Name: Producción, Cristalización y determinación de la estructura de C. difícil PPEP-1 a través de microsiembra y Zinc-SAD (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: Aprende a producir cristales de alta calidad de PPEP-1 de C. difficile mediante microsiembra para análisis de difracción de rayos X. Este método mejora la cristalización de proteínas con cristales intercrecidos.

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Agradecemos al personal de la X06DA línea de luz en la fuente de luz suiza, Paul-Scherrer-Institute, Villigen, Suiza por su apoyo durante la recolección de datos de sincrotrón. Estamos muy agradecidos a Monika Gompert por su excelente apoyo técnico. El proyecto fue apoyado por la Universidad de Colonia y conceder INST 216 / 682-1 Fugg del Consejo de Investigación Alemán. Una beca de doctorado de la Escuela Internacional de Posgrado en Salud y Enfermedad Desarrollo de CP se reconoce. La investigación que lleva a estos resultados ha recibido financiación del Séptimo Programa Marco de la Comunidad Europea (FP7 / 2007-2013) en virtud de acuerdo de subvención nº 283570 (BioStruct-X).

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Los autores no tienen nada que revelar.

La cristalografía de rayos X sigue siendo el método más rápido y más preciso para determinar las estructuras tridimensionales de resolución casi atómica de proteínas 28. Sin embargo, requiere el crecimiento de cristales únicos bien ordenadas. Estos a menudo son difíciles de conseguir y el estado cristalino es artificial. Sin embargo, una comparación de las estructuras de proteínas determinadas por cristalografía de rayos X con los determinados por otros métodos, especialmente NMR, muestra generalmente una muy...

Clostridium difficile es una de las principales causas de las infecciones diarrea asociada a antibióticos nosocomiales 1. Esta bacteria anaerobia Gram-positiva se transmite a través de su forma de esporas a través de la vía fecal-oral. En la última década, la nueva &#39;&#39; epidemia &#39;&#39; o &#39;&#39; hypervirulent &#39;&#39; (por ejemplo, las cepas de BI / NAP1 / 027) produjo un aumento drástico de las nuevas infecciones y las tasas de mortalidad en América del Norte y Europa 2. C. difficile enfermedad -asociado (CDAD) es una amenaza para la vida inflamación del colon con altas tasas de mortalidad 3. Los síntomas varían desde diarrea 4 a 5 colitis pseudomembranosa y el megacolon tóxico menudo fatal 6. El tratamiento de la CDAD es difícil, ya que las cepas virulentas son resistentes a múltiples fármacos y la tasa de recurrencia es alto 7. En la terapia de momento incluye el metronidazol antibióticos, fidaxomicina o vancomicina, o en repetitivamente los casos recurrentes de trasplante fecal microbiota. Se necesitan con urgencia 8 nuevas estrategias terapéuticas. Algunos avances se registra como el anticuerpo monoclonal terapéutico Bezlotoxumab, apuntando a la toxina de C. difficile B 9, recientemente ha superado con éxito la fase III de ensayos clínicos y fue presentado para su aprobación por la FDA y EMA. Además, los nuevos antibióticos se están probando en el momento en diferentes etapas de los ensayos clínicos 10. Para desarrollar un tratamiento eficaz nuevas dianas terapéuticas deben ser identificados. El recientemente descubierto C. difficile proteasa endopeptidasa-1-prolina prolina (PPEP-1; CD2830 / Zmp1; EC 3.4.24.89) es un objetivo tan prometedor, ya que la falta de PPEP-1 en una cepa knock-out disminuye la virulencia de C . difficile in vivo 11. PPEP-1 es una metaloproteasa secretada 12,13 escindir dos adhesinas de C. difficile en su C-terminal 13 liberando así la bacter adherenteia del epitelio intestinal humano. Por lo tanto, está implicado en el mantenimiento del equilibrio entre el fenotipo sésiles y móviles de C. difficile. Para desarrollar inhibidores selectivos contra PPEP-1 y para entender la forma en que reconoce sus sustratos conocimiento íntimo de su estructura tridimensional es indispensable. Hemos resuelto la primera estructura cristalina de PPEP-1 sola y en complejo con un péptido sustrato 14. PPEP-1 es la proteasa primera sabido que selectivamente escinde enlaces peptídicos entre dos residuos de prolina 15. Se une el sustrato de una manera de doble retorcido y la estabiliza a través de una red alifático-aromático prolongado de residuos localizados en el S-bucle que cubre el sitio activo de la proteasa 14. Este modo de unión al sustrato es aplicable sólo a PPEP-1 y no se encuentra en proteasas humanas hasta la fecha. Esto hace que sea un objetivo prometedor fármaco, y fuera de objetivo efectos de los inhibidores muy improbables. Para el desarrollo y la pantalla selectiva PPEP-1 inhibitors en el futuro se necesita una gran cantidad de proteína pura y monodispersa PPEP-1. Además, para determinar el modo de unión de los primeros inhibidores, estructuras co-cristalinas con PPEP-1 tendrá que ser determinado. En nuestras manos PPEP-1 produce constantemente cristales intergrown. Por lo tanto, hemos desarrollado un procedimiento de optimización para producir monocristales calidad de difracción de PPEP-1. En este protocolo se describe en detalle la solución de producción, purificación, cristalización y la estructura de PPEP-1 14. Utilizamos la expresión intracelular en Escherichia coli de una variante PPEP-1 carece de la secuencia señal de secreción, cromatografía de afinidad y cromatografía de exclusión de tamaño con la eliminación de la etiqueta de purificación, seguido por microsiembra 16 en una pantalla de la optimización y la determinación de la estructura a través de zinc única longitud de onda de dispersión anómala (zinc-SAD) 17. Este protocolo puede ser adaptado para la determinación de la producción y la estructura de otras proteínas (por ejemplo, &lt;/ Em&gt; metaloproteasas) y en particular para las proteínas que producen cristales entrecrecidos. A petición, el ADN del plásmido de la construcción (pET28a-NHis-rPPEP-1) y los datos de difracción se puede proporcionar con fines educativos.

<table><tbody><tr><td>Genes / Vectores / cepas celulares</vector strong></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET28a</td><td>Merck-Millipore</td><td>69864</td><td>Trombina escindible N-terminal His-tag</td></tr><tr><td>E. coli cepa BL21 (DE3) Star</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C601003</td> gen optimizado para <td>codón deficiente en RNasa</td></tr><tr><td>H (para E. coli) de PPEP-1 (CD630_28300)</td><td>Geneart (Thermo Fisher Scientific)</td>aminoácidos <td>personalizados</td><td>27-220</td></tr><tr><td><fuerte>Nombre</fuerte></td><td><fuerte>Empresa</fuerte></td><td><fuerte>Número de catálogo</fuerte></td><td><fuerte>Comentarios</fuerte</td></tr><tr><td>><fuerte>Químicos</fuerte>Extracto de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>levadura</td><td>cualquiera</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>cualquiera</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antiespumante B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5757</td><td>emulsión acuosa de silicona</td></tr><tr><td>Agar</td><td>cualquier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>cualquier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>AppliChem</td><td>A1008</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>AppliChem</td><td>A1087</td><td>Grado tampón</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>cualquier</td><td></td><td>Grado tampón</td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>AppliChem</td><td>A3778</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>AppliChem</td><td>A1073</td><td>Grado tampón</td></tr><tr><td>Trombina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4648</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de amonio dibásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>215996</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol 100%</td><td>cualquier</td><td></td><td>grado puro</td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>Líquido nitrógeno</td><td>cualquiera</td><td></td><td>para el almacenamiento y el enfriamiento criogénico de cristales</td></tr><tr><td><fuerte>Nombre</fuerte></td><td><fuerte>Empresa</fuerte</td><td>><fuerte>Número de catálogo</fuerte></td><td><fuerte>Comentarios</fuerte></td></tr><tr><td><fuerte>Equipo (general)</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agitar</td><td>incubadora cualquiera</td><td></td><td>que proporcione temperaturas de 20 &deg; C - 37 &deg; C</td></tr><tr><td>Cristalería</td><td>: cualquier</td><td></td><td>matraz Erlenmeyer con deflector (50 ml - 2,8 L)</td></tr><tr><td>Centrífuga para grandes volúmenes de cultivo</td>, <td>cualquier</td><td></td><td>centrífuga para volúmenes de procesamiento de hasta 12 L</td></tr><tr><td>Sonicator Vibra-Cell VCX500</td><td>Sonics</td><td>SO-VCX500</td><td>o cualquier otro sonicador / disruptor de células</td></tr><tr><td>Ultracentrífuga</td><td>cualquier</td><td></td><td>centrífuga que proporciona velocidades de hasta 150.000 x g</td></tr><tr><td>Resina NiNTA Superflow</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Empty Glass Econo-Column</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>7371007 o cualquier otra columna de vidrio o plástico vacía</td></tr><tr><td>Exclusión de tamaño columna de cromatografía HiLoad Superdex 200 16/600</td><td>GE Healthcare</td><td>28989335</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de cromatografía &Auml; KTA Purificador</td><td>GE Healthcare</td><td>28406264</td><td>o cualquier otro sistema de cromatografía</td></tr><tr><td>Tubos de diálisis Spectra/Por 3</td><td>Spectrum Labs</td><td>132724</td><td></td></tr><tr><td>Cierres de tubos de diálisis</td><td>Spectrum Labs</td><td>132738</td><td></td></tr><tr><td>Unidades de ultrafiltración (concentradores) 10.000 NWCO</td><td>cualquier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>espectrofotómetro UV-Vis</td><td>cualquier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Compañía</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Equipo (cristalografía)</td>Pipeta de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>bajo volumen 0.1-10 &micro; l</td><td>cualquier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pipeta de desplazamiento positivo Microman M10</td><td>Gilson</td><td>F148501</td><td></td></tr><tr><td>Robot de cristalización</td>, <td>cualquier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>placa de cristalización de 96 pocillos TTP IQ con tres pocillos de proteínas</td><td>TTP</td><td>4150-05810</td><td>o cualquier otra placa de cristalización de 96 pocillos&nbsp;</td></tr><tr><td>Placa CombiClover Junior de 24 pocillos</td><td>Jena Bioscience</td><td>EB-CJR</td><td></td></tr><tr><td>Cinta de sellado transparente</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-511</td><td></td></tr><tr><td>Diapositivas de cubierta de vidrio siliconado</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-225</td><td></td></tr><tr><td>Pantallas de cristalización comerciales: SaltRx, Index, PEG/Ion, Crystal</td><td>Hampton Research</td><td>diversas</td><td></td></tr><tr><td>pantallas de cristalización comerciales: Wizard, PACT++, JCSG++</td><td>Jena Bioscience</td><td>diverso</td><td></td></tr><tr><td>JBS Beads-for-Seeds</td><td>Jena Bioscience</td><td>CO-501</td><td></td></tr><tr><td>CrystalCap SPINE HT (bucles de nylon)</td><td>Hampton Research</td><td>diversos</td><td>tamaños de bucle 0,025 mm - 0,5 mm</td></tr><tr><td>CrystalCap Vial</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-904</td><td></td></tr><tr><td>Espuma criogénica Dewar 800 ml</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-673</td><td></td></tr><tr><td>Espuma criogénica Dewar 2 L</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-675</td><td></td></tr><tr><td>Abrazadera de vial, recta</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-670</td><td></td></tr><tr><td>CrystalWand magnético, recto</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-729</td><td></td></tr><tr><td>CryoCane 6 Soporte para vial</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-711</td><td></td></tr><tr><td>CryoSleeve</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-708</td><td></td></tr><tr><td>CryoCane Codificador de color - White</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-713</td><td></td></tr><tr><td>Bisturí</td><td>cualquiera</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropinza</td> recta <td>cualquiera</td><td></td><td>para la manipulación de la cinta de sellado. etc.</td></tr><tr><td>Aguja de acupuntura</td><td>cualquier</td><td></td><td>p. ej. de una farmacia</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>cualquiera</td><td></td><td>para la inspección de placas de cristalización y montaje de cristales, aumento de hasta 160X</td></tr></tbody></table>

producción, cristalización y determinación de la estructura de<em&gt; c. difícil</em&gt; ppep-1 a través de microsiembra y zinc-sad

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Se necesitan nuevas terapias para tratar las infecciones por Clostridium difficile que son una amenaza importante para la salud humana. La metaloproteasa PPEP-1 de C. difficile es una diana para el desarrollo futuro de inhibidores que disminuyan la virulencia del patógeno. Para llevar a cabo la caracterización biofísica y estructural, así como el cribado de inhibidores, se necesitarán grandes cantidades de proteína pura y activa. Hemos desarrollado un protocolo para la producción y purificación eficiente de PPEP-1 mediante el uso de E. coli como huésped de expresión, produciendo cantidades suficientes y pureza de proteína para la cristalización y determinación de la estructura. Además, mediante el uso de microsiembra, los cristales de PPEP-1 altamente intercrecidos se pueden cultivar hasta obtener cristales bien ordenados adecuados para el análisis de difracción de rayos X. Los métodos también podrían utilizarse para producir otras proteínas recombinantes y para estudiar las estructuras de otras proteínas que producen cristales interclorados.

rPPEP-1 se sobreexpresa en varias cepas de E. coli, con el rendimiento más alto en E. coli BL21 (DE3) Star (Figura 1C). Después de la primera etapa de cromatografía de afinidad NiNTA la etiqueta 6xHis se puede escindir con éxito de la mayoría de la proteína y en el segundo paso NiNTA proteína no digerida se puede separar completamente de la proteína trombina digerido (Figura 1D). En una columna S200 16/600 rPPEP-1 sin etiqueta migra com...

Prolina-prolina endopeptidasa-1 (PPEP-1) es una metaloproteasa secretada y una prometedora diana farmacológica del patógeno humano Clostridium difficile. Aquí describimos todos los métodos necesarios para la producción y determinación de la estructura de esta proteína.

Producción, Cristalización y determinación de la estructura de<em&gt; C. difícil</em&gt; PPEP-1 a través de microsiembra y Zinc-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

El objetivo general de este procedimiento es hacer crecer de manera eficiente cristales de calidad de difracción de red única de la proteína recombinante prolina prolina endopeptidasa-1, o rPPEP-1. Sin este método, rPPEP-1 produce instantáneamente cristales altamente interclorados que no son adecuados para el análisis de difracción de rayos X. La principal ventaja de esta técnica es que se puede producir un gran número de cristales bien ordenados y bien difractados para la determinación estructural de rPPEP-1 en un corto período de tiempo y con un aporte de material limitado.Este procedimiento hace uso del método de la microciudad y se puede adaptar para cada condición de cristalización inicial exitosa de rPPEP-1, así como sus complejos de péptidos de sustrato. Este método se puede adaptar para producir cristales bien ordenados de prácticamente todas las proteínas que producen cristales intercrecidos. También se puede utilizar en experimentos de siembra cruzada, varianza de proteínas o en experimentos de cocristalización con moléculas pequeñas.La demostración visual del manejo de los métodos de cristalización es crucial, ya que incluso pequeñas variaciones pueden tener un impacto s

production-crystallization-structure-determination-c-difficile-ppep-1

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Aquí se describe el procedimiento aplicado en el Grupo de Biología de Membrana Caffrey estructurales y funcionales para establecer manualmente ensayos de cristalización de proteínas de la membrana lipídica en mesofases.

Cristalización de las proteínas de membrana para la Determinación de la estructura con mesofases lipídico

El diseño de fármacos basado en la estructura juega un papel importante en el desarrollo de fármacos. La búsqueda de objetivos múltiples en paralelo aumenta considerablemente las posibilidades de éxito para la detección de plomo. El siguiente artículo pone de relieve cómo el Centro de Genómica Estructural Seattle de Enfermedades Infecciosas utiliza un enfoque multi-objetivo para la determinación genética de la estructura de la influenza A subunidad PB2.

Multi-objetivo enfoque de procesamiento paralelo para Gene a la estructura de determinación de la polimerasa subunidad PB2 Influenza

Fuente: Figueroa, D. M., et.al. Producción y visualización de esferoplastos y protoplastos bacterianos para caracterizar la localización de péptidos antimicrobianos. J. Vis. Exp. (2018)Este video demuestra la producción de esferoplastos de Escherichia coli inhibiendo primero la división celular para inducir la filamentación, seguida de la digestión enzimática de la pared celular. El proceso incluye la adición controlada de un agente quelante, DNasa y un estabilizador osmótico para garantizar la...

Preparación de esferoplastos de E. coli

Estudios biofísicos y bioquímicos de las interacciones entre los dominios de la proteína de membrana integrados se enfrentan a muchos desafíos técnicos, la primera de las cuales es la de conseguir material de estudio adecuado. En este artículo se describe un protocolo para producir y purificar estabilizadas por puentes disulfuro complejos de péptidos transmembrana que son adecuados para el análisis estructural por la solución de resonancia magnética nuclear (RMN) y otras aplicaciones analíticas.

La producción de disulfuro estabilizados complejos transmembrana de péptidos de Estudios Estructurales

β barril de 'jove_content', cumplen muchas funciones dentro de las membranas externas de las bacterias Gram-negativas, mitocondrias y cloroplastos. Aquí, esperamos aliviar un cuello de botella conocido en los estudios estructurales mediante la presentación de protocolos para la producción de OMP de β barril en cantidades suficientes para la determinación de la estructura mediante cristalografía de rayos X o espectroscopia de RMN.

A partir de construcciones de Cristales - Hacia la determinación de la estructura de la β-barril proteínas de membrana externas

Se presenta un protocolo optimizado para realizar una amplia caracterización bioquímica y estructural de una proteína de unión a sustrato de carbohidratos de Streptococcus pneumoniae .

Caracterización bioquímica y estructural de la SP0092 de proteína de unión a sustrato de transporte de hidratos de carbono

Aquí presentamos un protocolo para producir Gram-negativos Escherichia coli (e. coli) Esferoplastos y gram-positivas Bacillus megaterium (B. megaterium) protoplastos claramente visualizar y caracterizar rápidamente interacciones de péptido-bacterias. Esto proporciona un método sistemático para definir la localización de la membrana translocación de péptidos.

Producción y visualización de Esferoplastos bacterianos y protoplastos para caracterizar la localización de péptido antimicrobiano

Describimos los protocolos para la determinación de la estructura del dominio de unión IKK de NEMO por cristalografía de rayos X. Los métodos incluyen la expresión de proteínas, purificación y caracterización, así como estrategias para la optimización exitosa del cristal y la determinación de la estructura de la proteína en su forma no unida.

Producción, cristalización y determinación de la estructura del dominio vinculante iKK de NEMO

Este protocolo ha sido desarrollado para estudiar la transición dimer-dodecamer de TmPep1050, un M42 aminopeptidasa, a nivel estructural. Es una tubería sencilla que va desde la purificación de proteínas hasta el procesamiento de datos de rayos X. La cristalgénesis, la indexación de conjuntos de datos y el reemplazo molecular se han enfatizado a través de un caso de estudio, la variante TmPep1050H60A H307A.

Cristalografía de rayos X para estudiar la transición del estado oligomérico de la Thermotoga maritima M42 Aminopeptidasse TmPep1050

Se describe un versátil dispositivo microfluídico que permite la cristalización de una enzima utilizando el método de contradifusión, la introducción de un sustrato en los cristales por remojo y la determinación de la estructura 3D de la enzima: complejo de sustratos mediante un análisis en serie de cristales dentro del chip a temperatura ambiente.

Cristalización y determinación estructural de una enzima: complejo de sustratos por cristalografía serie en un chip microfluídico versátil

La determinación de la estructura de complejos macromoleculares utilizando crioEM se ha convertido en rutina para ciertas clases de proteínas y complejos. Aquí, se resume esta tubería (preparación de muestras, detección, adquisición y procesamiento de datos) y los lectores se dirigen hacia recursos y variables más detallados que pueden alterarse en el caso de especímenes más desafiantes.

Microscopía crioelectrónica de partícula única: de la muestra a la estructura

Aprende a producir cristales de alta calidad de PPEP-1 de C. difficile mediante microsiembra para análisis de difracción de rayos X. Este método mejora la cristalización de proteínas con cristales intercrecidos.

Producción, Cristalización y determinación de la estructura de

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