Técnica ratón Microcirugía de infusión para Targeted Sustancia de entrega en el SNC vía La arteria carótida interna

El objetivo general de esta técnica quirúrgica es administrar sustancias exógenas en el cerebro del ratón sin penetrar en el cráneo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en neurociencia sobre la acción de medicamentos, patógenos y exosomas en el cerebro. La principal ventaja de esta técnica es que causa un trauma mínimo al animal, preserva la integridad de la red neuronal y logra altas concentraciones de la sustancia en el cerebro.

Comience administrando isoflurano mezclado con oxígeno para anestesiar al ratón en una cámara de inducción. Después de la inducción de la anestesia, transfiera al animal a la superficie quirúrgica bajo un microscopio estereoscópico y coloque el cono de la nariz para mantener un plano quirúrgico de anestesia. Asegúrese de que la frecuencia respiratoria esté alrededor de una o dos respiraciones por segundo sin jadear.

Además, asegúrese de que el animal no reaccione a la estimulación de los bigotes o a un pellizco en los dedos de los pies. Use un hisopo estéril para aplicar una gota de lubricante oftálmico en cada ojo para prevenir la sequedad. Después de afeitar el sitio quirúrgico con una navaja, prepare el área con etanol al 70% y clorhexidina.

Mientras mira a través del microscopio estereoscópico, use tijeras quirúrgicas y pinzas para crear una incisión en la línea media del cuello desde arriba del esternón hasta debajo de la mandíbula. Use fórceps para separar cuidadosamente el tejido graso y conectivo para exponer la tráquea. A continuación, coloque un objeto blando y redondo de aproximadamente cero punto cinco centímetros de diámetro debajo de la parte posterior del cuello para extender el cuello y exponer aún más el área.

A continuación, separe el tejido alrededor de la tráquea con ganchos o un retractor de tejido. En el lado izquierdo de la tráquea, separe con cuidado el tejido conectivo para exponer la arteria carótida común izquierda, o CCA. Con pinzas, extraiga con cuidado todo el tejido conectivo para exponer la bifurcación de la CCA en el comienzo de las arterias carótidas externas e internas.

Una vez que la ECA y la ICA estén expuestas, use fórceps para colocar un segmento de sutura de nailon de un centímetro debajo de la arteria carótida externa. Luego coloque un segundo segmento de un centímetro. A continuación, haz un nudo permanente en el punto más alto posible del ECA.

En el punto más bajo posible del ECA, inmediatamente por encima de la bifurcación del CCA, haga un nudo más suelto y extraíble. A continuación, utilice clips de recipiente para cerrar el CCA en el punto más bajo posible y para cerrar el ICA. Cerrar correctamente la arteria carótida interna antes de hacer una pequeña incisión en la arteria carótida externa evitará el sangrado.

Ahora, usando tijeras de resorte de microdisección, haga un corte de dos milímetros en el ECA entre los dos nudos. Es importante mantener los cortes pequeños, ya que un corte grande provocará fugas de la sustancia que se va a infundir. Ensamble el sistema de infusión conectando seis pulgadas de tubo capilar a una jeringa de tuberculina que contenga 250 microlitros de la sustancia a infundir.

A continuación, inserte suavemente la punta del tubo capilar en la incisión en el ECA. Siga avanzando la punta hasta que llegue a la mitad del camino entre la bifurcación y el clip en el CCA. Ata el nudo inferior de ECA.

Verifique que el nudo esté lo suficientemente suelto para permitir la fluidez capilar y lo suficientemente apretado para evitar fugas. A continuación, retire el clip del ICA. Aplique presión suavemente al pistón de la jeringa, permitiendo la infusión de la sustancia a aproximadamente 10 microlitros por segundo.

Después de la infusión de la sustancia problema, vuelva a colocar el clip en el ICA. Retire suavemente el tubo capilar. A continuación, ata completamente el nudo inferior de la ECA.

Retire el clip del ICA y del CCA. A continuación, retire el retractor o los ganchos de papel y la almohada. Limpie el área a suturar con solución salina estéril y luego cierre la incisión con suturas de nylon.

Después de administrar un agente antiinflamatorio y analgésico aprobado para aliviar las molestias postoperatorias, coloque al animal en una jaula sobre una almohadilla térmica durante al menos una hora y controle la recuperación. Este histograma muestra la detección del VIH mediante PCR en tiempo real siete días después de la infusión viral a través de la arteria carótida interna izquierda. Como era de esperar, los niveles del virus son más altos en el hemisferio izquierdo.

Esta imagen de inmunofluorescencia muestra una sección de cerebro de ratón que representa la etiqueta GFP CD63, un marcador de exosomas, después de la infusión de vesículas extracelulares a través de la arteria carótida interna. Las vesículas extracelulares que expresan CD63, mostradas en verde, están asociadas con el microvaso cerebral del ratón. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 20 minutos si se realiza correctamente.

Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de las enfermedades neurodegenerativas exploraran las interacciones de fármacos, patógenos y exosomas en ratones.