Desarrollo de un protocolo de refinado para Trans-escleral transplante Subretinal de células epiteliales del pigmento retiniano humano a ojos de rata

El objetivo general de este video es presentar una técnica de inyección subretiniana transescleral reproducible para administrar células epiteliales de pigmento de la retina humana, o EPR, en el espacio subretiniano de los ojos de los roedores con un riesgo mínimo de daño a la retina. Esto se logra haciendo primero una pequeña incisión en la conjuntiva temporal posterior al limbo para exponer la esclerótica subyacente. Luego, se usa una aguja de insulina biselada de calibre 31 para penetrar el complejo central de la esclerótica insertando la aguja de 500 micras o aproximadamente la mitad de la punta en el tejido con el lado biselado hacia arriba para crear un orificio piloto.

A continuación, una aguja de inyección biselada de calibre 33 unida a una jeringa se guía hacia el orificio piloto y se inserta en un ángulo y profundidad específicos, el orificio de inyección se sella automáticamente después de que la aguja se retrae y no se necesita puntada ni pegamento tisular. Las retinopatías degenerativas consisten en un amplio espectro de enfermedades que involucran diferentes tipos de células de la retina. En todo el mundo, la enfermedad más común, la degeneración macular asociada a la edad, o DMAE, ocurre entre los ancianos y conduce a la ceguera permanente.

Los cambios patológicos que se producen en la DMAE implican una degeneración inicial de las células epiteliales pigmentadas de la retina, o EPR. La pérdida del EPR conduce a la disfunción o muerte de los fluororreceptores de la retina. Los tratamientos farmacológicos actuales para la DMAE en etapa temprana se limitan a ralentizar la progresión o aliviar los síntomas.

Esto, junto con un potencial regenerativo limitado de la retina, significa que no existe un tratamiento eficaz para restaurar la visión. El Instituto de Células Madre Neurales identificó recientemente una población de células madre adultas en la población de células EPR. Estas células se pueden utilizar como fuente para la terapia de reemplazo de células madre.

Actualmente, nuestro instituto está llevando a cabo estudios preclínicos para investigar la eficacia y seguridad de la terapia de trasplante de células madre EPR en un modelo animal de rata degenerativa EPR. En este estudio, utilizamos una técnica de inyección transescleral subretiniana para administrar células madre de EPR en los ojos de rata, entre las capas de la retina y el EPR. Nuestro método es un medio fácil y confiable para la entrega exitosa de células en el espacio subretiniano.

Necesitará los siguientes reactivos y equipo. Tropicamida al 1 % y fenilefrina al 2,5 %, recién elaborados a partir de fenilefrina al 10 %, diluyéndola en solución salina estéril al 0,9 % el día de la cirugía, se utilizan para dilatar la pupila. El lavado de ojos se usa para enjuagar el ojo y mantener húmedo el ojo no operado.

Se utiliza un lubricante ocular para mantener húmedo el ojo derecho no operado durante la cirugía, mientras que la proparacaína al 0,5% se utiliza como anestésico local. Se utiliza un lubricante ocular en el ojo izquierdo operado durante la exploración OCT.

Se necesita una cantidad mínima de material y equipo para esta técnica. La información detallada de los equipos y reactivos utilizados en esta técnica se describe en el protocolo. Se utiliza una jeringa de 10 microlitros para inyectar las células.

Antes de la inyección, primero ensamblamos el inyector y lo esterilizamos con etanol. Inserte una aguja biselada estéril de calibre 33 en la jeringa y atorníllela firmemente para ensamblar el inyector. Enjuague el inyector con etanol al 100%, luego con etanol al 70% y luego con agua destilada desionizada, secuencialmente de cinco a seis veces cada uno.

Marque la aguja inyectora con un rotulador negro estéril en una posición a 600 micras de distancia de la punta de la aguja. Coloque el inyector en un micro manipulador para su uso en inyección. Las células del EPR humano se preparan el día de la cirugía y se mantienen en una mezcla de agua helada.

Triture suavemente la suspensión celular y cargue el inyector con 1,2 microlitros, los 0,2 microlitros adicionales se utilizan para compensar el reflujo de la inyección, para garantizar un volumen de inyección de un microlitro. Reemplace el inyector lleno con la suspensión de celdas en el micromanipulador, o pídale a un asistente que lo sostenga verticalmente, ya que las celdas RPE tienden a hundirse fácilmente en las soluciones. Prepare el área quirúrgica estéril colocando una almohadilla quirúrgica estéril con una almohadilla térmica debajo en la platina del microscopio de disección.

Todos los procedimientos que involucran animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Nueva York en Albany. Pesar al animal y anestesiarlo utilizando el sistema de administración de vapor de isoflurano como se muestra aquí. Transfiera la rata al área quirúrgica una vez que esté anestesiada y colóquela en un cono de nariz conectado al sistema de isoflurano para mantener la anestesia.

Cubra el cuerpo de la rata con una gasa y pellizque el dedo del pie de la rata para confirmar la anestesia completa. Aplique una gota de lubricante ocular en el ojo derecho de la rata, coloque a la rata en su lado derecho, con el ojo izquierdo mirando hacia el techo para la inyección, la cabeza hacia la mano derecha del cirujano y de espaldas hacia el cirujano. Recorta los bigotes que cubran el ojo.

Gotee una pequeña cantidad de enjuague ocular para el lado temporal del ojo izquierdo y recoja el exceso en el lado nasal con un aplicador de algodón para enjuagar el ojo. Dilatar la pupila con 1% de tropicamida y 2,5% de fenilefrina, para una tomografía de coherencia óptica posterior a la inyección, o un examen OCT, aplicando una gota de cada uno. Aplica una gota de gel hidrofónico para mantener el ojo húmedo.

Aplicar una gota de Proparacaína en el ojo y retirar el exceso con un aplicador de algodón. Masajee suavemente la piel que rodea el ojo de cuatro a seis veces para abrir el párpado, de modo que el ojo se salga temporal y ligeramente de su órbita para permitir un fácil acceso a la aguja inyectora. Use fuerzas para agarrar la conjuntiva posterior al limbo y gire el ojo para encontrar un mejor lugar para la cirugía sin dañar los músculos oculares.

Levante suavemente la conjuntiva para hacer una tienda de campaña y gire el ojo nasalmente. Luego use unas tijeras para cortar la parte superior de la carpa, para hacer una pequeña abertura en la conjuntiva y exponer la esclerótica. A continuación, use fórceps para agarrar el borde de la abertura de la conjuntiva junto al limbo y gire el ojo nasalmente, de modo que el eje pupilar esté en un ángulo de aproximadamente 30 grados con respecto al suelo.

Se utiliza una aguja de insulina estéril biselada de calibre 31 para penetrar en el complejo del núcleo de la esclerótica con un bisel que apunta hacia arriba y la mitad de la punta, o unas 500 micras, que se inserta en el tejido, para crear un orificio piloto para la inyección. Retire con cuidado la aguja de insulina y se puede ver un pequeño derrame de sangre. Se puede aplicar una lanza ocular para despejar el orificio y detener el sangrado si es necesario.

Guíe la aguja inyectora cargada con células RPE en el orificio piloto en un ángulo de aproximadamente 10 a 15 grados en relación con la superficie local de la esclerótica para llegar al espacio subretiniano insertando la aguja con una longitud de 500 micras completamente en el tejido y dejando una distancia de 100 micro entre el punto de la aguja que está cubierto por el tejido y la punta del marcador negro en la aguja. Dígale al asistente que presione el émbolo de la jeringa para inyectar el volumen adecuado de células. Sostenga el inyector en su lugar durante 25 a 30 segundos después de la inyección, luego retraiga lentamente el inyector.

El orificio de inyección se sella automáticamente y comúnmente se observa una pequeña cantidad de aproximadamente 0,2 microlitros de reflujo. Enjuague el lugar de la inyección con un colirio estéril tres veces y recoja el exceso con un aplicador de algodón. Aplique una gota de lubricante en el ojo operado y transfiera la rata a la estación OCT, para examinar la ubicación de las células trasplantadas y el tamaño de la ampolla subretiniana.

Regrese la rata a la jaula de recuperación bajo una lámpara de calor para mantener su temperatura corporal una vez que haya terminado la OCT. Observe a la rata para asegurarse de que salga de la anestesia y controle diariamente cualquier signo de angustia. Notifique al veterinario de inmediato si tiene inquietudes.

Usando nuestra técnica, administramos de manera consistente y exitosa células humanas de EPR en el espacio subretiniano. Inmediatamente después del trasplante, realizamos un examen OCT para observar el lugar de la inyección y la ampolla subretiniana creada por las células trasplantadas. Esto sirve como una buena herramienta de detección para evaluar la calidad de las inyecciones y el grado de daño en la retina o hemorragia.

Se pudo ver un reflejo de luz brillante alrededor del lugar de la inyección y una ampolla subretiniana llena de la suspensión celular bajo la exploración OCT. No hay sangrado, fuga de líquido interocular o desprendimiento de retina, alrededor del sitio de la inyección o el espacio intravítreo en una inyección exitosa, lo que demuestra el trauma mínimo causado por la inyección. Los ojos de rata operados fueron nucleados, fijados y seccionados para su análisis inmunohistológico a los siete días después del trasplante.

Para detectar las células trasplantadas se utilizaron el marcador nuclear humano, Hunu, y el marcador de células RPE, OTX2. Un estado positivo de ambos marcadores mostró que las células EPR humanas trasplantadas estaban ubicadas en el espacio subretiniano de los ojos de rata. Esta técnica de inyección subretiniana transescleral es sencilla y fácil de aprender.

Causa menos trauma quirúrgico y deja la retina intacta al pasar la aguja de inyección a través de las capas externas de la pared del ojo, sin romper la retina neural. Las gotas cuantificadas para que la aguja piloto y la aguja de inyección penetren en el tejido y el ángulo utilizado durante la inyección permiten la administración de células de forma fiable en el espacio subretiniano con una precisión y una tasa de éxito mucho mayores. Con este método de inyección, administramos de manera consistente y exitosa células RPE derivadas de células madre RPE humanas en el espacio subretiniano de ratas RCS.

Este procedimiento puede ser repetido fácilmente por cualquier persona que vea el video.