Name: Limbal Inyección-Enfoque Subretinal de vectores virales para terapia génica en ratones epitelio pigmentario de la retina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Aprende la técnica de inyección subretinosa limbal para terapia génica en ratones, entregando vectores virales al epitelio pigmentario de la retina. Este método reproducible facilita la investigación en oftalmología y neurociencia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este estudio fue apoyado por la Universidad Nacional de Seúl Beca de Investigación (800-20140542), el Programa de Investigación de Pioneer NRF / MEST (2012-0009544), y el Programa de Bio-Signal Analysis Innovación Tecnológica de la NRF / MEST (2009-0090895), y la concesión de NRF / MEST (2015M3A9E6028949).

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología para el Uso de Animales en Oftálmica y Vision Research, y las directrices y normas establecidas por el Comité Nacional de Seúl Cuidado de Animales institucional y el empleo de la Universidad Nacional de Seúl y Universidad Comité de Bioseguridad del hospital. 1. Preparación Kit de inyección y virales Vectores <ol><li> Prepare la jeringa microlitro equipado con una aguja roma 33 G esterilizada utilizando gas de óxido de etileno. Diluir los vectores virales en PBS durante la titulación adecuada en el tubo micro (es decir, 1 x 10 6 TU / l). Enjuague la jeringa varias veces con vectores virales para eliminar cualquier espacio muerto en la jeringa. </li></ol> 2. La inyección subretiniana de vectores virales <ol><li> Anestesiar los ratones adultos (es decir, 6 - 8 semanas de edad) con una inyección intraperitoneal de la mezcla de tiletaminane y zolazepam (1: 1, 2,25 mg / kg de peso corporal) y clorhidrato de xilazina (0,7 mg / kg de peso corporal) o un régimen de anestesia adecuada alternativa. </li><li> Dilatar los alumnos con un colirio de fenilefrina al 0,5% y tropicamida 0,5%. </li><li> Prepare la jeringa microlitro cargando con 1,5-2 l de vectores virales. </li><li> Abra el párpado y el ojo sobresalga para exponer el ecuador para inyección conveniente y centrarse en bajo el microscopio operativo. Mantener la posición del ojo sobresalía hasta terminar la inyección, o el desplazamiento de la aguja puede ocurrir durante la inyección. Para mantener el globo ocular con firmeza, coloque los dedos fuera del reborde orbitario. </li><li> Aplicar una gota de solución oftálmica viscoelástica a la superficie corneal. </li><li> Coloque un pequeño tobogán cubierta redonda en la parte superior de la córnea para visualizar la retina. </li><li> Perforar un pequeño agujero en ligero detrás del limbo utilizando un estéril 30 G 1/2 aguja para la inyección subretiniana más. Hacer el agujero inferior for el ojo derecho, y superior para el ojo izquierdo por la comodidad. NOTA: Si el agujero se hace en temporal o nasal, es difícil ser cubierto por el párpado después de la inyección. Punción inicial debe hacerse ligeramente por detrás del limbo para evitar los vasos del limbo que se ejecutan a lo largo del limbo y se pueden reconocer fácilmente. Tenga cuidado de no golpear el objetivo con la aguja al hacer la punción inicial. No inserte todo el bisel de la aguja para evitar la punción de la lente. </li><li> Coloque la aguja roma 33 G de la jeringa microlitro a través del orificio pre-perforado y acercarse a la aguja en el espacio subretiniano, hasta el punto en que se sienta resistencia leve. NOTA: Para la inyección subretiniana, el mejor ángulo de aproximación de la aguja es de unos 45 grados contra plano del iris, y la aguja roma debería ser empujado posteriormente hacia el área peripapilar. Cuadrada punteada indica la vía aguja sugerido a través de la cavidad vítrea para el injectio subretinianan en la Figura 1. NOTA: No habrá resistencia sintió cuando la perforación (o paso) las capas de la retina, ya que son muy suaves. Así, el primer sentimiento de resistencia leve indica que la aguja ya ha tocado la capa de RPE y la inserción de la aguja debe ser detenido. Tener cuidado de no penetrar en el tejido escleral con una presión excesiva debido a que la aguja debe ser colocado en el potencial espacio subretiniano. Si la aguja perfora el tejido de la esclerótica por potencia excesiva, entra en los espacios orbitales extraoculares sin resistencia. (Este paso es crítico) </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53030/53030fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema de la inyección subretiniana. H &amp; E manchadas sección transversal del ojo del ratón que representa las estructuras con una vía de aguja para la inyección subretiniana marcada (un cuadrado de puntos). Ampliación: 40X, barra de escala:<html> 500 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53030/53030fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <ol start="9"><li> Inyectar los vectores virales (por ejemplo, 1 x 10 6 TU / l) suavemente en el espacio subretiniano sin temblor de evitar daños en el tejido no deseado y retirar la aguja suavemente. Sostenga firmemente el globo ocular durante la inyección como se describe en 2.4. </li><li> Observar la formación de la ampolla subretiniana después de la inyección bajo microscopio quirúrgico para asegurarse de que no hay hemorragia retiniana. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53030/53030fig2.jpg" /> Figura 2. Subretinal BELB Formación sin retiniana Hemorragia. Vista microscópica de BELB subretiniana después de la inyección subretiniana bajo microscopio quirúrgico muestra la formación de vesículas éxito sin hemorragia retiniana.m / files / ftp_upload / 53030 / 53030fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <ol start="11"><li> Cierre suavemente el párpado para cubrir el lugar de la inyección para la auto-sellado. Devolver los ratones para jaula y mantenerse con vida hasta la evaluación. NOTA: Después de que los investigadores se acostumbran a los procedimientos, que pueden obtener los resultados repetibles con procedimientos rápidos saltarse estos pasos por (2.5, 6 y 10) </li></ol> 3. Evaluación de la eficacia de la entrega de genes en el epitelio pigmentario de la retina <ol start="1"><li> Sacrificar los ratones en la cámara de CO 2. Enuclear los ojos con unas tijeras. </li><li> Fijar los ojos en la solución de paraformaldehído al 4% a 4 ° C durante un mínimo de 1 hora a varios días. </li><li> Coge la córnea con unas pinzas finas y perforar la córnea con micro-tijeras. Retire la córnea después de tijera a lo largo del limbo. Retire la lente con unas pinzas. </li><li> Recorte el cuerpo ciliar con mICRO-tijeras que permiten el desprendimiento de retina. Tire suavemente toda la retina de la / coroides / esclerótica complejo EPR. Cortar el RPE / coroides / complejo escleral radialmente desde la periferia hacia el centro, cerca del nervio óptico varias veces para asegurarse de 4 a 8 hojas para el montaje plana. </li><li> Da la vuelta al RPE / coroides / complejo escleral para hacer lateral RPE abajo, y recortar todos los tejidos que quedan en la parte escleral incluyendo los músculos, la conjuntiva y el nervio óptico. Este paso es importante hacer una RPE / coroides / complejo escleral plana porque cualquier tejido restante hace que el complejo desigual. </li><li> Incubar el complejo con el anticuerpo primario y secundario para sus fines específicos de investigación (opcional, consulte las referencias para los métodos detallados). Piso-montar las RPE / coroideo / complejos escleral en el portaobjetos de vidrio y absorber el PBS con una esponja absorbente. </li><li> Añadir 30 l de solución de montaje y coloque la tapa deslizante. Observar la muestra de la eficacia de la prestación de vector bajo el microscopio fluoresceína. Mantener las muestras enel refrigerador para su posterior observación. </li></ol>

<ol><li>Maguire, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+efficacy+of+gene+transfer+for+Leber%27s+congenital+amaurosis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis.</a> N Engl J Med. 358 (21), 2240-2248 (2008).</li>
<li>Jacobson, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+leber+congenital+amaurosis+caused+by+RPE65+mutations%3A+safety+and+efficacy+in+15+children+and+adults+followed+up+to+3+years%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for leber congenital amaurosis caused by RPE65 mutations: safety and efficacy in 15 children and adults followed up to 3 years.</a> Arch Ophthalmol. 130 (1), 9-24 (2012).</li>
<li>Conlon, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+potency+and+safety+studies+of+an+AAV2-mediated+gene+therapy+vector+for+the+treatment+of+MERTK+associated+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Preclinical potency and safety studies of an AAV2-mediated gene therapy vector for the treatment of MERTK associated retinitis pigmentosa.</a> Hum Gene Ther Clin Dev. 24 (1), 23-28 (2013).</li>
<li>MacLaren, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+gene+therapy+in+patients+with+choroideremia%3A+initial+findings+from+a+phase+1%2F2+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Retinal gene therapy in patients with choroideremia: initial findings from a phase 1/2 clinical trial.</a> Lancet. 383 (9923), 1129-1137 (2014).</li>
<li>Trapani, I., Puppo, A., Auricchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+platforms+for+gene+therapy+of+inherited+retinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Vector platforms for gene therapy of inherited retinopathies.</a> Prog Retin Eye Res. 43, 108-128 (2014).</li>
<li>Liang, F. Q., Anand, V., Maguire, A. M., Bennett, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraocular+delivery+of+recombinant+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Intraocular delivery of recombinant virus.</a> Methods Mol Med. 47, 125-139 (2001).</li>
<li>Peyman, G. A., Lad, E. M., Moshfeghi, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravitreal+injection+of+therapeutic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Retina%22%5BJournal%5D)">Intravitreal injection of therapeutic agents.</a> Retina. 29 (7), 875-912 (2009).</li>
<li>Matsumoto, H., Miller, J. W., Vavvas, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+detachment+model+in+rodents+by+subretinal+injection+of+sodium+hyaluronate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Retinal detachment model in rodents by subretinal injection of sodium hyaluronate.</a> J Vis Exp. (79), (2013).</li>
<li>Wert, K. J., Skeie, J. M., Davis, R. J., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subretinal+injection+of+gene+therapy+vectors+and+stem+cells+in+the+perinatal+mouse+eye%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye.</a> J Vis Exp. (69), (2012).</li>
<li>Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subretinal+transplantation+of+MACS+purified+photoreceptor+precursor+cells+into+the+adult+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Subretinal transplantation of MACS purified photoreceptor precursor cells into the adult mouse retina.</a> J Vis Exp. (84), e50932(2014).</li>
<li>Sahel, J. A., Roska, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+blindness%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for blindness.</a> Annu Rev Neurosci. 36, 467-488 (2013).</li>
<li>Allocca, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+adeno-associated+virus+serotypes+efficiently+transduce+murine+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Novel adeno-associated virus serotypes efficiently transduce murine photoreceptors.</a> J Virol. 81 (20), 11372-11380 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+transduction+of+ocular+cells+with+a+bovine+immunodeficiency+viral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Sustained transduction of ocular cells with a bovine immunodeficiency viral vector.</a> Hum Gene Ther. 13 (11), 1305-1316 (2002).</li>
<li>Rolling, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapeutic+prospects+in+early+onset+of+severe+retinal+dystrophy%3A+restoration+of+vision+in+RPE65+Briard+dogs+using+an+AAV+serotype+4+vector+that+specifically+targets+the+retinal+pigmented+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+Mem+Acad+R+Med+Belg%22%5BJournal%5D)">Gene therapeutic prospects in early onset of severe retinal dystrophy: restoration of vision in RPE65 Briard dogs using an AAV serotype 4 vector that specifically targets the retinal pigmented epithelium.</a> Bull Mem Acad R Med Belg. 161 (10-12), 497-508 (2006).</li>
<li>Le Meur, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+vision+in+RPE65-deficient+Briard+dogs+using+an+AAV+serotype+4+vector+that+specifically+targets+the+retinal+pigmented+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Restoration of vision in RPE65-deficient Briard dogs using an AAV serotype 4 vector that specifically targets the retinal pigmented epithelium.</a> Gene Ther. 14 (4), 292-303 (2007).</li>
<li>Alexander, J. J., Hauswirth, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+viral+vectors+and+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated viral vectors and the retina.</a> Adv Exp Med Biol. 613, 121-128 (2008).</li>
<li>Puche, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+environmental+factors+associated+with+reticular+pseudodrusen+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Retina%22%5BJournal%5D)">Genetic and environmental factors associated with reticular pseudodrusen in age-related macular degeneration.</a> Retina. 33 (5), 998-1004 (2013).</li>
<li>Campochiaro, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+for+neovascular+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene transfer for neovascular age-related macular degeneration.</a> Hum Gene Ther. 22 (5), 523-529 (2011).</li>
<li>Park, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+amyloid+beta+alters+the+tight+junction+of+retinal+pigment+epithelium+in+5XFAD+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Intracellular amyloid beta alters the tight junction of retinal pigment epithelium in 5XFAD mice.</a> Neurobiol Aging. 35 (9), 2013-2020 (2014).</li>
<li>Shin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+cleavage+of+amyloid+beta+by+a+viral+protease+NIa+prevents+amyloid+beta-mediated+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Intracellular cleavage of amyloid beta by a viral protease NIa prevents amyloid beta-mediated cytotoxicity.</a> PLoS One. 9 (6), e98650(2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este artículo de vídeo, describimos la técnica de inyección subretiniana limbo-enfoque en detalle con resultados representativos de RPE / coroides / esclerótica de montaje plana. Esta es una técnica fácil y conveniente para la inyección subretiniana de vectores virales en RPE. La visualización directa de la formación de la ampolla durante la inyección es un paso importante para la entrega exacta para los principiantes. Hay algunas técnicas subretinianas inyección introducidos en Journal of experimentos visualizados <...

En oftalmología, terapia génica ha emergido como la modalidad de tratamiento de retinopatías hereditarias monogénicas. Hay retinopatías hereditarias asociadas con genes en el epitelio pigmentario de la retina (EPR) incluyendo Leber amurosis congénita 1,2, la retinitis pigmentosa 3 y 4 coroideremia. El campo de la investigación de la terapia génica se está expandiendo en ambos estudios preclínicos y ensayos clínicos utilizando vectores virales como el virus adeno -Associated (AAV), lentivirus (LV) y adenovirus (Ad) 5. Diferentes vectores virales tienen diferente tropismo en la retina. Para una terapia génica seguros y eficaces, vectores virales deben ser seleccionados cuidadosamente de acuerdo con las células diana y los genes diana. La ruta de administración de genes también es importante para la administración de genes eficaz a las células diana, por lo tanto, debe elegirse cuidadosamente, también. Los dos métodos más comunes para la entrega intraocular de vectores virales se subretinal inyección y la inyección intravítrea 6. Este último, inyección intravítrea, ha sido ampliamente utilizado para la administración de fármacos para el tratamiento de la neovascularización coroidea en la degeneración húmeda macular relacionada con la edad (AMD) y edema macular en la retinopatía diabética 7. Ruta intravítrea proporciona una exposición de vectores virales a retina vítreo e interior, pero la difusión de los vectores de retina externa es limitado. Por otra parte, la ruta subretinal proporciona la entrega directa de vectores virales para el espacio potencial entre la retina y RPE, induciendo una ampolla localizada. Por lo tanto, la inyección subretiniana se considera actualmente una ruta más eficiente para atacar a las células fotorreceptoras y RPE. En términos de abordaje quirúrgico, pars plana es elegido como un lugar seguro para la inyección intravítrea de evitar daños a la retina en pacientes humanos. Simplemente modificando este enfoque a los ratones, podríamos inyectar vectores virales subretinally o intravireally través enfoque del limbo. En este videoartículo, demostramos un método fácil y conveniente de la inyección subretiniana de vectores virales en ratones RPE. Después de la punción única en posterior a limbo con un medio de aguja 30 G, 33 una aguja roma G microlitro equipado jeringa se inserta en el espacio subretiniano a través del sitio de la punción limbal. Los vectores virales de 1,5-2 l de volumen se inyectan al espacio potencial entre la retina y el RPE inducir ampollas subretinianas. Este procedimiento se puede realizar bajo visualización directa usando microscopio quirúrgico. La práctica repetida garantiza resultados reproducibles incluso sin la visualización directa de la formación de la ampolla. Esto ayudará a los investigadores a realizar experimentos precisos y de ahorro de tiempo para la entrega de genes en ratones subretiniano RPE.

<table><tbody><tr><td>PINZAS DUMONT #5 11cm DUMOSTAR 0,1 x 0,06 mm PUNTAS</td><td>WPI</td><td>500233</td><td></td></tr><tr><td>VANNAS Tijeras S/S, 105 mm</td><td>WPI</td><td>555583S</td><td></td></tr><tr><td>33 G Aguja roma</td><td>WPI</td><td>NF33BL-2</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa NanoFil, 10 microlitros&nbsp;</td><td>WPI</td><td>NANOFIL</td><td></td></tr><tr><td>RPE-KIT</td><td>WPI</td><td>RPE-KIT</td><td>Para una inyección sencilla con una sola mano</td></tr><tr><td>BD PrecisionGlideTM Aguja</td><td>BD</td><td>305107</td><td>Punción inicial para inyección subretiniana</td></tr><tr><td>Cubreobjetos de microscopio (n.º 1, 3 mm de diámetro)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0720&nbsp; (CS-3R)</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio quirúrgico Leica</td><td></td><td>LM M80</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de fluoreseceína</td><td>Nikon</td><td>Eclipse 80i</td><td></td></tr><tr><td>Lentivirus</td><td>Thermo scientific</td><td>TMO. LV-Ctr</td><td>Se utiliza para diluir</td></tr><tr><td>vectores PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-015</td><td>Se utiliza para diluir vectores</td></tr><tr><td>Troperin (Fenilefrina 0,5% - Tropicamida 0,5%)</td><td>Hanmi</td><td></td><td>Para la dilatación</td></tr><tr><td>Clorhidrato de proparacaína Solución oftálmica USP, 0,5% (Estéril)</td><td>Bausch& Lomb</td><td></td><td>Para anestesia tópica</td></tr><tr><td>Healon GV OVD</td><td>Abbott Medical Optics Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zoletil 50 (hipocloruro de tiletamina e hipocloruro de zolazepam)</td><td>Virbac</td><td></td><td>Para anestesia general</td></tr><tr><td>Rompun inyectable (xilacina HCl)</td><td>Bayer</td><td></td><td>Para anestesia general</td></tr></tbody></table>

limbal inyección-enfoque subretinal de vectores virales para terapia génica en ratones epitelio pigmentario de la retina

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

El ojo es un órgano pequeño y cerrado, lo que lo convierte en un objetivo ideal para la terapia génica. Recientemente, se han aplicado diversas estrategias a la terapia génica en retinopatías mediante la entrega de genes virales y no virales a la retina y al epitelio pigmentario de la retina (EPR). La inyección subretiniana es el mejor enfoque para administrar vectores virales directamente a las células del EPR. Antes del ensayo clínico de una terapia génica, es inevitable validar la eficacia de la terapia en modelos animales de diversas retinopatías. Así, la inyección subretiniana en ratones se convierte en una técnica fundamental para una terapia génica ocular. En este protocolo, proporcionamos la técnica fácil y replicable para la inyección subretiniana de vectores virales a ratones experimentales. Esta técnica es una modificación de la inyección intravítrea, que es una técnica muy utilizada en las clínicas de oftalmología. Los resultados representativos del complejo RPE/coroides/escleral de montaje plano ayudarán a comprender la eficacia de esta técnica y a ajustar el volumen y el título de los vectores virales en función del grado de transducción génica.

Para evaluar la eficacia de la inyección subretiniana en viral transducción génica mediante este protocolo, hemos utilizado vectores LV disponibles en el mercado con el promotor CMV que expresa tanto las buenas prácticas agrarias y RFP para el indicador. Los ojos fueron enucleados después de que el período de tiempo adecuado de acuerdo con el propósito de la investigación. Para los resultados representativos, los ojos fueron enucleados 10 semanas y 20 semanas después de la inyección subretiniana. Después de la eliminaci...

La inyección subretiniana es una técnica quirúrgica para la entrega efectiva de genes al epitelio pigmentario de la retina en el ojo del ratón. Aquí describimos un método fácil y replicable para la inyección subretiniana de vectores virales al epitelio pigmentario de la retina en ratones experimentales.

Limbal Inyección-Enfoque Subretinal de vectores virales para terapia génica en ratones epitelio pigmentario de la retina

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

El objetivo general de este procedimiento es entregar un gen diana al epitelio pigmentario retiniano en un ratón vivo. Esto se logra primero abriendo el párpado y protruyendo el globo ocular para exponer el ecuador. Los siguientes pasos consisten en hacer un pequeño orificio posterior al limbo. Injecte los vectores virales en el espacio subretiniano mediante una aguja romada y observe la formación de una ampolla subretiniana. Finalmente, se utiliza microscopía de inmunofluorescencia para mostrar la expresión de marcadores fluorescentes entregados por el virus inyectado en el epitelio pigmentario retiniano. Esta es una técnica EEG y conveniente para la inyección subretiniana de vectores virales en el epitelio pigmentario retiniano.El epitelio La demostración visual de este método es fundamental, ya que las pruebas de inyección subretiniana son difíciles de realizar en el pulmón, especialmente para principiantes. En primer lugar, prepare una jeringa de microlitros con una aguja roma de calibre 33 esterilizada mediante gas de óxido de etileno.A continuación, prepare una dilución de los vectores virales en PBS en un tubo microcentrífugo a aproximadamente 1 millón de unidades de título por microlitro. Ahora, al cargar la jeringa, enjuáguela varias veces con la solución para eliminar cualquier espacio muerto en la jeringa. Tenga lista de 1,5 a dos microlitros para inyectar con la inyección del vector viral.Preparar un ratón adulto anestesiado mediante una inyección intraperitoneal de diazepam lenta y salina, y confirmar que el animal ha sido anestesiado por la ausencia de reflejos. Una vez confirmada la anestesia, dilatar sus pupilas con una gota de fenilefrina al 0,5 % y atropina al 0,5 %. Ahora, bajo un microscopio operatorio, abrir el párpado y hacer protruir el ojo para exponer el ecuador.Sujete el ojo en esta posición colocando los dedos fuera del borde orbitario. A continuación, aplique una solución viscoelástica oftálmica sobre la superficie corneal y coloque una pequeña lámina redonda sobre la córnea. De este modo, ahora se puede observar la retina ligeramente posterior al limbo e inferiormente en el ojo derecho o superiormente en el ojo izquierdo.Utilice una aguja estéril de calibre 30 y media para hacer un pequeño orificio colocado temporal o nasalmente. Los orificios no son una buena opción, ya que son difíciles de cubrir. Al perforar, no golpee el vaso limbar ni el cristalino, y no inserte toda la longitud de la aguja para las inyecciones subretinianas.Inserte la aguja de inyección del vector a través del orificio en un ángulo de 45 grados respecto al plano de la iris. Empuje la aguja hacia posterior, en dirección al área peripapilar. Siga la trayectoria marcada para atravesar la cavidad vítrea.Acérquese con la aguja al espacio subretiniano hasta sentir una ligera resistencia, lo que indica que se ha alcanzado la capa de epitelio pigmentario de la retina (RPE). No penetre el tejido escleral con presión excesiva, ya que la aguja debe colocarse en el espacio subretiniano potencial. Si la aguja perfora el tejido escleral con demasiada fuerza, entrará en el espacio orbitario extravascular sin resistencia. Ahora inyecte suavemente el vector viral en el espacio subretiniano.Mantenga la aguja completamente inmóvil para prevenir daños en el tejido, lo cual es ampliamente importante. Luego retire la aguja con la misma suavidad. Ahora se puede soltar el globo ocular.Debería observarse un borboteo subretiniano indicativo de la acumulación del vector. Finalmente, cierre suavemente el párpado para cubrir el sitio de inyección. El orificio se sellará por sí solo.Para evaluar la entrega génica, sacrifique los ratones mediante asfixia con dióxido de carbono, después de confirmar la eutanasia. Enucleé los ojos utilizando tijeras. Fije los ojos en PFA al 4% a cuatro grados Celsius durante al menos una hora, aunque preferiblemente durante varios días.Sujete y punzure la córnea utilizando fórceps y tijeras microquirúrgicas. Luego, corte a lo largo del limbo para retirar la córnea tras su remoción. Utilice fórceps para extraer el cristalino.A continuación, recorte el cuerpo ciliar. Luego, retire toda la retina del complejo epitelio pigmentario de la retina, coroides y esclerótica tras la extracción de la retina. Corte el complejo radialmente desde la periferia hacia el centro, cerca del nervio óptico, para obtener cuatro a ocho formas similares a pedales y lograr una estructura plana que facilite el montaje.Ahora, gire el complejo con el lado de la EPR hacia abajo y corte cualquier tejido restante en el lado escleral, incluyendo músculos, conjuntiva y nervio óptico. Esto permite obtener una preparación plana del complejo escleral con la EPR sobre un portaobjetos de vidrio. Absorba el exceso de PBS con una esponja absorbente.Aplique aproximadamente 30 microlitros de medio de montaje y cubra el complejo con un cubreobjetos. Almacene el portaobjetos a cuatro grados Celsius cuando no se esté observando. Utilizando el protocolo descrito, se inyectaron vectores de LV disponibles comercialmente con promotores CMV que expresan GFP y RFP.Los ojos fueron enucleados tras 10 semanas y se prepararon portaobjetos con montajes planos de epitelio pigmentario retiniano (RPE). Las intensidades de señal de GFP y RFP variaron entre las células del RPE en el sitio de inyección, y la transducción se limitó al área donde se formó el coágulo de sangre tras la inyección. Aumentar el aumento desde cuatro DX hasta 400 x permitió evaluar la patología del I con una resolución aún mayor.Aunque aquí no se muestra, las células transducidas expresaron el vector incluso 36 semanas después de la inyección. Uno dominado. Esta técnica puede realizarse en cinco minutos si se lleva a cabo correctamente.Al intentar este procedimiento, es importante recordar colocar la aguja de forma creativa y hábilmente en el espacio subretiniano después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la oftalmología exploraran la terapia génica como tratamiento para enfermedades congénitas, patologías hereditarias monogénicas y degeneración macular asociada a la edad.

limbal-approach-subretinal-injection-viral-vectors-for-gene-therapy

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Esta técnica quirúrgica ilustra la inyección de vectores de terapia génica y las células madre en el espacio subretiniano del ojo del ratón.

Inyección subretiniana de vectores de terapia génica y células madre en el ojo del ratón

Fuente: Park, S. W., et al. Abordaje limbal-inyección subretiniana de vectores virales para terapia génica en el epitelio pigmentario de la retina de ratones. J. Vis. Exp. (2015)El video describe el método para la inyección subretiniana de vectores virales en el epitelio pigmentario de la retina (EPR) en un modelo de ratón. Detalla el procedimiento desde la anestesia y la preparación ocular hasta la administración precisa del vector lentiviral, asegurando la integración y expresión génica en el...

Inyección subretiniana de vectores virales en el epitelio pigmentario de la retina en un modelo de ratón

Aquí presentamos un protocolo aceptado por la comunidad en formato multimedia para inyectar subretinialmente un bolo de células EPR en ratas y ratones. Este enfoque se puede utilizar para determinar los potenciales de rescate, los perfiles de seguridad y las capacidades de supervivencia de las células EPR injertadas tras la implantación en modelos animales de degeneración de la retina.

Realizar Subretinal Inyecciones en roedores administrar células de la retina epitelio pigmentario en Suspensión

Las inyecciones subretinianas son la técnica más común para administrar grandes agentes terapéuticos, como proteínas y vectores virales, a los fotorreceptores y al epitelio pigmentario de la retina. Aquí se describe un método alternativo en ratones que se dirige con éxito al espacio subretiniano con un daño colateral mínimo y tiempos de recuperación rápidos.

Un método alternativo de inyección y validado para acceder al espacio subretiniano<i&gt; vía</i&gt; Un enfoque posterior transescleral

Aquí nos muestran un nuevo enfoque al uso de tomografía de coherencia óptica de dominio espectral de alta resolución (HR-SD-OCT) para facilitar la presentación de los agentes de terapia génica en el espacio subretinal, evaluar su cobertura areal y caracterizan la vitalidad del fotorreceptor.

Tomografía de coherencia óptica ultraalta resolución ratón para facilitar la inyección Intraocular en investigación de retina la terapia génica

En este manuscrito, la inyección subconjuntival se demuestra como un método válido de administración de vectores para tejidos oculares en ratones utilizando un sistema de inyección que consiste en una bomba de jeringa de infusión/extracción y una jeringa extraíble hermética al gas acoplada con agujas de microinyección. Este sistema de inyección también es adaptable para otras vías de administración intraocular.

Administración subconjuntival de vectores de virus adenoasociados en modelos de animales pequeños

Se realizaron inyecciones intravítreas en el ojo de oveja con el objetivo de administrar terapia génica mediada por virus a la retina.

Inyecciones intravítreas en el ojo ovino

Este protocolo presenta un abordaje transescleral transpupilar guiado por visión para administrar de forma segura y precisa injertos celulares subretinianos, con una baja tasa de complicaciones quirúrgicas, en receptores de ratón con o sin degeneración retiniana.

Trasplante transescleral guiado por transpupilar de injertos subretinianos en un modelo de ratón con degeneración retiniana

Describimos un protocolo detallado para la preparación de células progenitoras fotorreceptoras derivadas de hESC post-criopreservadas y la administración sub-retiniana de estas células en ratones rd10 .

Entrega sub-retiniana de progenitores fotorreceptores derivados de células madre embrionarias humanas en ratones rd10

Las inyecciones subretinianas son una técnica indispensable para el desarrollo preclínico de terapias para enfermedades de fotorreceptores y EPR. Describimos una técnica de inyección subretiniana transescleral optimizada en ratones que mejora las tasas de éxito intraoperatorio y minimiza el daño retiniano.

Técnica de inyección subretiniana transescleral mínimamente invasiva optimizada en ratón

Aprende la técnica de inyección subretinosa limbal para terapia génica en ratones, entregando vectores virales al epitelio pigmentario de la retina. Este método reproducible facilita la investigación en oftalmología y neurociencia.

Limbal Inyección-Enfoque Subretinal de vectores virales para terapia génica en ratones epitelio pigmentario de la retina

Explorar más videos