualmente importante añadir al menos un experimento de BioID dividido de control negativo. Por ejemplo, en un par de proteínas que interactúan y que no están relacionadas con el par de proteínas de interés. Siguiendo este procedimiento y la espectrometría de masas, se debe aplicar un análisis computacional para puntuar los péptidos identificados frente a los experimentos de control negativo.

Utilizamos, por ejemplo, el software MaxQuant y Perseus que fueron desarrollados por los laboratorios de Cox y Mann en Múnich, Alemania.