Termoestabilización, Expresión, purificación y cristalización del transportador de serotonina humano enlazado a S citalopram

El objetivo general de este procedimiento es generar un transportador que sea lo suficientemente estable para los estudios estructurales, y utilizar este transportador modificado para producir cristales que se defracan a alta resolución mediante cristalografía de rayos X. Este método puede responder a preguntas clave en el campo de la biología estructural, como por ejemplo cómo resolver la estructura de las proteínas de membrana, que son importantes dianas farmacológicas. La principal ventaja de esta técnica es que se puede utilizar para seleccionar una conformación unida a un fármaco mediante un ensayo funcional.

Aunque este método puede proporcionar información sobre los transportadores de neurotransmisores, también se puede aplicar a receptores, canales y proteínas solubles, que se unen a moléculas pequeñas con alta afinidad. Resuspenda completamente el HEK293S tripsonizado GnTI menos células en DMEM suplementado con un 10% de suero bovino fetal a una densidad de 0,5 millones de células por mililitro en un depósito de pipeta desechable. Con una pipeta multicanal, agregue 100 microlitros de células a cada pocillo de una placa recubierta de poli-D-lisina.

Vuelva a suspender las células en el depósito de pipeta después de llenar cada placa para garantizar una distribución uniforme de las células. Incubar las células en la incubadora a 37 grados centígrados con un 8% de dióxido de carbono. Reemplace el medio celular una hora antes de la transvección.

Prepare los complejos de reactivos de transvección de ADN mezclando 450 nanogramos de ADN con 45 microlitros de DMEM sin suero para cada constructo en el fondo de TC certificado que se va a examinar. A continuación, añada 1,6 microlitros del reactivo de transvección a 45 microlitros de DMEM sin suero y mezcle. Agregue inmediatamente la solución de reactivo de transvección diluida a la solución de ADN y mezcle.

No mezcle las soluciones en el orden inverso. Espere de 10 a 15 minutos antes de agregar 20 microlitros de la mezcla de ADN del reactivo de transvección a cuatro de los pocillos. Incubar las células con citalopram de 200 nanomolares y 25 microlitros de TBS durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Para solubolizar las células, agregue 25 microlitros de C12M de ocho milimolares, un CHS milimolar y un cóctel de inhibidores de proteasa en TBS. Incubar las células durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, añada 50 microlitros de TBS con citalopram tritiado de 20 nanomolares, albúmina sérica bovina al 0,1% y miligramos por mililitro de su ensayo de proximidad de centelleo por afinidad de etiquetas o SPA Beads, a tres pocillos para cada constructo.

Para el último pocillo, agregue la misma solución de TBS, pero complemente con sertralina de 100 micromolares para determinar la unión inespecífica. Asegúrese de que las perlas SPA de afinidad de su etiqueta estén completamente mezcladas al agregarlas a la placa de 96 pocillos. Mida la unión tritiada de citalopram utilizando un contador de centelleo de 96 pocillos a temperatura ambiente con un tiempo de conteo de un minuto por pocillo.

Continúe contando las placas hasta que los conteos totales se estabilicen aproximadamente a las 36 horas. Después de la medición, caliente las placas durante 15 minutos en un bloque calefactor con tapa caliente a 33 grados centígrados. Mida la unión tritiada de citalopram nuevamente después del calentamiento.

Repita estos pasos modificando el paso de calentamiento. Ajuste las temperaturas de calentamiento en función de la temperatura de fusión aparente de la proteína objetivo y la termoestabilidad de la construcción más estable. Continúe calentando placas hasta que todas las construcciones tengan recuentos específicos bajos.

Cultivar HEK293S células sin GnTI en suspensión a 37 grados centígrados con 8% de dióxido de carbono y 85% de humedad en un agitador a 130 RPM y 293 medios de expresión suplementados con 2% de suero bovino fetal. Infectar 10 litros de células con el virus P2 a una multiplicidad de infección de dos y una densidad de tres millones de células por mililitro. De 12 a 16 horas después de la infección, agregue butirato de sodio a una concentración de 10 milimolares de un caldo de un molar.

De 48 a 60 horas después de la infección, recolectar las células por centrifugación a 4.000 veces G durante 15 minutos. Retire el sobrenadante. Resuspender las células en 150 mililitros de TBS con 2 micromolares de escitalopram u otros inhibidores de SERT.

las células de 10 litros de cultivo en agua tibia aproximadamente a 30 grados centígrados y resuspenderlas pasando rápidamente las células por una pipeta de 10 mililitros hasta que queden homogéneas. Agregue todas las celdas a un vaso de precipitados con una barra de agitación y agregue toda la solución de detergente a las celdas mientras revuelve. Solubilizar las células a cuatro grados centígrados durante una hora con agitación.

Centrifugar el lisado a 8.000 veces G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Decantar el sobrenadante en tubos ultracentrífugos limpios y desechar el pellet. A continuación, haga girar el sobrenadante a 100.000 veces G durante una hora en una ultracentrífuga.

Después de la ultracentrifugación, filtre el sobrenadante a través de un filtro de 0,2 micras y deseche el pellet. A continuación, pase el lisado por más de 10 mililitros de resina de afinidad estreptocócica en una columna utilizando una bomba perisalítica equilibrada en tampón de lavado. A continuación, conecte una columna de afinidad estreptocócica a un sistema de cromatografía líquida rápida de proteínas y lave la columna a dos mililitros por minuto con 66 mililitros de tampón de lavado.

Eluir la proteína purificada en el mismo tampón de lavado suplementado con destiobiotina de cinco milimolares a 0,5 mililitros por minuto utilizando 33 mililitros de tampón. Recoge fracciones de un mililitro. Las fracciones pico serán de aproximadamente 10 mililitros.

Para formar los complejos de anticuerpos transportadores, primero digiera la proteína purificada durante la noche a temperatura ambiente con trombina para eliminar las etiquetas y Endo H para la desglicosilación. Concentre la proteína a una concentración de 10 miligramos por mililitro y un volumen de 250 a 300 microlitros utilizando un concentrador de proteínas centrífuga de corte de peso molecular de 100 kilodalton. Mezcle la proteína SERT concentrada con 8B6 Fab en una proporción molar de uno a 1,2 en un volumen inferior a 500 microlitros.

Centrifugar la mezcla a 100.000 veces G y cuatro grados centígrados durante 20 minutos. Después de la centrifugación, recoja el sobrenadante que contiene el complejo SERT Fab y deseche el pellet. Separe el complejo mediante cromatografía líquida rápida de proteínas en una columna de exclusión por tamaño.

Equilibre con TBS suplementado a 0,5 mililitros por minuto. Antes de la cristalización, concentre las fracciones máximas de la separación del complejo a dos miligramos por mililitro utilizando un concentrador de proteínas centrífuga de corte de peso molecular de 100 kilodalton. Una absorbancia de dos UA a 280 nanómetros es igual a un miligramo por mililitro.

Agregue Fab adicional en una proporción de uno a 0.05 complejo a Fab libre. Agregue también 10 citalopram S libres de micromolares. Después de centrifugar la muestra, recoja el sobrenadante que contiene el complejo SERT Fab y deseche el pellet.

Configure una pantalla colgante de 24 pocillos a cuatro grados centígrados de acuerdo con la tabla uno del protocolo de texto. Pipetee 500 microlitros de cada solución de depósito en una placa de perfil bajo de 24 pocillos con sellador aplicado a cada pocillo. Pipetee 1,5, 1,75 y dos microlitros del complejo SERT Fab en un cubreobjetos de vidrio siliconado de 18 milímetros.

A continuación, pipetee un microlitro de solución de depósito sobre la muestra de proteína. Los cristales individuales aparecerán en aproximadamente tres días y crecerán de 100 a 175 micrómetros después de 14 días. A continuación se muestran resultados representativos para el cribado de la termoestabilidad en presencia de citalopram tritiado.

Los valores de temperatura de fusión trazados contra la unión máxima muestran mutantes con alta termoestabilidad y expresión. Aquí se muestran las curvas de termoestabilidad para SERT TC de tipo salvaje y los tres mutantes principales, Y110A, I291A y T439S. Esta imagen de microscopía muestra HEK293S células menos GnTI que expresan SERT CC con fluorescencia verde presente en la membrana celular.

La cromatografía de exclusión por tamaño de detección de fluorescencia de SERT CC muestra un pico importante a los 15 mililitros. El análisis realizado por SDS-PAGE muestra una sola especie de proteína en gran parte libre de contaminantes. Se muestra una separación representativa de los complejos de anticuerpos transportadores mediante cromatografía de exclusión por tamaño.

El pico principal que eludía a los 11,5 mililitros contenía tanto SERT como Fab, como se muestra en un gel SDS-PAGE. La microscopía óptica del complejo de anticuerpos SERT unido a S. citalopram después de dos semanas de crecimiento muestra cristales en forma de prisma de aproximadamente 100 a 175 micras. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo identificar mutaciones que estabilizan una proteína de membrana en una confirmación unida a un ligando y cómo configurar pantallas de cristalización con complejos de proteínas y anticuerpos.

Al intentar realizar este procedimiento, es importante recordar que los ligandos son necesarios para la estabilización de SERT TC y son esenciales para la cristalización de SERT CC. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de afecciones psiquiátricas porque SERT es el objetivo molecular de muchos medicamentos antidepresivos. Siguiendo este procedimiento, se puede caracterizar la función del SERT purificado utilizando métodos bioquímicos y biofísicos.