La visualización de las primeras etapas de la fagocitosis

El objetivo principal de esta técnica es monitorizar las diferentes etapas de la fagocitosis utilizando un microscopio confocal. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las interacciones entre patógenos. Principalmente para comprender cómo los patógenos ingresan a las células huésped durante la infección.

La principal ventaja de esta técnica es que es sencilla y nos permite obtener información sobre la célula viral de nuestros eventos que ocurren durante la fagocitosis de una manera sensible al tiempo. Para comenzar, prepare el zimosano conjugado con fluorescencia como se describe en el protocolo de texto adjunto. El día anterior, siembre unas cinco veces 10 a la cuarta células DC 2,4 en un portaobjetos de cámara, de modo que los pocillos tengan un 60 a un 70% de confluentes en el momento del experimento.

Una vez que las celdas estén en una densidad adecuada, coloque el portaobjetos de la cámara a 10 grados centígrados durante 10 minutos. El enfriamiento de las células es necesario para bloquear la endocitosis, así como cuándo alternar la citosis. Y posteriormente tener una fagocitosis sincronizada.

A continuación, retire suavemente el medio de cada pocillo con una pipeta o un aspirador. A continuación, mezcle el zymosan conjugado fluorescentemente con el medio de cultivo celular a una multiplicidad de una infección de 10. A continuación, agregue 500 microlitros de medio en cada pocillo de la cámara para asegurarse de que toda la celda esté cubierta.

A continuación, gire hacia abajo el portaobjetos de la cámara para aumentar los contactos entre las partículas en las células y sincronizar el proceso de unión. Después de la centrifugación, transfiera el portaobjetos de la cámara a una incubadora humidificada a 37 grados Celsius con 5 por ciento de CO2. Después de cinco minutos a 37 grados centígrados, retire el portaobjetos de la cámara de la incubadora y aspire el medio.

Luego, lave las celdas tres veces con PBS helado. Después del lavado final, compruebe la presencia de partículas no unidas con un microscopio óptico y realice lavados adicionales si es necesario. Es esencial eliminar las partículas no unidas de los pozos para minimizar el ruido de fondo durante el análisis.

A continuación, fije las celdas añadiendo 500 microlitros de paraformaldehído al cuatro por ciento en PBS a los pocillos, e incubándolas durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de fijar las celdas, lávelas agregando 500 microlitros de PBS en cada cámara y luego aspire suavemente la solución. Repite el paso de lavado dos veces más.

Después de la tercera ronda de lavado, detenga la reacción agregando 500 microlitros de cloruro de amonio 50 milimolar en PBS a las células e incubándolas durante 10 minutos. Luego, lave las celdas en 500 microlitros de PBS a temperatura ambiente. A continuación, permeabilice las células añadiendo 500 microlitros de tampón de unión a cada pocillo e incubando las células durante 30 minutos a temperatura ambiente.

El siguiente paso es teñir la F-actina añadiendo faloidina conjugada fluorescentemente a las células e incubarlas durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, lavar las células tres veces con 500 microlitros de PBS. Por último, capture imágenes con un microscopio confocal y analice las imágenes con ImageJ.

Para medir la absorción de zimosano, prepare portaobjetos de cámara con células como se muestra en el ensayo de unión. Después de los pasos de enfriamiento y etiquetado, transfiera el portaobjetos de la cámara a una incubadora humidificada a 37 grados Celsius con cinco por ciento de CO2. E incubar las células en diferentes puntos de tiempo.

Fije las células después de 30, 60 y 90 minutos después de la infección. Asegúrese de optimizar estos puntos de tiempo en función del tipo de célula respectivo y las partículas fluorescentes que se utilicen. A continuación, analice las imágenes con ImageJ.

La absorción exitosa se caracteriza por una internalización completa de una partícula dentro del citoplasma de un fagocito. Para comenzar, prepare una cámara ambiental de etapa de microscopio calentándola a 37 grados Celsius y equilibrando la cámara con 5 por ciento de CO2. Espere de 30 a 45 minutos para que la temperatura y el CO2 se estabilicen antes de tomar la imagen.

Ver el CO2 y los niveles de temperatura son críticos para la fagocitosis, así como encender el calentador del microscopio antes del experimento para equilibrar el ambiente de esa cámara. A continuación, prepare los portaobjetos de la cámara con células DC 2.4 que estabilizan la expresión de mCherry F-actina como se muestra en el ensayo de unión. Siguiendo los pasos de arrullo y etiquetado, transfiera el portaobjetos de la cámara de la centrífuga directamente a una platina de microscopio precalentada.

Finalmente, realice imágenes en vivo utilizando un microscopio de escaneo láser confocal como se describe en el protocolo de texto adjunto, no solo para capturar el movimiento y la dinámica de la red F-actina, sino también para visualizar los diferentes eventos fagocíticos dentro de las células vivas. Las células que se muestran aquí en verde son una célula DC 2.4 de tipo salvaje que está siendo infectada con BFP canadiense que se muestra en rojo. Las imágenes de lapso de tiempo se utilizan para visualizar las primeras etapas de la fagocitosis y se muestran aquí en intervalos de 30 segundos.

Los lugares marcados con el asterisco son donde se produce la remodelación de la actina. Todo el proceso ocurre en cuestión de unos minutos. Aquí se evaluó el papel de los esfingolípidos en las primeras etapas de la fagocitosis.

Con esta técnica, se descubrió que los esfingolípidos eran esenciales para la unión de Candida albicans a las células y reducían la fagocitosis general. Esta reducción de la unión fagocitótica también se demostró para la unión de las células DC 2.4 a los zimosanos. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar imágenes en vivo para estudiar la etapa temprana de la fagocitosis.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en una o dos horas si se realiza correctamente. Después de este procedimiento, se puede realizar la fagocitosis de otros patógenos, incluidas las bacterias y los parásitos, para comprender la intrincada relación entre las células inmunitarias y estos patógenos. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología celular exploraran la endocitosis mediada por receptores, incluida la fagocitosis y la macropinocitosis en las células inmunitarias.