Producción, Cristalización y determinación de la estructura de C. difícil PPEP-1 a través de microsiembra y Zinc-SAD

Prolina-prolina endopeptidasa-1 (PPEP-1) es una metaloproteasa secretada y una prometedora diana farmacológica del patógeno humano Clostridium difficile. Aquí describimos todos los métodos necesarios para la producción y determinación de la estructura de esta proteína.

El objetivo general de este procedimiento es hacer crecer de manera eficiente cristales de calidad de difracción de red única de la proteína recombinante prolina prolina endopeptidasa-1, o rPPEP-1. Sin este método, rPPEP-1 produce instantáneamente cristales altamente interclorados que no son adecuados para el análisis de difracción de rayos X. La principal ventaja de esta técnica es que se puede producir un gran número de cristales bien ordenados y bien difractados para la determinación estructural de rPPEP-1 en un corto período de tiempo y con un aporte de material limitado.

Este procedimiento hace uso del método de la microciudad y se puede adaptar para cada condición de cristalización inicial exitosa de rPPEP-1, así como sus complejos de péptidos de sustrato. Este método se puede adaptar para producir cristales bien ordenados de prácticamente todas las proteínas que producen cristales intercrecidos. También se puede utilizar en experimentos de siembra cruzada, varianza de proteínas o en experimentos de cocristalización con moléculas pequeñas.

La demostración visual del manejo de los métodos de cristalización es crucial, ya que incluso pequeñas variaciones pueden tener un impacto significativo en la calidad de difracción de los cristales. Llevar a cabo ensayos de cristalización en el formato de gota sentada utilizando cribas estándar disponibles en el mercado y un robot de cristalización. Primero, concentre la proteína purificada a 12 miligramos por mililitro usando un dispositivo de ultrafiltración centrífuga en intervalos de cinco minutos a 4000 veces g y cuatro grados Celsius.

Mezcle la proteína después de cada intervalo para evitar la precipitación y el agravamiento. Determine la concentración de proteína a 280 nanómetros utilizando el coeficiente de extinción de 25,900 por centímetro molar. Después de equilibrar la proteína a 20 grados centígrados, elimine todas las partículas y el polvo mediante centrifugación durante 10 minutos a 16000 veces g y 20 grados centígrados.

Para realizar pantallas de cristal, utilice placas de cristalización precargadas selladas y almacenadas a cuatro grados centígrados. Al configurar las pruebas, trabaje con rapidez, ya que los pequeños volúmenes se secan rápidamente. Utilice también una cámara de humedad alrededor de la base del robot si es posible.

Después de equilibrar todas las placas de cristalización a 20 grados centígrados, configure la criba pipeteando el depósito de proteínas en los subpozos dos a cuatro. Utilice un volumen de gota de 300 nanolitros. Utilice proporciones de proteína a reservorio de 200:100 para el subpozo dos, 150:150 para el subpozo tres y 100:200 para el subpozo cuatro.

Selle inmediatamente la placa y colóquela en una cámara a 20 grados centígrados. Inspeccione las bandejas después de la configuración todos los días durante la primera semana y luego siga con una inspección semanal. Para una cocristalización de los complejos de péptido de sustrato rPPEP-1, mezcle rPPEP-1 a 24 miligramos por mililitro en una proporción de 1:1 con un exceso molar de siete veces de solución peptídica de polvo liofilizado solubilizado en solución salina tamponada tris.

Después de incubar durante 30 minutos a 20 grados centígrados, elimine todas las partículas y el polvo mediante centrifugación durante 10 minutos a 16000 veces g y 20 grados centígrados. Proceda con la cristalización utilizando el mismo procedimiento de microsiembra que para la proteína rPPEP-1 no unida. Después de dos días aparecieron cristales de rPPEP-1 altamente intercrecidos en una condición que contenía 2,4 molares de fosfato de amonio dibásico y 0,1 molares de trisapseal, pH 8,5.

Para optimizar la condición inicial, utilice un software para calcular los volúmenes y el esquema de pipeteo para obtener dos mililitros de cada condición que permite 10 pantallas de optimización. Las condiciones incluyen fosfato de amonio dibásico de 1,8 a 2,55 molar en pasos de 0,15 molar, así como trisapseal de 0,1 molar pH de 7,5 a 9,0 en pasos de 0,5 unidades de pH. Prepare una pantalla de cuadrícula que comprenda 24 condiciones a partir de soluciones madre.

Utilice el esquema de pipeteo para componer las condiciones individuales. Pipetee 200 microlitros de cada solución de pantalla de rejilla en los pocillos de una placa de 24 pocillos y equilibre la placa a 20 grados centígrados. Ajuste manual de la placa de cristalización.

Utilice un volumen de gota de tres microlitros y una proporción de proteína a reservorio de 2:1, 1,5:1:5 y 1:2. En este caso, utilice una pipeta de desplazamiento positivo para evitar la formación de burbujas de aire. Selle inmediatamente la placa.

Luego coloque el plato en una cámara a 20 grados centígrados. Después de uno a cuatro días, aparecen cristales altamente intercrecidos de rPPEP-1 en las cuatro condiciones que contienen 2,55 molares de fosfato de amonio dibásico y 0,1 molar trisapseal pH de 7,5 a 9,0, mientras que no se forman cristales en las 20 condiciones restantes. Realice el procedimiento de microsiembra para obtener cristales individuales de rPPEP-1 en estas condiciones.

Para preparar un stock de microsemillas, primero elija un solo cristal intercrecido de una de las condiciones exitosas. A continuación, transfiera 50 microlitros del licor madre respectivo a un tubo de 1,5 mililitros que contenga una pequeña cuenta de vidrio muy pulida y un microlitro del licor madre al portaobjetos de la tapa de vidrio. Con un lubricante de nailon montado, saque el cristal y transfiéralo a la gota en el portaobjetos de la cubierta de vidrio.

Luego, transfiera el líquido que contiene el cristal al tubo y al vórtice a alta velocidad durante 30 segundos, asegurándose de que la cuenta de vidrio esté girando. Realice una dilución de 1:1000 del caldo de semillas en un nuevo tubo de 1,5 mililitros que contenga la misma condición recién preparada y haga vórtice a fondo durante cinco segundos. A continuación, retire el sello de la placa que cubre las 20 condiciones con gotas transparentes.

Pipetear 0,5 microlitros del caldo de semillas en los pocillos. Selle la placa y colóquela en una cámara a 20 grados centígrados. Después de aplicar esta técnica de microsiembra, aparecen cristales individuales de alta calidad de difracción varias horas o varios días después de la configuración en diversas condiciones, que contienen fosfato de amonio de 1,8 a 2,4 molares y pH de tris de 0,1 molares de 7,5 a nueve.

Los cristales crecen hasta un tamaño de 100 a 200 micras en la dimensión más grande. Elija el tamaño óptimo de bucle de nailon para la longitud máxima de los cristales elegidos colocando el bucle en la cinta de sellado justo encima del cristal y enfocándolo hacia arriba y hacia abajo. El acceso más largo típico de los cristales de rPPEP-1 es de aproximadamente 100 a 200 micras.

Prepare también la criocondición adecuada. Llene las alcantarillas de espuma con nitrógeno líquido. A continuación, cargue la pinza del vial con un vial y enfríelo previamente en el desagüe de espuma de 800 mililitros lleno de nitrógeno líquido.

Coloque un soporte de criocano marcado con un identificador adecuado y una funda criogénica en el desagüe de espuma de dos litros lleno de nitrógeno líquido. A continuación, cargue la varilla magnética con el lazo de nailon montado del tamaño adecuado. A continuación, corte la cinta de sellado de la placa de cristalización con un bisturí afilado y retírela con pinzas.

Pipetee un microlitro de la criocondición en el portaobjetos de la cubierta. Es particularmente importante trabajar rápido en este paso, ya que el secado del cristal o el pequeño volumen de criosolución en el bucle podría provocar fluctuaciones en la calidad del cristal o incluso una pérdida completa de la difracción. Todos los pasos de manipulación de cristales deben realizarse bajo el microscopio estereoscópico.

Si el cristal se adhiere a la superficie de plástico, sepáralo del suelo deformando el plástico circundante con una aguja de acupuntura. Retira el cristal de la gota pescando con el lazo de nailon montado. Transfiera rápidamente el cristal a la gota de criocondición y deje que se equilibre durante un segundo.

A continuación, saca el cristal de la gota con el lazo de nailon montado lo más rápido posible. Congele inmediatamente el cristal recuperado en nitrógeno líquido. Cuando el nitrógeno líquido alrededor del asa montada deje de hervir, coloque el asa en el vial.

Coloque el vial en el soporte de criocano. Una vez que el soporte esté cargado con seis viales, coloque una funda criogénica alrededor del soporte. Guarde los cristales en un tanque lleno de nitrógeno líquido hasta su uso.

Para realizar la recopilación de datos, recupere con cuidado el cristal montado del criocano con una abrazadera y guárdelo en un desagüe de espuma para su transporte. Mueva el tope del haz y el detector a la posición de estacionamiento y suba la boquilla criogénica unos milímetros. Monte la base del cryocap en el cabezal del goniómetro sujetando la base con los dedos mientras se retira rápidamente el vial.

A continuación, vuelva a colocar la boquilla criogénica y el tope del haz en su lugar y centre el cristal. En todo momento, tenga cuidado de no tocar el tope del haz o el detector. Proceda a recopilar el conjunto de datos de 180 grados con un ángulo de oscilación de 0,1 grados, como se muestra aquí.

Aquí se muestran cristales de rPPEP-1 altamente intercultivados obtenidos a partir de la selección inicial utilizando pantallas de cristalización comerciales en citrato de sodio 1.4 tribásico dihidratado, 0.1 molar HEPES sodio, pH 7.5. Aquí se muestran cristales obtenidos del cribado inicial con tacsimato de 60% de volumen a volumen, pH 7,0, propano BIS-TRIS 0,1 molar, pH 7,0. También aparecieron cristales en fosfato de amonio 2,4 molar dibásico, tris 0,1 molar, pH 8,5.

Después de aplicar el procedimiento de optimización de la microsiembra, los cristales individuales estaban contenidos en varias condiciones, incluyendo fosfato de amonio dibásico 2,1 molar, tris 0,1 molar, pH 8 y fosfato de amonio dibásico 2,25 molar, tris molar 0,1, pH 8. Los cristales montados en bucles de nailon tienen un tamaño de 100 a 200 micras y parecen tener una sola red de inspección microscópica. El análisis de difracción de rayos X muestra que estos cristales exhiben una sola red y difractan los rayos X con una resolución casi atómica.

La resolución de la estructura cristalina del complejo peptídico de sustrato PPEP-1 recombinante proporciona información sobre el modo de unión al sustrato de PPEP-1. El péptido sustrato podría difundirse en el grupo de unión al sustrato de PPEP-1 en su confirmación abierta. Luego, a medida que se produce el cierre del bucle, el sustrato interactúa con PPEP-1 a través de enlaces de hidrógeno y la red única de cadena lateral alifático-aromático ubicada en el bucle S.

El sustrato se une en una conformación única de doble retorcimiento con torceduras en el enlace peptídico chisporroteante y el enlace peptídico primario P2 a P3 primo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo producir cristales de difracción de pozos de red individuales de PPEP-1 recombinante para estudios estructurales. Se pueden utilizar enfoques similares con otras proteínas, lo que produce cristales altamente intercrecidos y una temperatura de incubación y dilución de C-stock más variadas.

Debido a su versatilidad y facilidad de uso, esta sencilla técnica debe probarse en todo proceso de optimización de cristales.