A partir de construcciones de Cristales - Hacia la determinación de la estructura de la β-barril proteínas de membrana externas

El objetivo general de este método es obtener cantidades en miligramos de proteínas de barril beta de membrana externa que cristalicen y difracten. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del plegamiento y transporte de proteínas de membrana, como la forma en que las proteínas de barril beta se insertan en las membranas celulares. La principal ventaja de esta técnica es que es robusta para las proteínas de barril beta.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades, porque la selección de detergentes para la purificación, cristalización y desnaturalización es un desafío. Jeremy Guerin, un posdoctorado del laboratorio de Susan Buchanan, demostrará el procedimiento, además de mí mismo y colegas en el laboratorio. Comience este procedimiento con la construcción de un vector de expresión T7 que contenga el gen del codón optimizado para la proteína de membrana externa objetivo, o gen OMP, para expresión in vivo en la membrana según se describe en el protocolo escrito.

Transforme el constructo en una cepa bacteriana de expresión para su expresión pipeteando un microlitro de plásmido en 50 microlitros de células competentes químicamente BL21(DE3), y mezcle suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Incube en hielo durante 30 minutos. Tras la incubación, aplique un pulso de calor a 42 grados Celsius durante 30 segundos utilizando un baño de agua, y luego regrese al hielo durante un minuto.

Añada un mililitro de medio SOC precalentado y agite a 37 grados Celsius durante una hora a 1000 RPM utilizando un incubador agitador de banco. Tras la incubación, siembre 100 microlitros de células en placas de agar LB que contengan un antibiótico adecuado e incube durante la noche a 37 grados Celsius, en posición invertida. A continuación, realice pruebas de expresión a pequeña escala inoculando cinco mililitros de LB que contenga antibiótico con una colonia individual.

Repita el procedimiento para cinco a 10 colonias. Incube a 37 grados Celsius con agitación hasta alcanzar una densidad óptica a 600 nanómetros de aproximadamente 0,6. Induzca la expresión de la OMP diana añadiendo cinco microlitros de IPTG 1 M a cada tubo de cultivo y permita que crezcan de una a dos horas adicionales.

Para comparar los niveles de expresión de todas las colonias, centrifugue un mililitro de cada cultivo durante un minuto a 15.000 ×g utilizando una microcentrífuga. Retire el sobrenadante y resuspenda las células en 200 microlitros de tampón de carga para SDS-PAGE 1X. Incube a 100 grados Celsius durante cinco minutos y luego centrifugue nuevamente a 15.000 ×g durante cinco minutos.

Analice las muestras utilizando SDS-PAGE pipeteando 20 microlitros en cada pocillo de un gel al diez por ciento. Corra el gel durante 35 minutos a un voltaje constante de 200 voltios. Finalmente, recupere las células por centrifugación a 6000 ×g durante diez minutos.

ReSuspender las células en tampón de lisis en una proporción de cinco mililitros por gramo de pasta celular. Lisisar las células utilizando una prensa francesa o un homogeneizador celular. A continuación, centrifugar las células lisadas a 15.000 ×g durante 30 minutos a cuatro grados Celsius para eliminar células no lisadas y restos celulares.

Transfiera el sobrenadante a un tubo limpio y centrifugue nuevamente a alta velocidad durante una hora a cuatro grados Celsius. El precipitado resultante es la fracción de membrana que contiene la proteína de interés. Mediante un homogenizador Dounce, re suspenda la fracción de membrana.

Primero, transfiera las membranas y luego agregue tampón de solubilización a una concentración 2X sin detergente. Vierta las membranas resuspendidas en un cilindro graduado y agregue agua hasta alcanzar una concentración final de tampón de solubilización 1X. Transfiera la muestra a un vaso de precipitados y agregue detergente lentamente hasta alcanzar una concentración final de aproximadamente 10 veces la concentración micelar crítica.

Luego, agite durante 0,5 a 16 horas a cuatro grados Celsius, dependiendo de la facilidad con la que se extraiga la proteína diana de las membranas. Finalmente, centrifugue la muestra solubilizada a 300.000 ×g durante una hora a cuatro grados Celsius. Prepare una columna de IMAC de uno a cinco mililitros o utilice una columna precargada.

Realice los pasos posteriores de cromatografía a cuatro grados Celsius. Lave con agua para eliminar cualquier rastro de conservantes. Si se utiliza un sistema automatizado de purificación, instale la columna según las instrucciones del fabricante.

Prepare 500 mililitros del tampón A de IMAC sin imidazol y 250 mililitros del tampón B de IMAC con imidazol uno molar. Equilibre la columna de IMAC utilizando 10 volúmenes de columna del tampón A de IMAC. Añada imidazol a la muestra de proteína hasta una concentración final de 25 milimolar y mezcle. A continuación, cargue la muestra sobre la columna de IMAC equilibrada a una velocidad de dos mililitros por minuto.

Recolecte el flujo que atraviesa. A continuación, lave la columna de afinidad por metal inmovilizado (IMAC) con cinco volúmenes de columna de concentraciones crecientes de imidazol, utilizando el tampón B. Recolecte los lavados en fracciones de dos mililitros. Eluya la muestra con una concentración final de 250 milimolar durante cinco volúmenes de columna y recolecte la muestra eluida en fracciones de dos mililitros.

Analice el flujo directo, las fracciones de lavado y las fracciones de elución mediante análisis por SDS-PAGE basado en su absorbancia a 280 nanómetros. Reúna las fracciones que contengan la OMP de barril beta diana, según se verifique mediante análisis por SDS-PAGE. Luego, elimine la etiqueta de histidina 6X añadiendo proteasa TEV a la muestra reunida e incubando durante la noche a cuatro grados Celsius con agitación suave.

Cargue nuevamente la solución de proteasa de la muestra en una columna de IMAC para separar la OMP de barril beta objetivo de las etiquetas escindidas y cualquier muestra no escindida. El flujo directo contendrá la muestra escindida que carece de la etiqueta. Para prepararse para la cristalización, cargue la muestra en una columna de filtración en gel en un tampón que contenga el detergente que se utilizará para la cristalización.

Recolecte fracciones de un mililitro y analícelas mediante análisis por SDS-PAGE basado en su absorbancia a 280 nanómetros. Combine las fracciones que contengan la proteína diana y luego concéntrelas hasta aproximadamente 10 miligramos por mililitro. Antes de preparar las muestras, arme el aparato para geles.

Utilice tampón de electroforesis para geles previamente enfriado o realice la electroforesis en una cámara fría. Filtre la muestra utilizando un filtro centrífugo de 0,22 micrones para eliminar partículas y precipitados. Luego, pipetee 0,25 microlitros de la muestra en dos tubos microcentrífugos de 1,5 mililitros.

Etiquete uno como "hervido" y el otro como "RT". A continuación, agregue 9,75 microlitros del tampón de muestra a cada tubo y mezcle por pipeteo. A ambas muestras, agregue también 10 microlitros de tampón de carga 2X SDS y mezcle suavemente por pipeteo. Somete la muestra "hervida" a ebullición a 95 grados Celsius durante cinco minutos, mientras mantiene la muestra "RT" a temperatura ambiente.

Luego, centrifugue brevemente la "muestra hervida". A continuación, cargue 20 microlitros de ambas muestras en el gel nativo previamente ensamblado. Después de correr el gel durante 60 minutos a un voltaje constante de 150 voltios, retire el gel y sumérjalo en la solución de tinción para visualizar los resultados.

Proceda con los ensayos de cristalización en detergente, celdas bicelulares y fase cúbica lipídica, utilizando los métodos publicados previamente en Jove. Las cabezas de cristalización se visualizan bajo un microscopio UV para verificar que los cristales sean, efectivamente, proteína y no cristales de lípido o detergente. Los cristales prometedores se analizan usando una fuente local o en el sincrotrón para determinar si los cristales difractan.

Después de la recopilación de datos de cristales que difractan bien, procese los datos utilizando software de procesamiento, como HKL2000. Transfiera los archivos resultantes a un conjunto de software para la determinación de estructuras, como Phoenix Suit, y realice el reemplazo molecular para la fase inicial y la determinación de la estructura. La estructura cristalina de YIUR se determinó a una resolución de 2,6 Ångström utilizando este método.

Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en dos semanas, si se lleva a cabo correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo expresar y purificar proteínas de la membrana externa bacteriana para estudios estructurales.