Name: La manipulación de neurofarmacológico restringida y de vuelo libre abejas de la miel, Apis mellifera (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Aprende métodos de administración farmacológica en abejas melíferas, Apis mellifera, mediante técnicas orales e inyectadas. Estos protocolos permiten estudiar neurobiología y comportamiento social en organismos no modelo.

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Este proyecto fue financiado por el DP0986021 de subvenciones de ARC y el 585442 de subvenciones del NHMRC. ABB cuenta con el apoyo de una beca ARC Future Fellowship (FT140100452). JAP cuenta con el apoyo de una beca iMQRES otorgada por la Universidad de Macquarie y por un DAAD-Doktorandenstipendium otorgado por el Servicio Alemán de Intercambio Académico. JMD cuenta con el apoyo del CNRS y de la Universidad Paul Sabatier.

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los métodos descritos anteriormente permiten un tratamiento sencillo, eficaz y robusta de cualquiera de vuelo libre o abejas de la miel con arnés. Estos métodos son compatibles con muchos paradigmas experimentales y cuestiones biológicas (Tabla 1). Todos los métodos de vuelo libre puede aplicarse fácilmente a las abejas con arnés. La inversa es menor éxito, sin embargo, ya que la restricción temporal y métodos de tratamiento invasivo a menudo pueden comprometer la capacidad de vuelo de las abejas. <...

Desde Karl von Frisch dilucidado su lenguaje de la danza 1, las abejas de miel han mantenido una especie de estudio populares para los investigadores en el comportamiento animal y la neurobiología. En los últimos años un gran número de nuevas disciplinas han surgido en la intersección de estos dos campos, y varias otras disciplinas (por ejemplo, la biología molecular, la genómica y la informática) han surgido junto a ellos. Esto ha llevado a un rápido desarrollo de nuevas teorías y modelos para entender cómo se traduce el comportamiento de la actividad dentro de los sistemas nerviosos. Debido al estilo de vida único, rico repertorio de conducta, y la facilidad de manipulación experimental y farmacológico, las abejas se han mantenido a la vanguardia de esta revolución. Las abejas de miel están siendo utilizados para estudiar las cuestiones básicas tales como neurobiológicos que subyacen en el aprendizaje y la memoria de 2,3, por lo que la decisión 4, 5 olfativa, o el procesamiento visual 6. En los últimos años, el honabeja ey incluso se ha utilizado como modelo para el estudio de temas generalmente reservados para la investigación médica, tales como los efectos de las drogas adictivas 7 - 11, 12 del sueño, el envejecimiento 13, o los mecanismos subyacentes a la anestesia 14. A diferencia de los organismos modelo genético clásicos (por ejemplo, D. melanogaster, C. elegans, M. musculus), hay muy pocas herramientas genéticas disponibles para la manipulación de las funciones neuronales en las abejas melíferas, aunque esto está cambiando 15. En cambio, los estudios de abejas se han basado principalmente en las manipulaciones farmacológicas. Esto ha sido muy exitosa; Sin embargo, la diversidad de la investigación de abeja es tal que se necesitan una serie de métodos para la administración farmacológica. La investigación con abejas melíferas aborda cuestiones muy diversas, es estudiada por los investigadores de diferentes disciplinas y procedencias, y utiliza una variedad de enfoques experimentales. muchos resepreguntas arco requieren abejas a estar libre-vuelo, interactuando libremente en su colonia, o ambos. Esto puede hacer que sea difícil mantener un registro de los animales de experimentación individuales, y hace inviable restricción o canulación. Para dar cabida a la diversidad de la investigación abeja de la miel, se necesita una variedad de métodos de administración de fármacos, lo que permite la administración robusta y flexible al tiempo que garantiza que los perfiles farmacocinéticos y farmacodinámicos, la invasividad del método, y su fiabilidad, traje el paradigma de que se trate. Debido a estas diversas necesidades, la mayoría de los grupos de investigación han desarrollado sus propios métodos de administración de fármacos únicos. Hasta ahora, esto ha sido una fortaleza de la comunidad investigadora de abeja; que ha llevado al desarrollo de matrices de métodos que permitan la administración del mismo medicamento en diferentes circunstancias. Nuestro objetivo aquí no es desarrollar un único método estandarizado para la manipulación farmacológica de las abejas, sino más bien para poner de relieve que los métodoshan demostrado ser particularmente exitoso, y ayudar a los investigadores adoptar estos. Se discuten los principios básicos de cómo funcionan, así como sus ventajas y desventajas.

<table><tbody><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8501</td><td>Cualquier proveedor hará</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio hexahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio dihidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>Dextrosa monohidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49159</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de fosfato salino (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Cera de protección</td><td>Dentaurum</td><td>124-305-00</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>dimetilformamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>95% Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>493511</td><td></td></tr><tr><td>Capilar de vidrio</td><td>WPI</td><td>1B100F-3</td><td></td></tr><tr><td>23 G Aguja NanoFil</td><td>WPI</td><td>NF33BV-2</td><td></td></tr><tr><td>Forsceps muy fino</td><td>Electrodo Dumont</td><td>0208-55-PO</td><td></td></tr><tr><td> tirador</td><td>SRI</td><td>2001</td><td></td></tr><tr><td>FemtoJet Microinyector</td><td>Eppendorf</td><td>5247 000.01</td><td></td></tr><tr><td>Eicosane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>219274</td><td></td></tr><tr><td>micromanipulador manual</td><td>Brinkmann Instrumentenbau</td><td>MM-33</td><td></td></tr><tr><td>micromanipulador electrónico</td><td>Luigs & Neumann Feinmechanik + Elektortechnik</td><td>Junior unidad XYZ</td><td></td></tr><tr><td>microscopio estereoscópico</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>soldador</td><td>Weller</td><td>WESD51</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Alexa Fluor 546, 10.000 MW</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D-22911</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Alexa Fluor 568, 10.000 MW</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D-22912</td><td></td></tr><tr><td>placa de Petri pequeña</td><td>Aceite mineral Sigma-Aldrich</td><td>P5481</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Tubo de centrífuga</td><td>Pinzas ThermoFisher Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Suministros Entomológicos Australianos Portacuchillas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>y rompedor</td><td>Suministros Entomológicos Australianos</td><td>E130</td><td></td></tr><tr><td>Hoja de afeitar de doble filo de</td> <td>plumaThermoFisher Scientific</td><td>50-949-135</td><td></td></tr><tr><td>Alambre</td><td></td><td></td> de nicromo <td>Cualquier proveedor lo hará</td></tr><tr><td>Cables</td><td></td><td></td> eléctricos <td>Cualquier proveedor lo hará</td></tr><tr><td>Pintura de modelo</td><td>Tamiya USA</td><td>Depende del color</td><td></td></tr><tr><td>Dispensador repetido Hamilton</td><td>company</td><td>PB-600-1</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de vidrio</td><td>WPI</td><td>NANOFIL</td><td></td></tr><tr><td>sistema de visualización de fluorescencia</td><td>Nightsea</td><td>retícula SFR-GR</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ProSciTech</td><td>S8014-24</td><td></td></tr><tr><td>microcapilar con soporte</td><td>Drummond</td><td>1-000-0010</td><td></td></tr><tr><td>Silicona</td><td></td><td></td> líquida <td>Cualquier proveedor lo hará</td></tr><tr><td>Termopar</td><td>Digitech</td><td>QM-1324</td><td></td></tr><tr><td>Micropipeta</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la manipulación de neurofarmacológico restringida y de vuelo libre abejas de la miel,<em&gt; apis mellifera</em

Neuropharmacological Manipulation of Restrained and Free-flying Honey Bees, Apis mellifera

Las abejas de miel demuestran sorprendentes capacidades de aprendizaje y el comportamiento social avanzada y la comunicación. Además, su cerebro es pequeño, fácil de visualizar y estudiar. Por lo tanto, las abejas han sido durante mucho tiempo un modelo favorecida entre los neurobiólogos y neuroethologists para el estudio de las bases neuronales del comportamiento social y natural. Es importante, sin embargo, que las técnicas experimentales utilizadas para estudiar las abejas no interfieren con los comportamientos que se estudian. Debido a esto, ha sido necesario desarrollar una serie de técnicas para la manipulación farmacológica de las abejas melíferas. En este trabajo se demuestra métodos para el tratamiento de las abejas de miel o restringidas de vuelo libre con una amplia variedad de agentes farmacológicos. Estos incluyen tanto métodos no invasivos, tales como los tratamientos orales y tópicos, así como métodos más invasivos que permiten la administración de fármacos precisa, ya sea en la manera sistémica o localizada. Finalmente, se discuten las ventajas y desventajas de cada método y describimosobstáculos comunes y la manera de superar la mejor manera. Se concluye con una discusión sobre la importancia de adaptar el método experimental a las cuestiones biológicas en lugar de al revés.

Una selección de los resultados representativos de los métodos descritos anteriormente se muestran, principalmente para demostrar que los métodos permiten a los agentes farmacológicos para alcanzar el cerebro y afectan el comportamiento abeja de la miel. efectos específicos sobre los procesos cerebrales se pueden obtener fácilmente después de la inyección tórax. Dado q...

Este manuscrito describe varios protocolos para la administración de agentes farmacológicos para las abejas, incluyendo métodos no invasivos simples para las abejas de vuelo libre, así como variantes más invasivos que permiten el tratamiento localizado precisa de abejas restringidos.

La manipulación de neurofarmacológico restringida y de vuelo libre abejas de la miel,<em&gt; Apis mellifera</em

Honey bees demonstrate astonishing learning abilities and advanced social behavior and communication. In addition, their brain is small, easy to visualize ...

El objetivo general de estos procedimientos es administrar de manera confiable y robusta agentes farmacológicos al sistema nervioso central de abejas melíferas u otros insectos similares. Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave en los campos de la sociobiología, la neuroetología y la apicultura, como explorar los mecanismos neurológicos del comportamiento social. La principal ventaja de estas técnicas es que permiten estudiar la neurobiología en organismos no modelo, como la abeja melífera, en los que actualmente las herramientas genéticas son limitadas.La procedimiento será demostrado por Jenny Plath, una estudiante de posgrado del Laboratorio de Neuroetología de la Universidad Macquarie. Las drogas pueden administrarse por vía oral o mediante inyección. Las inyecciones pueden realizarse en el tórax, en el ocelo o en el tracto ocelar.Las inyecciones en el ocelo administran fármacos a toda la cabeza, y las inyecciones en el tracto ocelar dirigen el fármaco a regiones específicas del cerebro. Para todas las inyecciones, fabrique un microescalpelo rompiendo la esquina de una hoja de afeitar de doble filo con un portacuchilla. Sujete el fragmento de la hoja al portacuchilla de modo que forme una buena hoja con un extremo afilado.Para una inyección torácica, realice una incisión de dos milímetros justo por encima del escutelo, junto al proceso posterior del ala del tórax de una abeja. Evite cortar demasiado profundo, ya que podría dañar los músculos del vuelo, y tenga cuidado de no dañar las articulaciones de las alas. Idealmente, corte solo tres lados para que la solapa del exoesqueleto pueda doblarse nuevamente después para cerrar el sitio de la lesión.Ahora inyecte el fármaco en el tórax. Luego, coloque nuevamente la solapa de la cutícula sobre el orificio y, después de diez horas, esta se volverá a adherir y sellará. Para acceder al cerebro, fije la cabeza de una abeja sujeta en su lugar rellenando la hendidura del cuello con cera dental calentada con la mano, con el fin de evitar dañar los receptores olfativos de las antenas u otras células que puedan ser importantes para el comportamiento de la abeja.La antena también puede fijarse con cera dental. Luego, utilizando el microescalpelo, retire cuidadosamente la lente del ocelo medio insertando la punta del microescalpelo debajo de la lente y rompiendo suavemente la lente para separarla de la cápsula cefálica. Para que el fármaco penetre en toda la cápsula cefálica, pipetee cuidadosamente el fármaco sobre el orificio del ocelo y espere a que se absorba.Alternativamente, se pueden dirigir subregiones del cerebro mediante inyección a través del tracto ocelar, por ejemplo, inyectando 250 nanolitros de fármaco a una profundidad de 50 micrones para dirigirse a estructuras cerebrales adyacentes al ocelo. Luego, retire la cera dental y permita que la abeja descanse un momento antes de continuar con el procedimiento experimental. Para preparar las agujas de inyección, tire de tubos de vidrio de un milímetro para producir una punta de aproximadamente 0,5 centímetros de longitud.A continuación, bajo un microscopio estereoscópico, rompa las puntas para crear una abertura con un diámetro externo de aproximadamente 10 a 15 micrones. Esto puede medirse utilizando una escala en una retícula. Ahora cargue una aguja de inyección con la solución del fármaco.Luego, en el sistema de inyección, fije la aguja de inyección cargada al micromanipulador. Pruebe el sistema de inyección en aceite mineral y calíbrelo para administrar una dosis de entre 0,5 y dos nanolitros, dependiendo del tamaño de la estructura cerebral objetivo. Utilizando una retícula, mida el diámetro de las gotas para calcular su volumen.Para fijar la cabeza de una abeja ensillada, utilice cera dental blanda, como antes. Luego, corte una abertura en la parte anterior de la cápsula cefálica usando un microescalpelo con tres cortes: uno justo debajo del ocelo medio; uno en el borde del ojo derecho o izquierdo; y uno por encima de las raíces de las antenas. Utilice un trozo de cera dental para mantener la solapa abierta en su lugar.A continuación, empuje cuidadosamente las glándulas y la tráquea utilizando pinzas finas y haga una pequeña ruptura en la neurilema por encima de la estructura cerebral objetivo. Ahora inserte la punta de la pipeta de vidrio en la región cerebral deseada, idealmente, perpendicular a la superficie del cerebro y hasta la profundidad necesaria para alcanzar la estructura objetivo. Luego, inyecte el bolo del fármaco.Al dirigirse a regiones cerebrales pareadas, realice una inyección en cada hemisferio para afectar a ambos hemisferios. Si se inyecta un tinte fluorescente junto con el bolo, las regiones cerebrales superficiales pueden observarse utilizando luz fluorescente. Otras regiones pueden verificarse posteriormente mediante microscopía confocal.Después de la inyección, coloque nuevamente la solapa de la cutícula y selle el corte derritiendo un cristal de eicosano de aproximadamente un milímetro de diámetro sobre la cutícula, utilizando un alambre delgado conectado a un soldador microscópico. Esto reducirá considerablemente la mortalidad. Para administrar un fármaco tan volátil como el que se libera de un filamento de nicromo calentado, prepárelo disuelto en etanol puro.Perfore cuidadosamente orificios en la tapa de un tubo de 50 milímetros e introduzca los dos cables a través de los orificios. Para crear un filamento, enrolle firmemente el alambre de nicromio alrededor de un clavo, conecte el alambre de nicromio a dos cables eléctricos y luego retire el clavo. Posteriormente, asegure los cables y selle los orificios con silicona.Ahora conecte los cables a una fuente de alimentación. Y utilice un termopar para medir la temperatura del filamento. Para calibrar el dispositivo, pipetee cuidadosamente dos microlitros de solución del fármaco sobre el filamento y deje que el etanol se evapore completamente a temperatura ambiente.Varíe el voltaje en la corriente para que el bolo de fármaco se volatilice dentro de los diez segundos posteriores a la aplicación de energía. El fármaco no debe destruirse por descomposición térmica. Por lo general, se puede observar un precipitado en el filamento seco si se inspecciona cuidadosamente.Para administrar los fármacos a una abeja, coloque una abeja libre o sujetada dentro del tubo y fije cuidadosamente la tapa con los cables hacia afuera. Luego encienda la fuente de alimentación durante 10 segundos y espere otros 50 segundos para que la abeja absorba completamente el compuesto volatilizado antes de retirarla. Es posible obtener fácilmente efectos específicos sobre los procesos cerebrales tras la inyección en el tórax.Por ejemplo, se administraron bloqueadores de la transcripción mediante esta técnica para identificar las fases de la memoria que requerían la expresión génica. Se obtuvieron efectos selectivos y dependientes del tiempo en tareas de memoria. La difusión de moléculas hacia la hemolinfa de la cabeza provoca efectos rápidos y dependientes de la dosis mediante la inyección en el ocelo.En ciertas concentraciones de dosis, las alatostatinas difusamente concentradas redujeron el desempeño en un ensayo de aprendizaje olfativo. Para evaluar las propiedades espaciales y temporales de regiones cerebrales específicas, abejas inmovilizadas fueron entrenadas en un paradigma de condicionamiento olfativo de la respuesta de extensión del probóscide (PER) y luego inyectadas con procaina en los cúlices del cuerpo fungiforme o en los lóbulos verticales. Cuando se evaluó la recuperación de la memoria en las abejas, el desempeño solo se vio afectado en aquellas que recibieron inyecciones bilaterales.En una arena con múltiples alimentadores, las abejas fueron capturadas suavemente cuando estaban a punto de abandonar un alimentador con sacarosa de un molar. A las abejas capturadas se les administraron 100 microgramos de cocaína en forma de base libre volatilizada, lo que provocó un aumento en la búsqueda de alimento en alimentadores de medio molar, pero no en alimentadores de dos molares. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo administrar fármacos a abejas en vuelo libre o restringidas, ya sea mediante inyección o volatilización.Una vez dominadas, estas técnicas pueden realizarse fácilmente en un gran número de abejas en un par de horas. Tras seguir este procedimiento, se pueden llevar a cabo otros métodos, como el condicionamiento de la extensión del probóscide, para responder preguntas adicionales sobre la neurobiología del aprendizaje y la memoria.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Se demuestra cómo implementar un método de farmacología del comportamiento en un paradigma de condicionamiento apetitivo olfativo de las abejas (Apis mellifera) mediante la aplicación sistémica de fármacos. Este método permite la investigación de los mecanismos de aprendizaje subyacente y formación de la memoria de una manera sencilla y fiable.

Farmacología del Comportamiento en el condicionamiento clásico de la respuesta de Extensión probóscide en abejas de la miel ( Apis mellifera)

En este protocolo se muestra cómo acondicionar aprovechado las abejas a los estímulos táctiles e introducir una técnica de captura de movimiento 2D para analizar la cinemática de escala fina patrón de muestreo antenal.

Aire táctil y Análisis de Movimiento de estrategias de muestreo antenales de las abejas (<em&gt; Apis mellifera</em&gt; L.)

En este protocolo, se describen dos estrategias que simultáneamente suprimen dos genes (genes desmontables doble) en las abejas de miel. A continuación te presentamos cómo utilizar la respuesta de extensión probóscide (PER) de ensayo para estudiar el efecto de la caída de dos genes de la miel de abeja percepción gustativa.

RNAi mediada Doble derribo Gene y medición percepción gustativa de las abejas (<em&gt; Apis mellifera</em&gt;)

El protocolo de acondicionamiento de la Respuesta de Extensión de la Probóscide (PER), desarrollado para la abeja melífera (Apis mellifera), proporciona un medio ecológicamente relevante y fácilmente cuantificable para estudiar varios mecanismos diferentes de aprendizaje en muchas especies de insectos.

Un Protocolo de Respuesta de probóscide Extensión para la Investigación de la plasticidad de comportamiento en Insectos: Aplicación a Basic, Biomédica y de Investigación Agrícola

Simultáneas grabaciones extracelulares de largo plazo a partir de dos neuropiles cerebrales diferentes o dos extensiones anatómicas diferentes se establecieron en las abejas. Estas grabaciones permiten la investigación de los aspectos temporales de procesamiento neuronal a través de diferentes áreas cerebrales en la única neurona, así como a nivel de conjunto en un animal de comportarse.

Grabaciones simultáneas a largo plazo en dos etapas de procesamiento neuronal en Behaving abejas

Se describe un novedoso ensayo conductual para investigar las respuestas gustativas a corto plazo de las piezas bucales de abejorros (Bombus terrestris) que se mueven libremente hacia los nutrientes y toxinas en solución.

A Novel Behavioral Ensayo para investigar las respuestas gustativas de individual, libre de movimiento abejorros (<em&gt; Bombus terrestris</em&gt;)

Aquí describimos nuestro protocolo detallado para la preparación de las colonias de abejas de un solo cohortes - una herramienta útil para analizar la fisiología trabajador función asociada. También describimos los protocolos detallados para el tratamiento de los trabajadores con la hormona juvenil y ecdisona para evaluar la participación de estas hormonas en la regulación del comportamiento de los trabajadores y / o fisiología.

Preparación de colonias individuales-cohortes y tratamiento con hormona del trabajador abejas para analizar la fisiología asociada con clases, y / o Sistema Endocrino

La pérdida de colonias de abejas representa un desafío para los servicios de polinización de cultivos. Las prácticas actuales de protección de los polinizadores justifican un enfoque alternativo para minimizar el contacto de las abejas melíferas con los plaguicidas dañinos usando químicos repelentes. Aquí, proporcionamos métodos detallados para un protocolo de rastreo visual para detectar impedimentos para las abejas.

Protocolo de seguimiento de vídeo a la pantalla Químicos de disuasión para las abejas de miel

Este protocolo describe los pasos para utilizar el nuevo software, SwarmSight, para el rastreo de cuadro por cuadro de insectos antena y proboscis de vídeos de cámara web convencional utilizando equipos convencionales. El software libre, código abierto procesos Marcos cerca de 120 veces más rápido que los seres humanos y se realiza en mejor que la precisión humana.

SwarmSight: Seguimiento en tiempo real de movimientos de insecto de antena y reflejo de extensión probóscide utilizando una preparación común y Hardware convencional

Para probar los efectos inhibitorios de agentes farmacológicos en la fosfolipasa C (PLC) en las diferentes regiones del cerebro de la abeja, presentamos un ensayo bioquímico para medir la actividad de la PLC en esas regiones. Este análisis podrían ser útil para comparar la actividad de la PLC entre los tejidos, así como entre las abejas exhibe diferentes comportamientos.

Detección de actividad de fosfolipasa C en el homogeneizado de cerebro de la abeja

Aquí se presenta un protocolo para utilizar el sistema CRISPR-Cas9 para reducir la producción de una proteína en el cerebro adulto de abeja sellos para probar la especificidad de anticuerpos.

Pruebas de anticuerpos anti-RDL y anti-mGlutR1 en secciones de cerebro de abeja con CRISPR-Cas9

Aprende métodos de administración farmacológica en abejas melíferas, Apis mellifera, mediante técnicas orales e inyectadas. Estos protocolos permiten estudiar neurobiología y comportamiento social en organismos no modelo.

La manipulación de neurofarmacológico restringida y de vuelo libre abejas de la miel,

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