Limbal Inyección-Enfoque Subretinal de vectores virales para terapia génica en ratones epitelio pigmentario de la retina

El objetivo general de este procedimiento es administrar un gen diana al epitelio pigmentario de la retina en un ratón vivo. Esto se logra abriendo primero el párpado y sobresaliendo el globo ocular para exponer el ecuador. Los siguientes pasos son hacer un pequeño orificio posterior al limbo.

Inyecte los vectores virales en el espacio subretiniano con una aguja desafilada y observe la formación de una ampolla subretiniana. En última instancia, la microscopía de inmunofluorescencia se utiliza para mostrar la expresión de los marcadores de fluorescencia entregados por el virus inyectado en el epitelio pigmentario de la retina. Esta es una técnica EEG y conveniente para la inyección subretiniana de vector viral al pigmento de la retina.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que la prueba de inyección subretiniana es difícil de articular. Para los principiantes. Primero, prepare una jeringa de microlitros con una aguja roma de calibre 33 y esterilice con gas de óxido de etileno.

A continuación, prepare una dilución de los vectores virales en PBS en un tubo de microfuga a aproximadamente 1 millón de unidades de título por microlitro. Ahora, cuando cargue la jeringa, enjuáguela varias veces con la solución para eliminar cualquier espacio muerto en la jeringa. Prepare de 1,5 a dos microlitros para inyectar con la inyección de vector viral.

El anestesiado preparado con ratón adulto con una inyección intraperitoneal de diazepam lenta y sacrificado confirmó que el animal había sido anestesiado por la ausencia de reflejos. Una vez confirmada la anestesia, dilatar sus pupilas con una gota de fenilefrina al 0,5% y al 0,5% de fenilefrina. Para exponer el ecuador.

Mantenga el ojo en esta posición colocando los dedos fuera del borde orbital. A continuación, aplique una solución viscoelástica oftálmica en la superficie de la córnea y coloque un pequeño portaobjetos redondo sobre la córnea. Por lo tanto, la retina se puede ver ahora ligeramente posterior al limbo e inferior en el ojo derecho o superior en el ojo izquierdo.

Use una media aguja estéril de calibre 30 para hacer un pequeño orificio colocado temporalmente o nasalmente. Los agujeros no son buenas opciones, ya que son difíciles de cubrir. Durante la punción, no golpee el vaso limbal o la lente y no inserte toda la batalla de la aguja para las inyecciones subretinianas.

Inserte la aguja de inyección vectorial a través del orificio en un ángulo de 45 grados con respecto al plano del iris. Empuje la aguja posteriormente hacia el área peripapilar. Siguiendo el camino marcado para atravesar la cavidad vítrea.

Acercar la aguja en el espacio subretiniano hasta que se sienta una leve resistencia, lo que indica que se ha alcanzado la capa EPR. Que no penetre en el tejido escleral con una presión excesiva porque la aguja debe colocarse en el espacio subretiniano potencial. Si la aguja perfora el tejido de la espina con una potencia excesiva, entra en el espacio orbitario extraocular sin resistencia. Ahora inyecte suavemente el vector viral en el espacio subretiniano.

Mantenga la aguja muy quieta para evitar daños en los tejidos, lo cual es muy importante. A continuación, retire la aguja con la misma delicadeza. Ahora se puede soltar el globo ocular.

El parloteo subretiniano indicativo de acumulación de vectores debe ser visible. Finalmente, cierre suavemente el párpado para cubrir el lugar de la inyección. Se producirá el autosellado del orificio.

Para evaluar la entrega de genes, se sacrifica a los ratones mediante asfixia con dióxido de carbono, y después de que se haya confirmado la eutanasia. Nuclea los ojos con unas tijeras. Fije los ojos en PFA al 4% a cuatro grados centígrados durante al menos una hora, pero preferiblemente unos días después.

Agarre y perfore la córnea con pinzas y microtijeras. A continuación, se desplaza a lo largo del limbo para extraer la córnea después de la extracción de la córnea. Use fórceps para extraer el cristalino.

A continuación, recorta el cuerpo ciliar. A continuación, extraiga toda la retina del complejo esclerótica coroidea del EPR tras la extirpación de la retina. Corte el complejo radialmente desde la periferia hasta el centro cerca del nervio óptico para hacer de cuatro a ocho formas similares a pedales y haga que la estructura sea plana para el montaje.

Ahora, voltee el complejo sobre el RPE hacia abajo y recorte los tejidos restantes en el lado escleral, incluidos los músculos, la conjuntiva y el nervio óptico. Esto hace que el complejo escleral RPE Cort sea más plano y se monte en una corredera de vidrio. Absorbe el exceso de PBS con una esponja absorbente.

Aplique unos 30 microlitros de medios de montaje y cubra el complejo. Guarde la diapositiva a cuatro grados centígrados cuando no la esté viendo. Utilizando el protocolo descrito, se inyectó un vector de VI disponible comercialmente con promotores de CMV que expresan tanto GFP como RFP.

Los ojos se enuclearon después de 10 semanas y se prepararon portaobjetos de montaje plano RPE. Las intensidades de señal de GFP y RFP variaron entre las células del EPR en el lugar de la inyección, y la transducción se limitó al área donde se formó la sangre de la inyección. El aumento de cuatro DX a 400 x permitió evaluar la patología del I con aún más resolución.

Aunque no se muestra aquí, las células transducidas expresaron vector incluso 36 semanas después de la inyección. Uno masterizado. Esta técnica se puede realizar en cinco minutos si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar colocar la aguja o de manera creativa y continua en el espacio subretiniano después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la oftalmología exploraran la terapia génica para el tratamiento en el nacimiento, la patía hereditaria monogénica y la degeneración macular relacionada con la edad.