Termoestabilización, Expresión, purificación y cristalización del transportador de serotonina humano enlazado a

El objetivo general de este procedimiento es generar un transportador suficientemente estable para estudios estructurales, y utilizar este transportador modificado para producir cristales que difracten a alta resolución mediante cristalografía de rayos X. Este método puede responder preguntas clave en el campo de la biología estructural, como cómo resolver la estructura de proteínas de membrana que son blancos terapéuticos importantes. La principal ventaja de esta técnica es que puede utilizarse para seleccionar una conformación ligada a un fármaco mediante un ensayo funcional.

Aunque este método puede proporcionar información sobre los transportadores de neurotransmisores, también puede aplicarse a receptores, canales y proteínas solubles, que se unen a moléculas pequeñas con alta afinidad. Suspender completamente las células HEK293S GnTI menos tratadas con tripsina en DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal hasta alcanzar una densidad de 0,5 millones de células por mililitro en un reservorio de pipeta desechable. Utilizando una pipeta multicanal, añadir 100 microlitros de células a cada pocillo de una placa recubierta con poli-D-lisina.

Re-suspender las células en el depósito de la pipeta después de llenar cada placa para asegurar una distribución uniforme de las células. Incubar las células en el incubador a 37 grados Celsius con 8% de dióxido de carbono. Reemplazar el medio celular una hora antes de la transvección.

Prepare los complejos del reactivo de transvección de ADN mezclando 450 nanogramos de ADN con 45 microlitros de DMEM sin suero para cada construcción que se analizará en el fondo cert TC. Luego, agregue 1.6 microlitros del reactivo de transvección a 45 microlitros de DMEM sin suero y mezcle. Inmediatamente, añada la solución diluida del reactivo de transvección a la solución de ADN y mezcle.

No mezcle las soluciones en orden inverso. Espere de 10 a 15 minutos antes de agregar 20 microlitros de la mezcla de ADN del reactivo de transvección a cuatro de los pocillos. Incube las células con 200 nanomolares de citalopram y 25 microlitros de TBS durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Para solubilizar las células, agregue 25 microlitros de C12M de ocho milimolares, CHS de un milimolar y una mezcla de inhibidores de proteasas en TBS. Incube las células durante una hora a temperatura ambiente. Luego agregue 50 microlitros de TBS con citalopram marcado con tritio de 20 nanomolares, albúmina sérica bovina al 0,1 % y miligramos por mililitro de perlas de afinidad por etiqueta His para el ensayo de proximidad con centelleo o perlas SPA, a tres pocillos para cada construcción.

Para el último pocillo, agregue la misma solución de TBS, pero suplemente con sertralina 100 micromolar para determinar la unión no específica. Asegúrese de que las perlas de afinidad por etiqueta his SPA estén completamente mezcladas al agregarlas a la placa de 96 pocillos. Mida la unión de citalopram tritiado utilizando un contador de centelleo de 96 pocillos a temperatura ambiente con un tiempo de conteo de un minuto por pocillo.

Continúe contando las placas hasta que los conteos totales se estabilicen aproximadamente a las 36 horas. Después de la medición, caliente las placas durante 15 minutos en un bloque calefactor con tapa calentada a 33 grados Celsius. Vuelva a medir la unión de citalopram tritiado tras el calentamiento.

Repita estos pasos modificando el paso de calentamiento. Ajuste las temperaturas de calentamiento según la temperatura de fusión aparente de la proteína diana y la estabilidad térmica del constructo más estable. Continúe calentando las placas hasta que todos los constructos presenten recuentos específicos bajos.

Cultive células HEK293S GnTI negativas en suspensión a 37 grados Celsius con 8% de dióxido de carbono y 85% de humedad en un agitador a 130 RPM y medio de expresión 293 suplementado con 2% de suero bovino fetal. Infekte 10 litros de las células con el virus P2 a una multiplicidad de infección de dos y una densidad de tres millones de células por mililitro. De 12 a 16 horas posteriores a la infección, agregue butirato de sodio hasta una concentración de 10 milimolares a partir de un stock de un molar.

48 a 60 horas después de la infección, recoger las células mediante centrifugación a 4.000 × g durante 15 minutos. Eliminar el sobrenadante. Suspender las células en 150 mililitros de TBS con 2 micromolares de escitalopram u otros inhibidores del SERT.

las células de 10 litros de cultivo en agua tibia a aproximadamente 30 grados Celsius y resuspéndalas pasando rápidamente las células a través de una pipeta de 10 mililitros hasta homogeneizar. Añada todas las células a un vaso de precipitados con una barra magnética y agregue toda la solución detergente a las células mientras agita. Solubilice las células a cuatro grados Celsius durante una hora con agitación.

Centrifugar el lisado a 8.000 × g durante 15 minutos a cuatro grados Celsius. Decantar el sobrenadante en tubos limpios para ultracentrífuga y desechar el precipitado. Luego, centrifugar el sobrenadante a 100.000 × g durante una hora en una ultracentrífuga.

Tras la ultracentrifugación, filtre el sobrenadante a través de un filtro de 0,2 micrones y deseche el sedimento. A continuación, pase el lisado por 10 mililitros de resina de afinidad strep empaquetada en una columna, utilizando una bomba peristáltica equilibrada con tampón de lavado. Luego, conecte una columna de afinidad strep a un sistema de cromatografía líquida de proteínas rápida y lave la columna a dos mililitros por minuto con 66 mililitros de tampón de lavado.

Eluir la proteína purificada en el mismo tampón de lavado suplementado con destiobiotina cinco milimolar a 0,5 mililitros por minuto utilizando 33 mililitros de tampón. Recoger fracciones de un mililitro. Las fracciones del pico tendrán aproximadamente 10 mililitros.

Para formar los complejos de anticuerpos transportadores, primero digiera la proteína purificada durante la noche a temperatura ambiente con trombina para eliminar las etiquetas y con Endo H para la desglicosilación. Concentre la proteína hasta una concentración de 10 miligramos por mililitro y un volumen de 250 a 300 microlitros utilizando un concentrador de proteínas por centrifugación con un límite de corte de peso molecular de 100 kilodaltons. Mezcle la proteína SERT concentrada con el fragmento 8B6 Fab en una relación molar de uno a 1,2 en un volumen menor a 500 microlitros.

Centrifugar la mezcla a 100,000 × g y 4 grados Celsius durante 20 minutos. Tras la centrifugación, recoger el sobrenadante que contiene el complejo SERT Fab y desechar el sedimento. Separar el complejo mediante cromatografía líquida de alta resolución en una columna de exclusión por tamaño.

Equilíbrelo con TBS suplementado a 0,5 mililitros por minuto. Antes de la cristalización, concentre las fracciones pico obtenidas de la separación del complejo hasta dos miligramos por mililitro utilizando un concentrador de proteínas por centrifugación con un límite de peso molecular de 100 kilodalton. Una absorbancia de dos UA a 280 nanómetros equivale a un miligramo por mililitro.

Añada Fab adicional en una proporción de uno a 0,05 complejo por Fab libre. También añada s-citalopram libre a 10 micromolar. Tras centrifugar la muestra, recoja el sobrenadante que contiene el complejo SERT-Fab y deseche el precipitado.

Prepare una pantalla de gota colgante en una placa de 24 pocillos a cuatro grados Celsius según la tabla uno del protocolo escrito. Pipetee 500 microlitros de cada solución de depósito en una placa de 24 pocillos de perfil bajo con sellador aplicado en cada pocillo. Pipetee 1,5, 1,75 y dos microlitros del complejo SERT Fab sobre un cubreobjetos de vidrio silanizado de 18 milímetros.

Luego, pipetee un microlitro de solución de depósito sobre la muestra de proteína. Los cristales individuales aparecerán en aproximadamente tres días y crecerán hasta 100 a 175 micrómetros después de 14 días. Aquí se muestran resultados representativos para el cribado de estabilidad térmica en presencia de citalopram tritiado.

Los valores de temperatura de fusión representados frente al enlace máximo muestran mutantes con alta termoestabilidad y expresión. Aquí se muestran las curvas de termoestabilidad para el SERT TC de tipo salvaje y los tres mejores mutantes, Y110A, I291A y T439S. Esta imagen de microscopía muestra células HEK293S GnTI negativas que expresan SERT CC con fluorescencia verde presente en la membrana celular.

La cromatografía de exclusión por tamaño con detección de fluorescencia de SERT CC muestra un pico principal a 15 mililitros. El análisis mediante SDS-PAGE muestra una única especie proteica mayormente libre de contaminantes. Se muestra una separación representativa de complejos de anticuerpos transportadores mediante cromatografía de exclusión por tamaño.

El pico principal que eluye a 11,5 mililitros contenía tanto SERT como Fab, tal como se muestra en un gel de SDS-PAGE. La microscopía óptica del complejo anticuerpo-SERT unido a citalopram S después de dos semanas de crecimiento muestra cristales con forma de prisma de aproximadamente 100 a 175 micrones. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo identificar mutaciones que estabilizan una proteína de membrana en una conformación ligada a un ligando y de cómo establecer cribados de cristalización con complejos proteína-anticuerpo.

Al intentar realizar este procedimiento, es importante recordar que los ligandos son necesarios para la estabilización del SERT TC y son esenciales para la cristalización del SERT CC. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento de trastornos psiquiátricos porque el SERT es el blanco molecular de muchos medicamentos antidepresivos. Tras seguir este procedimiento, la función del SERT purificado puede caracterizarse mediante métodos bioquímicos y biofísicos.