Un método alternativo de inyección y validado para acceder al espacio subretiniano vía Un enfoque posterior transescleral

El objetivo general de este estudio es describir una nueva técnica de inyección subretiniana que se puede utilizar para dirigirse a vectores virales, agentes farmacológicos o inducir células madre pluripotentes en el espacio subretiniano en ratones. Este método puede responder a preguntas clave en los campos de la ciencia de la visión y la oftalmología, como la evaluación de la eficacia de nuevas intervenciones terapéuticas para las degeneraciones de la retina. La principal ventaja de esta técnica es que se puede utilizar para administrar material al espacio subretiniano, con alta eficacia, daño mínimo y rápida recuperación de la estructura y función de la retina.

El encargado de demostrar el procedimiento será Sachin P, un técnico de mi laboratorio. Para comenzar este procedimiento, recorte los bigotes de un ratón anestesiado para facilitar la visualización y mantenga la temperatura corporal del animal a 37 grados centígrados con una almohadilla de agua circulante. A continuación, dilata sus pupilas con colirios de fenilefrina al 2,5%.

Luego, aplique gotas oftálmicas de metilcelulosa para prevenir la sequedad y minimizar las cataratas transitorias inducidas por la anestesia. Esterilizar los instrumentos antes de la cirugía. Después, prepare la fluoresceína diluida en un gabinete de bioseguridad.

Llene la jeringa con la cantidad adecuada de fluoresceína. A continuación, realice un pellizco en el dedo del pie para asegurarse de que el animal está profundamente anestesiado y coloque el ratón de modo que el ojo que se va a inyectar quede hacia arriba y sea claramente visible en el microscopio de disección. Pellizque suavemente la conjuntiva temporal con un par de pinzas de punta fina.

Luego, haga una incisión circunferencial de aproximadamente 90 grados con las tijeras curvas de Vannas. Repita el procedimiento en la cápsula de la espiga subyacente. Después de eso, reseca el problema conectivo circundante con pinzas de punta fina, mientras giras el globo nasalmente.

Trabaje hacia el lugar de la inyección a una distancia aproximada de 0,5 milímetros del nervio óptico y tenga mucho cuidado para evitar alterar el seno retroorbitario. Un paso crítico es exponer el sitio de la inyección, lo que requiere la rotación del ojo, sin dañar el ojo en sí o las estructuras asociadas, particularmente evitando dañar el saco sanguíneo orbital. En este procedimiento, haga una pequeña incisión en la esclerótica del lugar de la inyección, rascando suavemente la copa del ojo con una cuchilla oftálmica de 22,5 grados.

Esta incisión debe ser lo suficientemente grande como para permitir que la punta de la aguja pase a través de la esclerótica. A continuación, inserte la aguja biselada de calibre 33 en la esclerotomía con el bisel hacia arriba y en ángulo paralelo a la retina. Inyecte la cantidad deseada de fluoresceína al 0,01% presionando el émbolo lentamente con una presión uniforme.

Tenga en cuenta que cuando la aguja está en el espacio subretiniano, se sentirá una ligera resistencia al presionar el émbolo. No habrá resistencia si la aguja perfora la retina, pero alta resistencia si la aguja no penetra en la esclerótica o el EPR. Otro paso crítico es la inyección dirigida al espacio subretiniano.

Esto debe lograrse sin penetrar a través de la retina neurosensorial, hasta la cavidad vítrea. Espere varios segundos antes de retirar la aguja para minimizar el reflujo. Posteriormente, enjuague el ojo con solución salina estéril y asegúrese de que el ojo haya vuelto a su posición normal.

A continuación, aplique una capa gruesa de crema oftálmica antibiótica triple en la superficie córnea del ojo inyectado. Después, coloca al ratón en una jaula solitaria limpia para su recuperación. Monitoree su respiración y temperatura durante la recuperación de la anestesia, y verifique que pueda mantener la decúbito esternal.

Realizar un seguimiento y tratamiento postoperatorio adecuado adicional, incluida una inyección subcutánea de carprofeno, para el manejo del dolor posquirúrgico. Aquí hay una reconstrucción en 3D de la ampolla en forma de cúpula en el lugar de la inyección. A continuación, la ampolla en forma de cúpula se rellena de un blanco denso para mostrar la extensión y los márgenes del desprendimiento de retina.

Las secciones transversales de la retina de la OCT se pueden ver en blanco, mientras que el espacio lleno de líquido a nivel del EPR y los fotorreceptores aparece en negro. Y en esta figura, se muestran las exploraciones OCTB representativas en el sitio del desprendimiento de retina máximo para la preinyección, 10 minutos después de la inyección y cuatro semanas después de la inyección. Esta imagen muestra la formación y resolución de una ampolla plana a partir de una inyección de 0,3 microlitros.

Y esta imagen muestra la formación y resolución de una ampolla abovedada a partir de una inyección de 0,5 microlitros, mientras que esta imagen muestra la formación y resolución de una ampolla abovedada a partir de una inyección de un microlitro. Por último, aquí hay un ejemplo de cicatrización coroidea severa y adelgazamiento de la retina en el lugar de la inyección. Las retinas conservan la función normal después de la resolución de las ampollas.

A nueve intensidades de iluminación, se muestran las formas de onda para las respuestas mediadas por bastones escotópicos para la preinyección y cuatro semanas después de la inyección para inyecciones de 0,3 microlitros, 0,5 microlitros y 1 microlitro. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en 10 a 15 minutos por ojo. Al intentar este procedimiento, es importante evaluar la salud de los ojos antes de comenzar.

Excluir los ojos con opacidades corneales o del cristalino, o los ojos hundidos para los cuales este procedimiento sería muy difícil. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la OCT y las imágenes del fondo de ojo, para evaluar la calidad de la inyección.