Cristalización de las proteínas de membrana para la Determinación de la estructura con mesofases lipídico

Hola y bienvenidos al Grupo de Biología Estructural y Funcional de Membranas. Mi nombre es Martin Caffery. El enfoque de nuestra investigación es la membrana biológica, cuyo esquema se muestra en la primera diapositiva; la membrana que rodea la célula y los orgánulos subcelulares, cuando están presentes, es una estructura molecularmente delgada, con solo dos moléculas lipídicas de grosor y salpicada de proteínas.

Estamos interesados en la estructura y las funciones aplicadas tanto a lípidos como a proteínas. Sin embargo, para los fines de esta serie de JO, limitaré mi enfoque a las proteínas de membrana. Buscamos comprender cómo funcionan estas proteínas de membrana a nivel molecular por dos razones.

En primer lugar, existe la satisfacción intelectual de saber cómo funciona algo. En segundo lugar, al conocer su funcionamiento, al igual que con tu bicicleta o automóvil, existe la posibilidad de repararlo si presenta una falla. El diseño de fármacos es un resultado evidente de este tipo de trabajo.

El enfoque que utilizamos para comprender cómo funciona una proteína de membrana a nivel molecular consiste en determinar su estructura cristalográfica. Esto implica establecer la ubicación en el espacio tridimensional de todos los átomos, o al menos de todos los átomos distintos del hidrógeno que componen la proteína. El método que empleamos para este fin se denomina cristalografía de rayos X de macromoléculas, abreviado como MX.

Aquí observamos un ejemplo de una proteína de membrana cuya estructura se determinó mediante cristalografía de rayos X (MX), para lo cual se requiere un cristal de calidad fraccional de la proteína. Como puede imaginar, hay muchos pasos involucrados en la determinación estructural utilizando cristalografía macromolecular, como se ilustra aquí. Típicamente, estos incluyen identificar un blanco de proteína de membrana, y luego producirla, purificarla y cristalizarla.

Las mediciones de difracción se realizan sobre el cristal utilizando una fuente de rayos X casera o de sincrotrón. Los datos de difracción se procesan, obteniendo un mapa de densidad electrónica, el cual luego se ajusta con un modelo molecular. El modelo, una vez refinado, puede utilizarse para explorar el mecanismo de acción de la proteína y para el diseño de fármacos basado en la estructura.

El objetivo de este artículo de JOVE es mostrarle cómo producimos cristales de proteínas de membrana de fracción de alta calidad utilizando fases mesofásicas lipídicas mediante el denominado método en meso. Una revisión reciente del método y su alcance está disponible en la referencia uno. El protocolo paso a paso que seguiremos aquí se describe en referencia a un diagrama de flujo que resume los pasos involucrados y el tiempo necesario para establecer un ensayo de cristalización de proteínas de membrana en meso, el cual se muestra aquí.

Este video abarca los pasos delimitados por líneas rojas discontinuas. Aquí se muestran los materiales necesarios para realizar la cristalización en mesofase en modo manual. Incluyen una solución concentrada del lípido de la proteína de membrana purificada para crear el mesofase huésped, generalmente monooleína, para hacer más evidente el lípido.

En este video, se han utilizado soluciones de colorante rojo como precipitante, dispositivos de tubo para agua purificada, puntas desechables y una variedad de jeringas gastight de Hamilton, algunas con agujas desmontables, un acoplador de pequeño diámetro empleado para mezclar la solución proteica con el lípido y producir la mezcla. Un dispensador repetidor de Hamilton, portaobjetos y cubreobjetos de vidrio para microscopio. Idealmente, cinta espaciadora perforada de doble cara silanizada para la creación de pocillos, pinzas, hielo picado, tejuelos, una calculadora y, lo más importante de todo, su cuaderno de laboratorio.

El siguiente procedimiento se utiliza para preparar una placa de cristalización de doble cubreobjetos. Para la carga, coloque un portaobjetos silanizado sobre la bancada. Retire la cubierta de papel protectora de una superficie de una tira de cinta espaciadora adhesiva doble con perforaciones.

Coloque la cinta con el lado adhesivo hacia abajo en contacto con la superficie del portaobjetos bajo presión. Selle la cinta al portaobjetos. Utilizando una rodillo o un rodillo de aluminio, se puede colocar una lámina de aluminio entre la cinta y el rodillo para proteger la base de los pocillos.

Retire la segunda cubierta de papel de la cinta para exponer su superficie adhesiva superior. Este procedimiento genera una placa de vidrio lista para la carga y el posterior sellado, que debe realizarse tan pronto como se complete la carga. Coloque cubreobjetos individualmente silanizados en proximidad cercana a la placa para un sellado rápido y eficiente de los pocillos.

Coloque el lípido en un bloque controlado por temperatura a 45 grados Celsius durante tres minutos para fundirlo. Tenga en cuenta que el lípido utilizado generalmente es mono land. En este video, al lípido se le ha añadido un colorante rojo para mejorar su visibilidad mientras se derrite.

Prepare dos jeringas herméticas de gas Hamilton de 100 microlitros para su uso en el paso de mezcla de lípidos y proteínas; retire el aceite de la lana de teflón de la jeringa que contendrá la solución de proteína. Coloque la jeringa que contendrá el lípido junto a ella. En este caso, se deja el fal en su lugar.

Coloque el acoplador de orificio estrecho entre las dos jeringas y luego conecte el acoplador al dedo de la jeringa de lípidos. Ajuste firmemente el acoplador a la jeringa, pero no apriete en exceso. Retire el émbolo del cilindro de la jeringa de lípidos.

Asegúrese de que el lípido esté fundido. Ajuste la pipeta a 30 microlitros y aspire lentamente 30 microlitros de la tapa de lípido fundido. El vial de lípido.

El lípido debe almacenarse bajo nitrógeno o argón a menos 80 grados Celsius. Introduzca lentamente la mayor cantidad posible del lípido fundido en el extremo abierto de la jeringa, teniendo cuidado de no introducir burbujas de aire.

Coloque el émbolo dentro del cilindro en contacto con el leopardo fundido y avance lentamente el émbolo hacia arriba por el cilindro manteniendo la jeringa en posición vertical. Como se muestra, la burbuja de aire atrapada accidentalmente sube durante el proceso y se libera. Ahora tenemos un tapón de lípido fundido en el cilindro cuyo volumen debe determinar con precisión.

Esto puede hacerse leyendo las marcas en el cilindro de la jeringa. En este caso, el volumen es de 23 microlitros, que se registra en el cuaderno de laboratorio. Deslice la pieza de piel sobre la aguja que sobresale del acoplador.

Utilice el émbolo para forzar el lípido fundido hacia arriba por el cilindro y luego lentamente y suavemente dentro de la aguja situada en el centro del acoplador. Si la aguja se llena ligeramente en exceso, se observará que el lípido sobresale por su extremo abierto. Al retroceder ligeramente el émbolo, el exceso de lípido puede retirarse hacia el interior del acoplador hasta que quede justo al nivel del extremo de la aguja del acoplador.

En este caso, la unidad acopladora de jeringa está completamente cargada y lista para combinarse con la jeringa de proteína. La solución debe centrifugarse a 14,000 G durante 10 min, de cinco a 10 minutos a cuatro grados Celsius para eliminar agregados grandes. Antes de preparar los ensayos de cristalización, retire la solución de proteína del recipiente con hielo y equilíbrela a temperatura ambiente.

Calcule el volumen de la solución de proteína a utilizar para formar la fase cúbica a hidratación completa o cercana a la completa para olean a 20 grados Celsius. La hidratación completa con agua ocurre a aproximadamente el 40 % en peso de agua, según se muestra en el diagrama de fases. Recuerde que hemos cargado la jeringa de lípido con 23 de mono a una densidad de 0,94 miligramos por microlitro.

Esto corresponde a 21,6 miligramos de lípido; por lo tanto, se necesitan 21,6 veces cuatro dividido entre seis, es decir, 14,4 miligramos o 14,4 microlitros de solución de proteína. Con una jeringa Hamilton de 25 o 50 microlitros, aspire el volumen requerido de solución de proteína y transfiera la solución a la punta de teflón del émbolo en el cilindro de la solución de proteína. Tenga cuidado para evitar burbujas de aire, retire cuidadosamente la aguja y mida el volumen de la solución de proteína en la jeringa. Este debe coincidir con el valor obtenido en el paso anterior.

Como preparación para combinar con la jeringa cargada de lípidos, desplace cuidadosamente la solución proteica por el interior del cuerpo de la jeringa hasta que quede alineada exactamente con su extremo abierto. Esto puede observarse mirando desde el extremo superior a través del final del cuerpo de la jeringa.

La solución de proteína lipina, las jeringas cargadas ya están listas para ser combinadas en preparación para Mex. Para hacer esto, enrosque la jeringa de proteína en el extremo abierto del acoplador unido a la jeringa de lípidos. Después de combinar las dos jeringas mediante el acoplador, debe existir un volumen continuo de líquido que vaya desde el lípido en una jeringa, a través del acoplador, hasta la solución de proteína en la otra jeringa.

Como preparación para la mezcla, se sostiene la unidad ensamblada con una jeringa en la mano derecha y la otra en la izquierda. Se aplica un par de torsión a ambos cilindros a través del acoplador, utilizando los dedos y el pulgar de ambas manos para asegurar que el sello contra los surcos del acoplador permanezca intacto al apretar. El dispositivo mezclador ensamblado en esta etapa dañará el ALS y provocará fugas; asimismo, un apriete insuficiente también causará fugas.

Es cuestión de experiencia con los inevitables intentos, errores y ocasionales pérdidas de muestra. Por lo tanto, vale la pena practicar con lípidos y agua o solución tampón para familiarizarse con el sistema antes de comenzar a usar soluciones valiosas de proteína para realizar la mezcla. Empuje el émbolo hacia adelante en el lado de la proteína de la unidad de mezclado hasta su límite con el pulgar o el dedo índice, haciendo que la solución de proteína salga de la jeringa de proteína a través del acoplador y entre en la jeringa de lípidos. Si la unidad ha sido sellada eficazmente, esta acción provocará un movimiento igual y opuesto del émbolo en el lado de los lípidos.

El émbolo del lado de los lípidos se utiliza ahora para impulsar el contenido de la jeringa de lípidos nuevamente a través del enfriador y hacia la jeringa de proteínas. Este proceso se repite muchas veces. En ocasiones, se requieren cien pasadas o más para producir una fase mixta homogénea.

Al comienzo de la mezcla, el movimiento del material de un lado a otro a través del acoplador puede ser irregular y, en ocasiones, se necesita una fuerza adicional para lograr la mezcla. Esto es esperable. La mezcla inicial suele ir acompañada por el desarrollo de una turbidez no uniforme en la muestra, lo cual también es esperado.

A medida que avanza la homogeneización, la textura, tal como se percibe por la fuerza necesaria para mover los émbolos hacia adelante y hacia atrás, se vuelve más uniforme y característica de la fase cúbica viscosa, al igual que la apariencia visual de la fase cúbica emergente. Si las condiciones son adecuadas y se forma la fase cúbica, la dispersión debería aparecer ópticamente transparente en el cuerpo de la jeringa.

Por lo tanto, las marcas en el cilindro de la jeringa deben ser claramente legibles a través de la fase meso en el cilindro. En el caso de proteínas coloreadas, la fase meso tendrá el color de la proteína, pero será ópticamente transparente. Un enfriamiento muy leve de la muestra durante la mezcla, colocando el mezclador de jeringas durante un breve tiempo en hielo, puede acelerar la homogeneización y la obtención de transparencia.

Sin embargo, es importante no sobrecargar la muestra; se debe tener cuidado para evitar una mezcla extremadamente vigorosa, ya que esto puede provocar un aumento de la temperatura de la muestra debido al calentamiento por fricción. En este punto, se ha formado la fase cúbica de misa y la proteína se ha reconstituido en la bicapa lipídica. La fase de misa ya está lista para ser dispensada en los pocillos individuales de las placas de cristalización.

Primero, sin embargo, la fase meso debe transferirse a una jeringa Hamilton de 10 microlitros montada en un dispensador repetitivo. Comience este proceso acoplando la jeringa al dispensador delgado. Cargue la jeringa con el meso cúbico.

Retire la aguja y el émbolo de la jeringa. Deje el cono de teflón en su lugar. Retire la tuerca de sujeción del dispensador con la ayuda de una moneda pequeña.

Con el brazo de trinquete completamente retirado, inserte la jeringa sin su émbolo ni aguja a través del anillo de sujeción del dispensador. Reemplace la junta de retención con el lado del nudo orientado hacia la jeringa y atorníllela firmemente en el extremo abierto de la jeringa.

Se debe tener cuidado para asegurar que la jeringa esté correctamente centrada en el anillo de sujeción y que el cuerpo esté alineado paralelamente al brazo del trinquete. Ambos aspectos pueden evaluarse mediante I. Estos dos requisitos son importantes porque si el émbolo no se desliza libremente, se acumulará presión en la jeringa de origen durante la carga y podría producirse una fuga. Pase el émbolo a través del anillo de sujeción con la tuerca de sujeción, desenroscada unas vueltas, y guíe el émbolo hacia el extremo abierto de la jeringa.

Pulse completamente el brazo del trinquete para mover el émbolo dentro del cilindro y verifique que se desplace libremente a través del cilindro. Si el tornillo y la barra guía se aflojaron, apriételos nuevamente y vuelva a verificar que el émbolo se mueva libremente. La jeringa de dispensación ya está lista para ser cargada.

Mueva el émbolo en un lado de la unidad de mezclado ensamblada hasta la marca de graduación de cero microlitros. Para transferir la fase meso a la otra jeringa y al acoplador. Desconecte la jeringa vacía con su UL en su lugar de la unidad de mezclado y conecte inmediatamente la jeringa cargada con el acoplador al extremo roscado de la jeringa dispensadora de 10 microlitros.

El grado de ajuste con el que se realiza el acoplamiento es fundamental. Como ya se mencionó, cargue la jeringa de dispensación presionando el émbolo de la jeringa de 100 microlitros para que la fase mesomorfa pase a través del acoplador. Si el acoplamiento es hermético y el émbolo de la jeringa de dispensación se mueve libremente, entonces el émbolo debería comenzar a desplazarse en la misma dirección del émbolo de carga mientras la jeringa de dispensación se llena.

Desconecte la jeringa de carga con el acoplador unido de la jeringa de dispensación. Fije una aguja corta de punta plana a la terminación de acero de la jeringa de dispensación y apriétela cuidadosamente en su lugar. Sujete el émbolo al brazo del trinquete apretando el nudo en el anillo de sujeción.

Debe tenerse cuidado de no apretar demasiado el nudo, ya que esto podría rayar y deformar el émbolo, dejándolo inservible. Es importante que el rango de movimiento proporcionado al brazo del trinquete en condiciones de sujeción esté limitado a no más de una pulgada.

Como se muestra más allá de esto, el émbolo tenderá a pandearse y la administración puede fallar. Presione varias veces el tambor de trinquete para avanzar el émbolo dentro del cilindro, llenando así el volumen muerto de la aguja y cargando esta última. Este paso debe repetirse hasta 10 veces hasta que emerja una cadena continua de la fase mesa desde la punta de la aguja.

La aguja ya está lista para usar en el montaje de los ensayos de cristalización, los cuales deben comenzar inmediatamente. No es recomendable conservar la fase cúbica cargada con proteína durante mucho tiempo antes de iniciar los ensayos de cristalización. Dado que algunas proteínas son inestables en la fase cúbica sin precipitante añadido, coloque una placa de cristalización de múltiples pocillos y una cubreobjetos sobre una superficie elevada unos centímetros por encima del banco para facilitar la carga.

Se logra un contraste óptimo y una visibilidad mejorada cuando la superficie es ligeramente oscura. Homogenice las soluciones de precipitante y destape los viales. Ajuste la pipeta dispensadora de precipitante a un microlitro con la jeringa dispensadora sostenida verticalmente en una mano; use la otra mano para colocar la punta de la aguja en el centro y directamente encima de la base del pocillo.

Número uno. Presione el botón del dispensador repetitivo para expulsar un bolo de mease sobre la superficie de vidrio. El volumen del bolo es de 200 nanolitros.

Cuando se utiliza el dispensador estándar repetitivo con una jeringa de 10 microlitros, la punta de la aguja no debe estar a más de unos cientos de micrómetros por encima de la base del pocillo. Para garantizar una entrega adecuada, se logra fácilmente una entrega reproducible. Solo se requiere un poco de práctica. Después de cargar los cuatro pocillos adyacentes con el bolo de mease, coloque un microlitro de solución precipitante encima de cada bolo de mease.

Utilizando dos microlitros por pozo y puntas desechables estándar lo más rápidamente posible, coloque una cubreobjetos directamente sobre los pozos llenos para cubrirlos de manera uniforme y lograr un sello hermético al agua. Use una espátula para aplicar presión sobre la cubreobjetos en el punto donde hace contacto con la superficie adhesiva expuesta de la cinta espaciadora. El proceso de dispensación del agente de cristalización y del precipitante puede repetirse hasta que todos los pozos de la placa estén cargados y sellados.

La placa ya está lista para su inspección y para la incubación. Etiquete la placa claramente con fines de seguimiento. Las proteínas sensibles a la luz suelen manejarse envolviendo las placas en papel de aluminio antes de colocarlas en la cámara de incubación.

Estos pueden retirarse y examinarse bajo el microscopio con luz tenue o adecuadamente coloreada. Coloque las placas en una cámara con control de temperatura, generalmente a unos 20 grados Celsius, de forma periódica. Inspeccione las paredes en busca de crecimiento cristalino utilizando un microscopio de luz polarizada con un aumento de 10 o 20 veces.

Objetivo, el cronograma utilizado en el laboratorio del autor es el siguiente: días 0, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 21 y 30 posteriores al establecimiento. Inspeccione cuidadosamente el bolo de heces. Ajuste la profundidad de enfoque dentro de la muestra de 140 micrones de grosor.

El examen debe realizarse tanto con luz normal como entre polarizadores cruzados: los cristales incoloros de proteínas de membrana que crecen en la fase cúbica se ven así cuando se observan con luz normal. Los cristales incoloros de proteínas de membrana que crecen en mesofase y se observan con luz polarizada se ven así o así; las proteínas de membrana naturalmente coloreadas que crecen en mesofase y se observan con luz normal se ven así o así.

Los siguientes pasos en el proceso general de determinación estructural consisten en cosechar y enfriar criogénicamente los cristales, y en registrar y procesar la difracción de rayos X proveniente de ellos. Estos temas se tratan en artículos separados de JoVE en esta serie.