Name: La visualización de las primeras etapas de la fagocitosis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Aprende a visualizar las primeras etapas de la fagocitosis mediante microscopía confocal en células DC 2.4. Este método permite analizar en tiempo real la dinámica de interacción entre patógenos y células hospedadoras.

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Damos las gracias a Wendy salmón y Nicki Watson de la instalación Keck en el Instituto Whitehead del MIT para la formación de imágenes.

1. Preparación de DC2.4 y RAW 264.7 Líneas Celulares NOTA: La línea celular similar a macrófagos RAW 264.7 y la DC2.4 línea de células dendríticas son tanto de origen murino, y se utilizaron las siguientes condiciones para cultivar las células. <ol><li> Crecer células RAW 264.7 en DMEM (medio de Eagle Mínimo de Dulbecco) suplementado con 10% de suero bovino fetal inactivado (FBS) a 37 ° C en un incubador humidificado con 5% de CO 2. </li><li> Se cultivan las células DC2.4 en condiciones similares con la de las células RAW 264.7, salvo el uso del medio RPMI (Roswell Park Memorial Institute) suplementado con L-glutamina en lugar de DMEM. </li></ol> 2. Preparación de conjugados fluorescentes Partículas: Perlas de C. albicans, zimosán, recubiertas de IgG- <ol><li> Cultivo de Candida albicans <ol><li> Inocular C. albicans cepa SC5314 de un stock de glicerol congelado en 25 ml de YPD suplementado con Uri (2% Bacto-peptona, 1%extracto de levadura, 2% de glucosa y 80 mg / ml uridina) durante la noche a 30 ° C. NOTA: Evitar crecer el cultivo de Candida más de una DO 600 de 12. </li><li> Tomar 1 ml de la C. albicans y girar hacia abajo a 2000 xg durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Aspirar el sobrenadante y volver a suspender el sedimento con 1 ml de PBS. </li><li> Recoger el precipitado por centrifugación a 2000 xg durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Repita el paso 2.1.4. </li><li> Calcular la multiplicidad de infección (MOI) de C. albicans en relación con el número de fagocitos y proceder con el ensayo de fagocitosis tal como se describe en la sección 3. Un OD 600 de 1 es equivalente a 2,5 x 10 7 Candida albicans por 1 ml. NOTA: Generación de Candida-BFP se describe en la referencia 13. </li></ol></li><li> Preparación de zimosán y perlas recubiertas con IgG NOTA: Zymosan es una que contiene β-glucano-preparación de partículas de hidratos de carbono por hongos que deriva de Saccharomyces cerevisiae. Zymosan se conoce para evocar señales inflamatorias en los macrófagos y las células dendríticas, y se ha utilizado ampliamente en estudios de fagocitosis 13, 14, 15. <ol><li> En resumen vórtice del tubo que contiene el material en partículas, y la alícuota una cantidad suficiente para un experimento en un tubo de 1,5 ml. NOTA: Por lo general usamos relación 1:10 (para una celda, añadir 10 zymosan partículas o perlas recubiertas con IgG). </li><li> Añadir 1 ml de PBS enfriado en hielo, y recoger las partículas por centrifugación durante 1 min a 10.000 x g. </li><li> Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en PBS 1 ml de hielo-frío. </li><li> Repita los pasos 2.2.2-2.2.3 NOTA: Continúe con el punto 2.2.5 o almacenar el tubo a 4 ° C hasta su uso. </li><li> Sonicar las partículas de 10 seg en baño de ultrasonido ultrasónico (120 V, 50 a 60 kHz) con el fin de evitar unany la agregación de partículas. </li></ol></li></ol> 3. La fagocitosis NOTA: La fagocitosis es un proceso complejo que se inicia con la unión de las partículas en la superficie celular de los fagocitos a través de la interacción de PRRS con ligandos sobre la superficie de la partícula. La unión es seguido por el montaje de actina y sus proteínas asociadas en el sitio de contacto, y la formación de una taza de fagocitosis. El desmontaje posterior actina se produce en el fagosoma y da lugar a la inmersión completa de las partículas. A continuación se describen las diferentes etapas de la fagocitosis. <ol><li> Ensayo de unión NOTA: La finalidad de este experimento es para controlar la primera etapa de la fagocitosis que implica la interacción entre los ligandos sobre las partículas diana y los receptores en los fagocitos. <ol><li> Semillas de unos 5 x 10 4 células en un portaobjetos de cámara, de modo que son 60 a 70% de confluencia en el momento del experimento. Alterntivamente, células de la placa sobre cubreobjetos (en formato de 24 ó 12 pocillos) o placas de 96 pocillos con fondo de cristal. Se incuban las células durante la noche a 37 ° C incubadora humidificada con 5% de CO 2. NOTA: Las células pueden ser contados utilizando hemocitómetro o una técnica similar. </li><li> Colocar el portaobjetos de cámara (o placa) a 10 ° C durante 10 min. </li><li> Retire con cuidado el medio de cada pocillo usando una pipeta o un aspirador. PRECAUCIÓN: Realice este paso cuidadosamente como cada pocillo de un sistema de cámaras cubreobjetos es pequeño; es fácil de perturbar las células con la punta de una pipeta o un fuerte flujo de aire de un aspirador. </li><li> Mezclar las partículas marcadas con fluorescencia con un medio de cultivo celular (preparado como se ha descrito anteriormente). Añadir Candida -BFP (a una MOI de 10), con fluorescencia perlas-conejo-zymosan conjugado o látex IgG-FITC (10 partículas por célula) a las células. Utilizar un volumen final de 200 l medios de comunicación para una cámara bien para asegurar que todas las células están cubiertos. </li><li> Girar por el tobogán de cámara en 277xg durante 3 min a 10 ° C. NOTA: Este paso de centrifugación ayuda a aumentar el contacto entre las partículas y las células, y se sincroniza el proceso de unión. </li><li> Transferir inmediatamente la diapositiva cámara a un incubador humidificado 37 ° C con 5% de CO2 durante 5 min. </li><li> Retire la diapositiva cámara de la incubadora y aspirar los medios de comunicación. </li><li> Se lavan las células 3 veces con PBS helado. NOTA: Compruebe la presencia de partículas sueltas con un microscopio óptico y se lava varias veces con PBS, si es necesario. Es esencial para eliminar las partículas no unidas del pozo para minimizar el ruido de fondo durante el análisis. </li><li> Fijar las células mediante la adición de 500 l 4% de paraformaldehído (PFA) diluido en PBS mediante incubación durante 30 min a temperatura ambiente. PRECAUCIÓN: Este paso requiere el uso de PFA al 4%, que es altamente tóxico, corrosivo, y carcinógeno potencial. Adecuada se debe tener cuidado al usar este líquido. Además, proteja las muestras de la luz. </li><li&gt; Lavar las células mediante la adición de 500 l de PBS en la cámara y aspirar la solución suavemente. </li><li> 3.1.9 Repita el paso dos veces. NOTA: En este paso, vuelva a llenar cada vial inmediatamente después de retirar el PBS anterior. </li><li> Detener la fijación mediante la incubación con 500 l de 50 mM NH 4 Cl en PBS durante 10 min. </li><li> Lavar las células dos veces con PBS como se describe en el paso 3.1.10. </li><li> Permeabilizar las células mediante la adición de 250 l de tampón de unión (0,1% de saponina, 0,2% de BSA en PBS) durante 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Manchas F-actina mediante la adición de faloidina conjugada con fluorescencia (diluido 1: 500 en tampón de unión). Se incuban las células durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Lavar las células tres veces con PBS como se describe en el paso 3.1.10. </li><li> Capturar imágenes utilizando un microscopio confocal (objetivo 63X y 402 nm y 488 nm láser) y analizar las imágenes usando ImageJ 16. NOTA: La unión Una partícula éxito se caracteriza por la presencia de un cu fagocíticap en el lugar donde el contacto de partículas de la célula fagocítica (Figura 1). Vea el paso 3.2.5. </li></ol></li><li> La fagocitosis Ensayo de absorción NOTA: Este experimento está diseñado para controlar la internalización completa de las partículas marcadas con fluorescencia por los fagocitos usando microscopía confocal (Figura 2). <ol><li> Semillas de unos 5 x 10 4 células en un portaobjetos de cámara, de modo que son 60 a 70% de confluencia en el momento del experimento. Alternativamente, las células de la placa sobre cubreobjetos (en formato de 24 o 12 pocillos) o placas de 96 pocillos con fondo de vidrio. Se incuban las células durante la noche a 37 ° C incubadora humidificada con 5% de CO 2. NOTA: Las células pueden ser contados utilizando hemocitómetro o una técnica similar. </li><li> Mantenga los portaobjetos de cámara (o placa) a 10 ° C durante 10 minutos. NOTA: Enfriamiento es necesario con el fin de bloquear la endocitosis, así como la fagocitosis no deseado y, posteriormente, tener un fagocitosis sincronizada. </li><li> perfORM pasos de 3.1.3 a 3.1.5 </li><li> La transferencia de la diapositiva cámara a un 37 ° C incubadora humidificada con 5% de CO 2, y se incuba durante diferentes puntos de tiempo. Fijar las células después de la infección 30, 60 y 90 minutos después. Observe C. albicans se empiezan a formar hifas después de la infección de 60 minutos; fagocitos comienzan a mostrar la muerte celular (pyroptosis) después de 90 min 8. NOTA: Esta es una recomendación, y la optimización es esencial en función del tipo de células y el material en partículas utilizado. </li><li> Realice los pasos de 3.1.7 a 3.1.15. Analizar las imágenes usando ImageJ 16. NOTA: una absorción exitosa se caracteriza por una internalización completa de un material en partículas en el interior del citoplasma de un fagocito (Figura 2). La tinción de los fagocitos con marcador de superficie celular tales como faloidina ayuda a delinear el contorno de las células. También es esencial para llevar a cabo z-pilas con el fin de determinar si el material en partículas se une a la superficie celular o completely internalizado. </li></ol></li><li> Imágenes en vivo de la fagocitosis NOTA: En este protocolo se describe el uso de la microscopía confocal para capturar las diferentes etapas de la fagocitosis utilizando zymosan fluorescente conjugado. Nosotros usamos la línea de células dendríticas DC2.4 que expresa de forma estable etiquetada con mCherry F-actina 8, un biosensor que muestra la distribución de actina filamentosa en las células vivas. Desde la fagocitosis es un proceso actina impulsado por la formación de imágenes en vivo en esta celda no sólo nos permite capturar el movimiento y la dinámica de la red de F-actina, sino también para visualizar los diferentes eventos fagocíticas dentro de las células vivas (Figura 3, Película 1). <ol><li> Semillas de unos 5 x 10 4 células en un portaobjetos de cámara, a una concentración de modo que son 60 a 70% de confluencia en el momento del experimento. Se incuban las células durante la noche a 37 ° C incubadora humidificada con 5% de CO 2. NOTA: Las células pueden ser contados utilizando hemocitómetro o unatécnica similar. </li><li> Mantener los portaobjetos de cámara en hielo durante 10 min. NOTA: Enfriamiento es necesario con el fin de bloquear la absorción no deseada, y tener una fagocitosis sincronizada. </li><li> Realice los pasos de 3.1.3 a 3.1.5 </li><li> Pre-calentar la platina del microscopio a 37 ° C y equilibrar la cámara con 5% de CO 2. Espere 30 a 45 min para la temperatura y el CO 2 para estabilizar antes de iniciar la formación de imágenes. NOTA: Dado que las emisiones de CO 2 y los niveles de temperatura son críticos para la fagocitosis, es importante para encender el calentador de microscopio antes del experimento para equilibrar la cámara ambiental. </li><li> Colocar el portaobjetos cámara que contiene las células en el recinto microscopio incubador equilibrado a 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Realizar las imágenes en directo 17, 18. NOTA: Los ajustes de la potencia del láser (ganancia, agujero de alfiler, etc.) puede variar dependiendo del tipo de THe microscopio y la sonda fluorescente usada. Por lo tanto, se recomienda consultar el manual del microscopio para la condición óptima para su imágenes en vivo 17,18. <ol><li> Utilice microscopio láser confocal de barrido (y el software asociado) para imágenes en vivo. Utilice petróleo objetivo 63X 1.4NA con un agujero de alfiler de 1-1.1 unidades Airy. </li><li> Para iniciar la proyección de imagen, se utiliza el campo brillante para encontrar una región representativa en la diapositiva cámara. A continuación, seleccione el campo haciendo clic en la opción de posición sobre el software. Para detectar las buenas prácticas agrarias en la pista 1 utiliza el conjunto de filtros de 488 nm láser con un divisor de haz a 582 nm, para detectar longitudes de onda entre 488 y 582 nm. </li><li> En la pista 2 seleccionar un conjunto de filtros óptima para mCherry (RFP), utilizando un divisor de haz a 578 nm y la detección de longitudes de onda entre 578 y 600 nm. Utilice 488 nm y 578 nm con láseres de potencia del láser 50% y una salida de ganancia de 600-700. Obtener imágenes cada 30 seg durante un total de 90 min. </li></ol></li></ol></li></ol>

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Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

fagocitos profesionales, como los macrófagos y las células dendríticas, envolver y eliminar los patógenos invasores por lo tanto haciendo la fagocitosis un componente importante del sistema de defensa del huésped. Durante este proceso se someten a los fagocitos extensa reorganización de la membrana y la reorganización del citoesqueleto en su superficie celular 8, 19, 20. Para entender mejor este proceso dinámico, la visualizaci...

A pesar de la continua exposición a patógenos tales como bacterias, virus y hongos, nuestro cuerpo está bien equipado con mecanismo inmunológico que proporciona protección frente a la infección. El sistema inmune innato es la primera línea de defensa contra los patógenos invasores y se basa principalmente en las células fagocíticas que reconocen y se internalizan objetivos extranjeros. La fagocitosis es un proceso celular evolutivamente conservada que abarca la inmersión de las partículas no deseadas de más de 0,5 micras. Las células fagocíticas expresan una amplia gama de receptores inmunes (también conocidos como receptores de reconocimiento de patrón, PRRS) en la superficie celular que les permiten reconocer patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs) presentes en los patógenos antes de la inmersión 3. La unión de patógenos es seguido por la agrupación de receptores en la superficie celular y provoca la formación de una taza fagocítica. Esto da lugar a la remodelación de la membrana actina guiado que sobresale alrededorel objetivo, finalmente, que la envuelve y pellizcos-off para formar una vacuola phagosomal discreta 2, 5. El fagosoma continuación, madura y se acidifica mediante fusión posterior con los endosomas tardíos y lisosomas que forma fagolisosómica 6. Aunque se describe como la fagocitosis mediada por el receptor de eventos y actina impulsado, este proceso también se basa en la modificación espacial-temporal de los lípidos que componen la membrana de plasma, tales como fosfoinosítidos (IP) y esfingolípidos 7, 8. Mientras que la polimerización de actina es dictada por una acumulación local de fosfoinositol-4,5-bifosfato (PI (4,5) P 2) en la base de la copa fagocítica, despolimerización de la actina depende de la conversión de (PI (4,5) P 2 a fosfoinositol-3,4,5-bifosfato (PI (3,4,5) P 3) 3, 9. Ambas modificacionesson esenciales ya que el primero lleva a la extensión de los seudópodos alrededor del objetivo y éste permite el hundimiento de las partículas en el citosol de la fagocitos 10. Las células que tienen la capacidad de fagocitar o son fagocitos profesionales, como macrófagos / monocitos, granulocitos / neutrófilos, y células dendríticas (DC) o fagocitos no profesionales, tales como fibroblastos y células epiteliales 11. La fagocitosis realizada por todos los fagocitos juega un papel central en el mantenimiento del tejido y remodelación, mientras que la fagocitosis realizada por fagocitos profesionales se encarga de la coordinación de la respuesta inmune innata y adaptativa frente a los patógenos. fagocitos profesionales no sólo engullen y matan el patógeno, sino también los antígenos presentes en las células linfoides del sistema inmune adaptativo. Esto contribuye a la liberación de citoquinas pro-inflamatorias y para la participación de las células linfoides, por lo tanto, conduce ael bloqueo con éxito de la infección 12. técnicas bioquímicas convencionales han sido fundamentales en la obtención de conocimientos sobre el mecanismo molecular de diferentes procesos celulares durante la fagocitosis, tales como las modificaciones posteriores a la traducción y diversas asociaciones de alta afinidad entre proteínas. Sin embargo, es difícil obtener información con respecto a la dinámica espacial y temporal de los acontecimientos fagocíticas utilizando los métodos bioquímicos convencionales. imágenes de células vivas no sólo nos permite supervisar eventos celulares en cuenta la sensibilidad de tiempo sino que también nos permite obtener información a nivel de células individuales. Aquí se describe un método para investigar las diferentes etapas de la fagocitosis, así como analizar todo el proceso espaciotemporalmente usando microscopía confocal.

<table><tbody><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>AppliChem</td><td>A1108</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Tecnología de señalización celular&nbsp;</td><td>9998</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol, dilactato)</td><td>ThermoFisher</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>ThermoFisher</td><td>BP-231-1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco' s Águila Mínima' s medio)</td><td>Gibco</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1x (Solución salina tamponada con fosfato)</td><td>Corning cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12003C</td><td></td></tr><tr><td>Perlas de látex recubiertas de IgG acopladas a FITC</td><td>Cayman</td><td>500290</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina 200 mM (100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>solución de paraformaldehído (4% en PBS)</td><td>Affymetrix</td><td>19943 1 LT</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (10,000 U/ml)</td><td>ThermoFisher</td><td><a href="https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-penicillin-streptomycin-10-000-u-ml-3/15140122">15-140-122</a></td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>RAW 264.7 celdas</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>RPMI (Roswell Park Memorial Institute)</td><td>Gibco</td><td>61870</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7900</td><td></td></tr><tr><td>Solución de azul de tripano (0,4 % (p/v) en PBS)</td><td>Corning cellgro</td><td>MT25900CI</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (1x) (0,05 %)</td><td>ThermoFisher</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 Surfact-Amps Solución detergente</td><td>ThermoFisher</td><td>&nbsp; 85114</td><td></td></tr><tr><td>Zymosan-Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher</td><td>Z23374</td><td></td></tr><tr><td>Chambered 1.0 Borosilicato Sistema de cubreobjetos (8 cámaras)</td><td>ThermoFisher</td><td>155361</td><td></td></tr><tr><td>Glasstic slide 10 con rejillas</td><td>Hycor</td><td>87144</td><td></td></tr></tbody></table>

la visualización de las primeras etapas de la fagocitosis

Visualizing the Early Stages of Phagocytosis

El cuerpo de los mamíferos está equipado con varias capas de mecanismos que ayudan a defenderse de las invasiones de patógenos. Fagocitos profesionales del sistema inmune - como los neutrófilos, células dendríticas y macrófagos - conservan la capacidad innata para detectar y borrar dichos patógenos invasores a través de la fagocitosis 1. La fagocitosis implica eventos coreografía de reorganización de la membrana y la remodelación de la actina en la superficie celular 2, 3. Los fagocitos interiorizan con éxito y erradicar moléculas extrañas que se hayan cumplido todas las etapas de la fagocitosis. Estos pasos incluyen reconocimiento y unión del patógeno por los receptores de reconocimiento de patrones (PRR) que reside en la superficie celular, la formación de la taza de fagocitosis a través de protuberancias membranosas de actina enriquecido (seudópodos) para rodear el material en partículas, y la escisión del fagosoma, seguido de maduración fagolisosoma que resultados en lamatando del patógeno 3, 4. Imaging y cuantificación de las diversas etapas de la fagocitosis es instrumental para elucidar los mecanismos moleculares de este proceso celular. El presente trabajo reporta métodos para estudiar las diferentes fases de la fagocitosis. Se describe un enfoque basado en microscopio para visualizar y cuantificar la formación de una copa de unión, fagocítica, y la internalización de partículas por los fagocitos. Como la fagocitosis se produce cuando los receptores innatas en las células fagocíticas encuentran ligandos sobre una partícula objetivo más grande que 0,5 m, los ensayos que aquí presentamos comprender el uso de hongos patógenos Candida albicans y otras partículas tales como zymosan y perlas recubiertas con IgG.

se presenta método basado en microscopio para controlar las diferentes etapas de la fagocitosis. Se muestran los diferentes eventos durante la fagocitosis de partículas fluorescentes diferentes de células DC2.4. Usando las técnicas descritas aquí, se investigó el papel de los esfingolípidos en las primeras etapas de la fagocitosis. Para este propósito, las células dendríticas DC2.4 genéticamente deficientes en Sptlc2, la enzima que cataliza la primera y la tasa de limitación de paso en la ruta de biosíntesis de los esfi...

Aquí describimos una técnica basada en microscopio para visualizar y cuantificar las cascadas tempranas de eventos durante la fagocitosis de patógenos como los hongos Candida albicans y partículas que miden más de 0,5 μm, incluyendo zymosan y perlas recubiertas de IgG.

La visualización de las primeras etapas de la fagocitosis

The mammalian body is equipped with various layers of mechanisms that help to defend itself from pathogen invasions. Professional phagocytes of the immune ...

El objetivo principal de esta técnica es monitorizar las diferentes etapas de la fagocitosis utilizando un microscopio confocal. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las interacciones entre patógenos. Principalmente para comprender cómo los patógenos ingresan a las células huésped durante la infección.La principal ventaja de esta técnica es que es sencilla y nos permite obtener información sobre la célula viral de nuestros eventos que ocurren durante la fagocitosis de una manera sensible al tiempo. Para comenzar, prepare el zimosano conjugado con fluorescencia como se describe en el protocolo de texto adjunto. El día anterior, siembre unas cinco veces 10 a la cuarta células DC 2,4 en un portaobjetos de cámara, de modo que los pocillos tengan un 60 a un 70% de confluentes en el momento del experimento.Una vez que las celdas estén en una densidad adecuada, coloque el portaobjetos de la cámara a 10 grados centígrados durante 10 minutos. El enfriamiento de las células es necesario para bloquear la endocitosis, así como cuándo alternar la citosis. Y posteriormente tener una fagocitosis sincronizada.A continuación, retire suavemente el medio de cada pocillo con una pipeta o un aspirador. A continuación, mezcle el zymosan conjugado fluorescentemente con el medio de cultivo celular a una multiplicidad de una infección de 10. A continuación, agregue 500 microlitros de medio en cada pocillo de la cámara para asegurarse de que toda la celda esté cubierta.A continuación, gire hacia abajo el portaobjetos de la cámara para aumentar los contactos entre las partículas en las células y sincronizar el proceso de unión. Después de la centrifugación, transfiera el portaobjetos de la cámara a una incubadora humidificada a 37 grados Celsius con 5 por ciento de CO2. Después de cinco minutos a 37 grados centígrados, retire el portaobjetos de la cámara de la incubadora y aspire el medio.Luego, lave las celdas tres veces con PBS helado. Después del lavado final, compruebe la presencia de partículas no unidas con un microscopio óptico y realice lavados adicionales si es necesario. Es esencial eliminar las partículas no unidas de los pozos para minimizar el ruido de fondo durante el análisis.A continuación, fije las celdas añadiendo 500 microlitros de paraformaldehído al cuatro por ciento en PBS a los pocillos, e incubándolas durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de fijar las celdas, lávelas agregando 500 microlitros de PBS en cada cámara y luego aspire suavemente la solución. Repite el paso de lavado dos veces más.Después de la tercera ronda de lavado, detenga la reacción agregando 500 microlitros de cloruro de amonio 50 milimolar en PBS a las células e incubándolas durante 10 minutos. Luego, lave las celdas en 500 microlitros de PBS a temperatura ambiente. A continuación, permeabilice las células añadiendo 500 microlitros de tampón de unión a cada pocillo e incubando las células durante 30 minutos a temperatura ambiente.El siguiente paso es teñir la F-actina añadiendo faloidina conjugada fluorescentemente a las células e incubarlas durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, lavar las células tres veces con 500 microlitros de PBS. Por último, capture imágenes con un microscopio confocal y analice las imágenes con ImageJ.Para medir la absorción de zimosano, prepare portaobjetos de cámara con células como se muestra en el ensayo de unión. Después de los pasos de enfriamiento y etiquetado, transfiera el portaobjetos de la cámara a una incubadora humidificada a 37 grados Celsius con cinco por ciento de CO2. E incubar las células en diferentes puntos de tiempo.Fije las células después de 30, 60 y 90 minutos después de la infección. Asegúrese de optimizar estos puntos de tiempo en función del tipo de célula respectivo y las partículas fluorescentes que se utilicen. A continuación, analice las imágenes con ImageJ.La absorción exitosa se caracteriza por una internalización completa de una partícula dentro del citoplasma de un fagocito. Para comenzar, prepare una cámara ambiental de etapa de microscopio calentándola a 37 grados Celsius y equilibrando la cámara con 5 por ciento de CO2. Espere de 30 a 45 minutos para que la temperatura y el CO2 se estabilicen antes de tomar la imagen.Ver el CO2 y los niveles de temperatura son críticos para la fagocitosis, así como encender el calentador del microscopio antes del experimento para equilibrar el ambiente de esa cámara. A continuación, prepare los portaobjetos de la cámara con células DC 2.4 que estabilizan la expresión de mCherry F-actina como se muestra en el ensayo de unión. Siguiendo los pasos de arrullo y etiquetado, transfiera el portaobjetos de la cámara de la centrífuga directamente a una platina de microscopio precalentada.Finalmente, realice imágenes en vivo utilizando un microscopio de escaneo láser confocal como se describe en el protocolo de texto adjunto, no solo para capturar el movimiento y la dinámica de la red F-actina, sino también para visualizar los diferentes eventos fagocíticos dentro de las células vivas. Las células que se muestran aquí en verde son una célula DC 2.4 de tipo salvaje que está siendo infectada con BFP canadiense que se muestra en rojo. Las imágenes de lapso de tiempo se utilizan para visualizar las primeras etapas de la fagocitosis y se muestran aquí en intervalos de 30 segundos.Los lugares marcados con el asterisco son donde se produce la remodelación de la actina. Todo el proceso ocurre en cuestión de unos minutos. Aquí se evaluó el papel de los esfingolípidos en las primeras etapas de la fagocitosis.Con esta técnica, se descubrió que los esfingolípidos eran esenciales para la unión de Candida albicans a las células y reducían la fagocitosis general. Esta reducción de la unión fagocitótica también se demostró para la unión de las células DC 2.4 a los zimosanos. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar imágenes en vivo para estudiar la etapa temprana de la fagocitosis.Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en una o dos horas si se realiza correctamente. Después de este procedimiento, se puede realizar la fagocitosis de otros patógenos, incluidas las bacterias y los parásitos, para comprender la intrincada relación entre las células inmunitarias y estos patógenos. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología celular exploraran la endocitosis mediada por receptores, incluida la fagocitosis y la macropinocitosis en las células inmunitarias.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este video muestra un ensayo para monitorear eventos independientes de fagocitosis de glóbulos rojos (RBC) mediados por macrófagos. Los glóbulos rojos humanos opsonizados con inmunoglobulina G (IgG) de ratón se incuban con macrófagos de ratón y se observan al microscopio confocal. Los glóbulos rojos son engullidos por los macrófagos a través de una formación de copas fagocíticas y se dirigen a la degradación lisosomal.

Imágenes en tiempo real de la fagocitosis de macrófagos de glóbulos rojos opsonizados con IgG

Este video demuestra una técnica de microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) de alta resolución para la visualización en tiempo real de la formación y cierre de fagosomas durante la fagocitosis mediada por macrófagos de glóbulos rojos (RBC) opsonizados con IgG adheridos a la superficie de un plato con fondo de vidrio. Los macrófagos extienden seudópodos alrededor de los glóbulos rojos y los engullen dentro de los fagosomas, separándolos de la superficie del vidrio.

Visualización basada en microscopía TIRF de la formación y el cierre de fagosomas

Se describen métodos para la microscopia de vídeo en vivo de células...

Vídeo en vivo de células Microscopía de fagocitosis hongo patógeno

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Estudio de fagolisosoma Biogénesis en macrófagos en directo

Aquí presentamos un protocolo para cuantificar la fagocitosis de partículas fluorescentes por una línea celular de macrófagos adherentes utilizando un método fluorométrico. Este método facilita una cuantificación de alto rendimiento de la internalización de partículas, así como la polimerización de actina resultante.

Alto Rendimiento Fluorométrico Técnica de Evaluación de macrófagos fagocitosis y actina polimerización

Describimos una configuración experimental para visualizar con una formación y cierre de fagosomas de alta resolución sin precedentes en tres dimensiones en macrófagos vivos, utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total. Permite el seguimiento de la base de la copa fagocítica, los pseudópodos en expansión, así como el sitio preciso de la escisión del fagosoma.

&quot;Fagosoma Cierre de ensayo&quot; para visualizar Fagosoma Formación en tres dimensiones utilizando la reflexión interna total fluorescente Microscopía (TIRFM)

Este manuscrito describe un método simple para medir el pH phagosomal y zona, así como el pH citoplasmático de los neutrófilos humanos y de ratón utilizando el indicador radiométrica seminaphthorhodafluor (SNARF) -1, o S-1. Esto se consigue utilizando células vivas microscopía de fluorescencia confocal y análisis de imágenes.

Imágenes de la Neutrófilos Fagosoma y el citoplasma usando un indicador de pH Ratiometric

Aquí describimos los métodos usando microscopia confocal de disco de spinning solo eventos fagocíticas imagen por residente macrófagos peritoneales de ratón. Los protocolos pueden ampliarse a otras células fagocíticas.

Proyección de imagen 3D Time-lapse de la fagocitosis por macrófagos de ratón

El mecanismo asociado con la fagocitosis en la infección por Leishmania sigue siendo poco conocido. Aquí, describimos métodos para evaluar los eventos tempranos que ocurren durante la interacción de Leishmania con las células huésped.

Investigación de la fagocitosis de Leishmania mediante microscopía confocal

Aquí se presenta un protocolo para cuantificar y producir imágenes dinámicas de la regulación mediada por células madre mesenquimales (MSC) de la fagocitosis de macrófagos (MΦ) de partículas de levadura no opsonizada (zymosan) que se conjugan con una molécula fluorescente sensible al pH.

Regulación de células madre mesenquimales de la fagocitosis de macrófagos; Cuantificación e imágenes

Este estudio dilucida el procesamiento fagocítico de las partículas de Godanti Bhasma (GB) en células de mamíferos, caracterizando su absorción celular, dinámica de vacuolas, acidificación y degradación. Estos hallazgos no solo avanzan en nuestra comprensión de los mecanismos fundamentales de la fagocitosis, sino que también establecen a la GB como un sistema modelo prometedor para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas.

Explorando los eventos celulares secuenciales de fagocitosis desencadenados por Godanti Bhasma en células de mamíferos

Aprende a visualizar las primeras etapas de la fagocitosis mediante microscopía confocal en células DC 2.4. Este método permite analizar en tiempo real la dinámica de interacción entre patógenos y células hospedadoras.

La visualización de las primeras etapas de la fagocitosis

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