La manipulación de neurofarmacológico restringida y de vuelo libre abejas de la miel, Apis mellifera

El objetivo general de estos procedimientos es administrar de manera confiable y robusta agentes farmacológicos al sistema nervioso central de las abejas melíferas o insectos similares. Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave en los campos de la sociobiología, la neuroetología y la apicultura, como la exploración de los neuromecanismos del comportamiento social. La principal ventaja de estas técnicas es que permiten estudiar la neurobiología en organismos no modelo, como la abeja melífera, donde las herramientas genéticas son limitadas actualmente.

El encargado de desmontar el procedimiento estará a cargo de Jenny Plath, estudiante graduada del Laboratorio de Neuroetología de la Universidad Macquarie. Los medicamentos pueden administrarse por vía oral o por inyección. Las inyecciones se pueden realizar en el tórax, en el ocelo o en el tracto ocelar.

Las inyecciones de ocelo administran medicamentos a toda la cabeza y las inyecciones del tracto ocelar se dirigen a regiones específicas del cerebro. Para todas las inyecciones, haga un microbisturí rompiendo la esquina de una hoja de afeitar de doble filo con un soporte para cuchillas. Fije el fragmento de cuchilla a un soporte de cuchilla para que sea una hoja bonita con un extremo afilado.

Para una inyección torácica, diseccione un orificio de dos milímetros justo por encima del escutelio, junto a la apófisis posterior del tórax de una abeja. Evite cortar demasiado profundo, ya que esto podría lesionar los músculos de vuelo, y tenga cuidado de evitar las bisagras de las alas. Lo ideal es cortar solo tres lados para que la solapa de la cutícula se pueda doblar posteriormente para cerrar el sitio de la lesión.

Ahora inyecte la droga en el tórax. A continuación, vuelva a colocar la solapa de la cutícula sobre el agujero y, después de diez horas, se volverá a colocar y sellar. Para acceder al cerebro, bloquee la cabeza de una abeja enjaezada en su lugar llenando la grieta del cuello con cera dental calentada a mano para evitar dañar los receptores olfativos de las antenas u otras células que pueden ser importantes para el comportamiento de la abeja.

La antena también puede bloquearse con cera dental. A continuación, con el microbisturí, retire con cuidado el cristalino del ocelo mediano insertando la punta del microbisturí debajo de la lente y rompiendo suavemente el cristalino para liberarlo de la cápsula de la cabeza. Para que el medicamento se introduzca en toda la cápsula de la cabeza, pipetee cuidadosamente el medicamento en el orificio del ocelo y espere a que se absorba.

Alternativamente, las subregiones del cerebro pueden ser atacadas mediante inyección a través del tracto ocelar, por ejemplo, inyectando 250 nanolitros de fármaco a una profundidad de 50 micras para dirigirse a las estructuras cerebrales adyacentes al ocelo. Luego retire la cera dental y deje que la abeja descanse por un tiempo antes de continuar con el procedimiento experimental. Para preparar las agujas de inyección, tire de tubos de vidrio de un milímetro para producir una punta de aproximadamente 0,5 centímetros de largo.

A continuación, bajo un microscopio estereoscópico rompa las puntas para hacer una abertura de aproximadamente 10 a 15 micras de diámetro exterior. Esto se puede medir usando una escala en una retícula. Ahora cargue una aguja de inyección con la solución del medicamento.

Luego, en el sistema de inyección, conecte la aguja de inyección cargada al micromanipulador. Pruebe el sistema de inyección en aceite mineral y calibre para administrar un bolo de 0,5 a dos nanolitros, dependiendo del tamaño de la estructura cerebral objetivo. Con una retícula, mida el diámetro de las gotas para calcular su volumen.

Para arreglar la cabeza de una abeja enjaezada, use cera dental suave, como antes. A continuación, corte una abertura en la parte anterior de la cápsula de la cabeza con un microbisturí con tres cortes: uno justo debajo del ocelo mediano; uno en el borde del ojo derecho o izquierdo; y uno por encima de los vástagos de la antena. Use un pedazo de cera dental para mantener el colgajo abierto en su lugar.

A continuación, empuje con cuidado las glándulas y la tráquea con pinzas finas y haga una pequeña ruptura en el neurilema por encima de la estructura cerebral objetivo. Ahora inserte la punta de la pipeta de vidrio en la región del cerebro deseada, idealmente, perpendicular a la superficie del cerebro a la profundidad requerida para alcanzar la estructura objetivo. A continuación, inyecte el bolo de fármaco.

Cuando se dirija a regiones cerebrales emparejadas, haga una inyección en cada hemisferio para afectar a ambos hemisferios. Si se inyecta un tinte fluorescente con el bolo, las regiones superficiales del cerebro se pueden ver con luz fluorescente. Otras regiones se pueden comprobar posteriormente mediante microscopía confocal.

Después de la inyección, reemplace el colgajo de la cutícula y selle el corte derritiendo un cristal de eicosano de aproximadamente un milímetro de diámetro sobre la cutícula usando un alambre delgado unido a un microsoldador. Esto reducirá en gran medida la mortalidad. Para administrar un fármaco tan volátil como el de un filamento de nicromo calentado, prepáralo disuelto en etanol puro.

Para perforar cuidadosamente los agujeros en la tapa de un tubo de 50 milímetros, pase los dos cables a través de los orificios. Para crear un filamento, enrolle el alambre de nicromo firmemente alrededor de un clavo, conecte el cable de nicromo a dos cables eléctricos y luego retire el clavo. Después, asegure los cables y selle los agujeros con silicona.

Ahora conecte los cables a una fuente de alimentación. Y usa un termopar para medir la temperatura del filamento. Para calibrar el dispositivo, pipetee con cuidado dos microlitros de solución de fármaco en el filamento y deje que el etanol se evapore completamente a temperatura ambiente.

Varíe el voltaje en la corriente para que el bolo del medicamento se volatilice dentro de los diez segundos posteriores a la aplicación de energía. El medicamento no debe destruirse por descomposición térmica. Por lo general, el precipitado se puede ver en el filamento seco si se inspecciona cuidadosamente.

Para administrar los medicamentos a una abeja, cargue una abeja que vuele libremente o con arnés en el tubo y coloque con cuidado la tapa con los cables fuera. Luego encienda la fuente de energía durante 10 segundos y espere 50 segundos más para que la abeja absorba completamente el compuesto volatilizado antes de retirarlo. Los efectos específicos sobre los procesos cerebrales se pueden obtener fácilmente después de la inyección en el tórax.

Por ejemplo, se administraron bloqueadores de la transcripción utilizando esta técnica para identificar fases de la memoria que requerían expresión génica. Se obtuvieron efectos selectivos y dependientes del tiempo en las tareas de memoria. La difusión de moléculas en la hemolinfa de la cabeza conduce a efectos rápidos, dependientes de la dosis, a los que se llega mediante la inyección de ocelo.

A ciertas concentraciones de dosis, las alatostatinas difusamente concentradas redujeron el rendimiento en un ensayo de aprendizaje olfativo. Para probar las propiedades espaciales y temporales de regiones específicas del cerebro, las abejas enjaezadas fueron entrenadas en un paradigma de condicionamiento olfativo PER y luego se les inyectó procano en los lóbulos verticales del cuerpo del hongo. Cuando se sometió a pruebas de recuperación de las abejas, el rendimiento solo se vio afectado en las abejas inyectadas bilateralmente.

En una arena con múltiples comederos, las abejas fueron capturadas suavemente cuando estaban a punto de posarse de un comedero con un molar de sacarosa. Las abejas capturadas fueron tratadas con 100 microgramos de cocaína de base libre volatilizada, lo que resultó en un aumento de la búsqueda de alimento en los comederos de medio molar, pero no en los de dos molares. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo administrar medicamentos a las abejas que vuelan libremente o restringidas, ya sea por inyección o volatilización.

Una vez dominadas, estas técnicas se pueden realizar fácilmente en un gran número de abejas en un par de horas. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el condicionamiento de extensión de la probóscide, para que podamos responder preguntas adicionales sobre la neurobiología del aprendizaje y la memoria.