Cristalización de las proteínas de membrana para la Determinación de la estructura con mesofases lipídico

Hola y bienvenidos al Grupo de Biología Estructural y Funcional de Membranas. Mi nombre es Martin Caffery. El enfoque de nuestra investigación es la membrana biológica, cuyo esquema se muestra en la primera diapositiva, la membrana que rodea la célula y los orgánulos subcelulares cuando está presente es una estructura molecularmente delgada, de solo dos moléculas lipídicas atravesadas y tachonadas de proteínas.

Nos interesa la estructura y las funciones aplicadas tanto a los lípidos como a las proteínas. Sin embargo, para los propósitos de esta serie JO, limitaré mi enfoque a las proteínas de membrana. Buscamos entender cómo funcionan estas proteínas de membrana a nivel molecular por dos razones.

En primer lugar, está la satisfacción intelectual de saber cómo funciona algo. En segundo lugar, al saber cómo funciona, al igual que su bicicleta o automóvil, existe la posibilidad de arreglarlo si funciona mal. El diseño de fármacos es un resultado obvio de este tipo de trabajo.

El enfoque que adoptamos para averiguar cómo funciona una proteína de membrana a nivel molecular es determinar su estructura cristalográfica. Esto implica establecer la ubicación en el espacio tridimensional de todos los átomos, o al menos de todos los átomos que no son de hidrógeno que componen la proteína. El método que utilizamos para este propósito se llama cristalografía de rayos X macromoleculares MX para abreviar.

Aquí vemos un ejemplo de una proteína de membrana cuya estructura se determinó usando MX a una fracción de cristal de calidad de la proteína que se requiere para hacer mx. Como se puede imaginar, hay muchos pasos involucrados en la determinación estructurada utilizando cristalografía macromolecular como se ilustra. Aquí. Por lo general, estos incluyen la identificación de un objetivo de proteína de membrana y luego producirlo, purificarlo y cristalizarlo.

Las mediciones de difracción se realizan en el cristal utilizando una fuente de rayos X doméstica o de sincrotrón. Los datos de difracción se procesan, produciendo un mapa de densidad de electrones, que luego se ajusta con un modelo molecular. El modelo, una vez refinado, puede utilizarse para explorar el mecanismo de acción de la proteína y para el diseño de fármacos basados en la estructura.

El objetivo de este artículo es mostrarte cómo producimos una fracción de cristales de calidad de proteínas de membrana utilizando fases meso lipídicas mediante el llamado método in meso. Una revisión reciente del método y su alcance está disponible en la referencia uno. El protocolo paso a paso que seguiremos aquí se describe en referencia a un diagrama de flujo que resume los pasos involucrados y el tiempo requerido para configurar un ensayo final de cristalización de proteínas de membrana mesométrica.

Este video cubre los escalones encerrados por líneas rojas discontinuas. Aquí se muestran los elementos que deberá hacer en la cristalización meso en el modo manual. Incluyen una solución concentrada de lípido de proteína de membrana purificada para crear la masa huésped, generalmente mono ola para hacer que el lípido sea más obvio.

En este video, se ha dopado con soluciones precipitantes de tinte rojo, dispositivos de acariciar tuberías de agua purificada y puntas desechables y una variedad de jeringas Hamilton muy ajustadas, algunas con agujas extraíbles, un acoplador de diámetro estrecho utilizado para mezclar la solución de proteína con el lípido para producir la mosca. Un dispensador de repetición de portaobjetos y cubreobjetos de microscopio de vidrio de Hamilton. Cinta espaciadora de doble palo perforada idealmente aislada para pinzas de creación de pozos, pañuelos de hielo astillados, una calculadora y, lo más importante de todo, su cuaderno de laboratorio.

El siguiente procedimiento se utiliza para preparar una placa de cristalización en sándwich de vidrio. Para la carga, coloque un portaobjetos de microscopio en silos sobre el banco. Retire la cubierta protectora de papel de una superficie de una tira de cinta espaciadora perforada de doble adherencia.

Coloque la cinta con el lado adhesivo hacia abajo en contacto con la superficie de la presión de la corredera. Sella la cinta a la corredera. Con un brayer o rodillo, se puede colocar papel de aluminio entre la cinta y el rodillo para proteger la base de los pocillos.

Retire la segunda cubierta de papel de la cinta para exponer su superficie superior pegajosa. Este procedimiento genera una placa de vidrio que está lista para la carga y el posterior techo tan pronto como se completa la carga. Deslizamientos de cubierta individuales en silos muy cerca de la placa para un techo rápido y eficiente de los pozos.

Coloque el lípido en un bloque de temperatura controlada a 45 grados centígrados durante tres minutos para fundirlo. Hay que tener en cuenta que el lípido utilizado suele ser monotierra. En este video, al lípido se le agrega un tinte rojo para mayor visibilidad mientras el lípido se derrite.

Prepare dos jeringas Hamilton herméticas a la gasolina de 100 microlitros para usar En el paso de mezcla de proteínas lipídicas, retire el aceite de piel de teflón de la jeringa que contendrá la solución de proteína. Coloque la jeringa que sostendrá el lípido junto a él. En este caso, el fal se deja en su lugar.

Coloque el acoplador de diámetro estrecho entre las dos jeringas y luego conecte el acoplador al dedo de la jeringa lipídica. Apriete el acoplador a la jeringa, pero no lo apriete demasiado. Retire el émbolo del cilindro de la jeringa lipídica.

Asegúrate de que el lípido esté fundido. Ajuste la pipeta a 30 microlitros y absorba lentamente 30 microlitros de tapón lipídico fundido. El vial de lípidos.

El lípido debe almacenarse bajo nitrógeno o argón a menos 80 grados centígrados. Administre lentamente la mayor cantidad posible de lípidos fundidos en el extremo abierto de la jeringa. Teniendo cuidado de no introducir espacios de aire.

Coloque el émbolo en el barril en contacto con el leopardo fundido y avance lentamente el émbolo por el barril con la jeringa sostenida verticalmente. Como se muestra, la burbuja de aire atrapada se eleva inadvertidamente en el proceso y se libera. Ahora tenemos un tapón de lípidos fundidos en el barril cuyo volumen debe determinar con precisión.

Esto se puede hacer leyendo las marcas en el cilindro de la jeringa. En este caso, el volumen es de 23 microlitros, que se registra en el cuaderno del laboratorio. Deslice el pelaje sobre la aguja que se extiende desde el acoplador.

Utilice el émbolo para forzar el lípido fundido por el barril y lentamente y suavemente en la aguja en el núcleo del acoplador. Si la aguja está ligeramente sobrellenada, se verá que el lípido late en su extremo abierto. Al retroceder ligeramente el émbolo, el exceso de lípidos se puede retirar al acoplador hasta que quede justo al ras con la punta de la aguja del acoplador.

En este caso, la unidad de acoplamiento de la jeringa está completamente cargada y lista para combinarse con la jeringa de proteínas. La solución debe centrifugarse a 14.000 g durante 10 minutos, de cinco a 10 minutos a cuatro grados centígrados para eliminar los agregados grandes. Antes de establecer las pruebas de cristalización, tome la solución de proteína de la cubitera y equilibre a temperatura ambiente.

Calcule el volumen de proteína, por lo que la solución a utilizar para formar la fase cúbica en o cerca de la hidratación completa para el olean a 20 grados centígrados. La hidratación completa con agua se produce a cerca del 40% en peso de agua como en el diagrama de fases. Recordemos que hemos cargado la jeringa lipídica con 23 de mono a una densidad de 0,94 miligramos por microlitro.

Esto corresponde a 21,6 miligramos de lípido, por lo tanto, 21,6 veces cuatro dividido por seis o 14,4 miligramos o 14,4 microlitros de solución de proteína con una jeringa Hamilton de 25 o 50 microlitros toma el volumen requerido de solución de proteína, transfiere la solución a la punta de teflón del émbolo en el barril de la solución de proteína. Teniendo cuidado de evitar burbujas de aire, retire con cuidado la aguja y mida el volumen de la solución de proteínas en la jeringa. Debe coincidir con el valor entregado en el paso anterior.

En preparación para la combinación con la jeringa cargada de lípidos. Con cuidado, empuje la solución de proteína por el barril para que termine al ras con su extremo abierto. Esto se puede observar mirando hacia abajo a través del extremo de terminación del cañón.

La solución de proteína de lipina, las jeringas cargadas ahora están listas para combinarse en preparación para que Mex haga esto, atornille la jeringa de proteína en el extremo abierto del acoplador conectado a la jeringa de lípidos. Habiendo combinado dos jeringas a través del acoplador. Debe existir un volumen continuo de líquido desde el lípido en una jeringa a través del acoplador hasta la solución de proteínas en la otra jeringa.

En preparación para la mezcla, la unidad ensamblada se sostiene en una con una jeringa en la mano derecha y la otra en la izquierda. El par se aplica a ambos barriles a través del acoplador, utilizando los dedos y el pulgar de ambas manos para garantizar que el sello contra los surcos en el acoplador permanezca intacto durante el apriete. El dispositivo de mezcla ensamblado en esta etapa dañará el ALS y causará fugas al apretarse también provocará fugas.

Es una cuestión de experiencia con el inevitable ensayo y error y la pérdida ocasional de la muestra. Por lo tanto, vale la pena practicar con lípidos y agua o solución tampón para tener una idea del sistema antes de lanzarse a usar una solución de proteínas valiosa para afectar la mezcla, avance el émbolo en el lado de la proteína de la unidad de mezcla ensamblada hasta su límite con el pulgar o el dedo índice impulsando la solución de proteína fuera de la jeringa de proteínas a través del acoplador y dentro de la jeringa de lípidos. Si la unidad se ha sellado de manera efectiva, esta acción provocará un movimiento igual y opuesto del émbolo en el lado lipídico.

El émbolo en el lado lipídico ahora se usa para conducir el contenido de la jeringa lipídica a través del coler y hacia la jeringa de proteínas. Este proceso se repite muchas veces. Ocasionalmente se requieren cien pasajes o más para producir una fase de misa homogénea.

Al comienzo de la mezcla, el movimiento del material hacia adelante y hacia atrás a través del acoplador puede ser desigual y, a veces, se necesita fuerza adicional para efectuar la mezcla. Esto es de esperarse. La mezcla inicial suele ir acompañada del desarrollo de una turbidez no uniforme en la muestra y, de nuevo, es de esperar.

A medida que avanza la homogeneización. La textura, percibida por la fuerza necesaria para mover los émbolos hacia adelante y hacia atrás, se vuelve más uniforme y característica de la fase cúbica viscosa, al igual que la apariencia visual de la fase cúbica emergente. Si las condiciones son apropiadas y se forma la fase cúbica, la dispersión debe aparecer ópticamente transparente en el cilindro de la jeringa.

Por lo tanto, las marcas en el cilindro de la jeringa deben ser claramente legibles a través de la fase meso en el cilindro. En el caso de las proteínas coloreadas, la fase meso tendrá el color de la proteína, pero será ópticamente transparente. Un enfriamiento muy ligero de la muestra durante la mezcla colocando el mezclador de jeringas durante un corto período de tiempo sobre hielo puede acelerar la homogeneización y el logro de la transparencia.

Sin embargo, es importante no sobrecocer la muestra, se debe tener cuidado para evitar una mezcla extremadamente vigorosa, ya que esto puede hacer que la temperatura de la muestra aumente debido al calentamiento por fricción. En esta coyuntura, se ha formado la fase mía cúbica y la proteína se reconstituye en la hoja lipídica. La fase misa ya está lista para su dispensación en pocillos individuales de las placas de cristalización.

Primero, sin embargo, la fase meso debe transferirse a una jeringa Hamilton de 10 microlitros montada en un dispensador de repetición. Comience este proceso acoplando la jeringa al dispensador delgado. Cargue la jeringa con la arcilla cúbica.

Retire la aguja y el émbolo de la jeringa. Deja el fal de teflón en su lugar. Retire la tuerca de retención del dispensador con la ayuda de una moneda pequeña.

Con el brazo de trinquete completamente retirado. Inserte la jeringa sin el émbolo y la aguja a través del anillo de sujeción del dispensador. Vuelva a colocar el lado de la junta del nudo de retención que mira hacia la jeringa y atorníllelo firmemente en el extremo abierto de la jeringa.

Se debe tener cuidado de asegurarse de que la jeringa esté correctamente centrada en el anillo de sujeción y que el cilindro esté alineado paralelo al brazo del trinquete. Estos dos requisitos son importantes porque si el émbolo no funciona libremente y a través de la presión se acumulará en la jeringa fuente durante la carga y pueden producirse fugas. Pase el émbolo a través del anillo de agarre con la tuerca de agarre, desenrosque unas vueltas y guíe el émbolo hacia el extremo abierto de la jeringa.

Presione el brazo de trinquete a fondo, mueva el émbolo dentro del cañón y verifique que se desplace libremente y a través del cañón. Si el tornillo y la barra guía se aflojaron, vuelva a apretarla y vuelva a verificar que el émbolo se mueva libremente. La jeringa dispensadora ya está lista para cargar.

Mueva el émbolo de un lado de la unidad de mezcla ensamblada hasta la marca de graduación de cero microlitros. Para transferir la fase meso a la otra jeringa y al acoplador. Desconecte la jeringa vacía con su UL en su lugar de la unidad de mezcla e inmediatamente conecte la jeringa cargada con el acoplador conectado a la terminación roscada de la jeringa dispensadora de 10 microlitros.

El grado de estanqueidad con el que se realiza el acoplamiento es crítico. Como ya se ha señalado, cargue la jeringa dispensadora presionando el émbolo de la jeringa de 100 microlitros para que la fase meso se transfiera a través del acoplador. Si el acoplamiento es apretado y el émbolo de la jeringa dispensadora funciona libremente, entonces el émbolo debe comenzar a moverse en la dirección del movimiento del émbolo de carga a medida que la jeringa dispensadora se llena.

Desconecte la jeringa de carga con el acoplador conectado a la jeringa dispensadora. Asegure una aguja corta y plana a la terminación de acero de la jeringa dispensadora y apriétela cuidadosamente en su lugar. Sujete el émbolo al brazo del trinquete apretando el nudo en el anillo de agarre.

Se debe tener cuidado de no apretar demasiado el nudo. Ya que esto puede rayar y deformar el émbolo dejándolo inutilizable. Es importante que el rango de recorrido proporcionado al brazo de trinquete en la condición de sujeción se limite a no más de una pulgada.

Como se muestra más allá de esto, el émbolo tendrá tendencia a doblarse y la entrega puede fallar. L presione el tambor de trinquete varias veces para hacer avanzar el émbolo en el barril, llenando así el volumen vacío de la aguja y cargando la aguja. Este paso debe repetirse hasta 10 veces hasta que una cadena continua de la fase de mesa emerja de la punta de la aguja.

La aguja ya está lista para su uso en la creación de ensayos de cristalización, que deberían comenzar de inmediato. No es aconsejable mantener la fase cúbica cargada de proteínas durante demasiado tiempo antes de establecer los ensayos de cristalización. Como algunas proteínas son inestables en la fase cúbica sin precipitante agregado, coloque una placa de cristalización de pocillos múltiples y cubra el cubreobjetos sobre una superficie, elevada unas pulgadas por encima del banco para facilitar la carga.

El contraste óptimo y la visibilidad mejorada se logran cuando la superficie está ligeramente oscura. Homogeneizar las soluciones precipitantes y destapar los viales. Ajuste el propo dispensador de precipitante a un microlitro con la jeringa dispensadora sostenida verticalmente en una mano, use la mano libre para colocar la punta de la aguja en el centro y directamente encima de la base del pozo.

Número uno. Presione el botón en la pluma del dispensador repetidor para expulsar un bolo de micea sobre la superficie del vidrio. El volumen del bolo es de 200 nanolitros.

Cuando se utiliza el dispensador de repetición estándar con una jeringa de 10 microlitros, la punta de la aguja no debe estar más de unos pocos cientos de micrómetros por encima de la base del pocillo. Para garantizar una entrega adecuada, se logra fácilmente una entrega reproducible. Solo se necesita un poco de práctica. Después de que los cuatro pozos adyacentes estén cargados con mica, coloque un microlitro de solución precipitante encima de cada bolo de micasa.

Usando dos microlitros por patente y puntas desechables estándar lo más rápido posible, coloque un cubreobjetos directamente sobre los pocillos llenos para cubrirlos uniformemente y lograr un sello hermético. Use una espátula para aplicar presión al cubreobjetos donde hace contacto con la superficie pegajosa expuesta de la cinta espaciadora. El proceso de dispensación de mica y precipitante se puede repetir hasta que todos los pocillos de la placa estén cargados y sellados.

La placa ya está lista para la inspección y la incubación. Etiquete la placa claramente para fines de seguimiento. Las proteínas sensibles a la luz generalmente se manejan envolviendo las placas en papel de aluminio antes de colocarlas en la cámara de incubación.

Estos pueden ser removidos y examinados bajo el microscopio con luz tenue o de color apropiado. Coloque las placas en una cámara con temperatura controlada, generalmente a 20 grados centígrados o algo así, en un horario regular. Inspeccione las paredes en busca de crecimiento de cristales utilizando un microscopio de luz polarizada con un metido de 10 o 20 pliegues.

Objetivo, el horario utilizado en el laboratorio del autor es el siguiente, día 0 1 2 3 5 7 14 21 30 post establecido. Inspeccione cuidadosamente el bolo de mease. Ajuste de la profundidad de enfoque dentro de la muestra de 140 micras de grosor.

El examen debe realizarse tanto con luz normal como entre polarizadores cruzados, cristales de proteínas de membrana incoloros que crecen en la fase cúbica cuando se ven con luz normal. Se ve así. Los cristales de proteínas de membrana incoloros que crecen en meso cuando se ven con luz polarizada se ven así o esto, las proteínas de membrana de color natural que crecen en meso cuando se ven con luz normal se ven así o esto.

Los siguientes pasos en el proceso general de determinación estructurada son recolectar y enfriar los cristales, y registrar y procesar la difracción de rayos X de ellos. Estos temas se tratan en artículos separados de JoVE en esta serie.