A partir de construcciones de Cristales - Hacia la determinación de la estructura de la β-barril proteínas de membrana externas

El objetivo general de este método es obtener cantidades de miligramos de proteínas beta-barril de membrana externa que cristalizarán y se desfracturarán. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del plegamiento y transporte de proteínas de membrana, como la forma en que se insertan las proteínas beta-barril en las membranas celulares. La principal ventaja de esta técnica es que es robusta para las proteínas beta-barril.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades, porque la elección de detergentes para la purificación, la cristalización y la defracción es un desafío. Jeremy Guerin, un postdoctorado del laboratorio de Susan Buchanan, hará una demostración del procedimiento, además de mí y mis colegas en el laboratorio. Comience este procedimiento con la construcción de un vector de expresión T7 que contenga la proteína de membrana externa diana optimizada para el codón, o gen OMP, para la expresión in vivo en la membrana como se describe en el protocolo de texto.

Transforme la construcción en una cepa de expresión de bacterias para su expresión pipeteando un microlitro de plásmido en 50 microlitros de células BL21 (DE3) químicamente competentes, y mezcle suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Incubar en hielo durante 30 minutos. Después de la incubación, presione el calor a 42 grados centígrados durante 30 segundos con un baño de agua y luego vuelva a colocar en hielo durante un minuto.

Agregue un mililitro de medio SOC precalentado y agite a 37 grados centígrados durante una hora a 1000 RPM usando una incubadora agitadora de sobremesa. Después de la incubación, coloque 100 microlitros de células en placas de agar LB que contengan un antibiótico adecuado e incube durante la noche a 37 grados centígrados, invertido. A continuación, realice pruebas de expresión a pequeña escala inoculando cinco mililitros de cultivo antibiótico que contenga LB con una sola colonia.

Repita de cinco a 10 colonias. Crece a 37 grados centígrados con agitación hasta una densidad óptica a 600 nanómetros de aproximadamente cero punto seis. Inducir la expresión de la OMP diana añadiendo cinco microlitros de un molar IPTG a cada tubo de cultivo y dejar crecer una o dos horas adicionales.

Para comparar los niveles de expresión de todas las colonias, centrifugar un mililitro de cada cultivo durante un minuto a 15.000 veces G, utilizando una microcentrífuga. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 200 microlitros de tampón de carga 1X SDS-PAGE. Calentar a 100 grados centígrados durante cinco minutos y luego centrifugar de nuevo a 15.000 veces G durante cinco minutos.

Analice las muestras con SDS-PAGE pipeteando 20 microlitros en cada pocillo de un gel al diez por ciento. Haga funcionar el gel durante 35 minutos a una temperatura constante de 200 voltios. Finalmente, recoja las células por centrifugación a 6000 veces G durante diez minutos.

Vuelva a suspender las células en el tampón de lisis en una proporción de cinco mililitros por gramo de pasta celular. Lisar las células con una prensa francesa o un homogeneizador de células. A continuación, haga girar las células lisadas a 15.000 veces G durante 30 minutos a cuatro grados centígrados para eliminar las células no lisadas y los restos de células.

Transfiera el sobrenadante a un tubo limpio y vuelva a centrifugar a alta velocidad durante una hora a cuatro grados centígrados. El pellet resultante es la fracción de membrana que contiene la proteína de interés. Con un homogeneizador Dounce, vuelva a suspender la fracción de membrana.

Primero, transfiera las membranas y luego agregue el tampón de solubilización a una concentración de 2X sin detergente. Vierta las membranas resuspendidas en un cilindro graduado y agregue agua hasta alcanzar una concentración final de tampón de solubilización 1X. Transfiera la muestra a un vaso de precipitados y agregue detergente lentamente hasta una concentración final de aproximadamente 10 veces la concentración micelar crítica.

A continuación, agite de 0,5 a 16 horas a cuatro grados centígrados, dependiendo de la facilidad con la que se extraiga la proteína objetivo de las membranas. Finalmente, centrifugar la muestra solubilizada a 300.000 veces G durante una hora a cuatro grados Celsius. Prepare una columna IMAC de uno a cinco mililitros o use una columna preempaquetada.

Realice los pasos posteriores de cromatografía a cuatro grados centígrados. Enjuague con agua para eliminar cualquier rastro de conservantes. Si utiliza un sistema de purificación automatizado, instale la columna de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Preparar 500 mililitros de tampón IMAC A sin imidizol y 250 mililitros de tampón IMAC B con un molar de imidizol. Equilibre la columna IMAC utilizando 10 volúmenes de columna de tampón IMAC A. Agregue imidizol a la muestra de proteína hasta una concentración final de 25 milimolares y mezcle. A continuación, cargue la muestra en la columna IMAC equilibrada a dos mililitros por minuto.

Recoja el flujo continuo. A continuación, lavar la columna IMAC con cinco volúmenes de columna cada uno de concentraciones crecientes de imidizol, utilizando el tampón B. Recoja los lavados en fracciones de dos mililitros. Eluir la muestra con una concentración final de 250 milimolares para volúmenes de cinco columnas y recoger la muestra eluida en fracciones de dos mililitros.

Analice el flujo, las fracciones de lavado y las fracciones de elución mediante el análisis SDS-PAGE basado en su absorbancia a 280 nanómetros. Agrupe las fracciones que contienen el OMP objetivo de barril beta verificado por el análisis SDS-PAGE. A continuación, retire la etiqueta de histadina 6X añadiendo la proteasa TEV a la muestra agrupada e incubando durante la noche a cuatro grados centígrados con un suave balanceo.

Cargue de nuevo la solución de proteasa de muestra en una columna IMAC para separar el OMP de barril beta objetivo de las etiquetas escindidas y de cualquier muestra desencajada. El flujo a través contendrá la muestra escindida que carece de la etiqueta. Para prepararse para la cristalización, cargue la muestra en una columna de filtración de gel en un tampón que contenga el detergente que se utilizará para la cristalización.

Recoja fracciones de un mililitro y analícelas utilizando el análisis SDS-PAGE basado en su absorbancia a 280 nanómetros. Agrupe las fracciones que contienen la proteína objetivo y luego concéntrelas hasta aproximadamente 10 miligramos por mililitro. Antes de preparar las muestras, ensamble el aparato de gel.

Use un tampón de gel preenfriado o haga funcionar el gel en la cámara frigorífica. Filtre la muestra con un filtro centrífugo de 0,22 micras para eliminar las partículas y las precipitaciones. A continuación, pipetee 0,25 microlitros de la muestra en dos tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros.

Etiquete uno como hervido y el otro como RT "A continuación, agregue 9,75 microlitros del tampón de muestra a cada tubo y mezcle mediante pipeteo. A ambas muestras, agregue también 10 microlitros de tampón de carga 2X SDS y mezcle suavemente mediante pipeteo. Hervir la muestra hervida a 95 grados centígrados durante cinco minutos, dejando la muestra a temperatura ambiente.

Luego, gire brevemente la muestra hervida. A continuación, cargue 20 microlitros de ambas muestras en el gel nativo premontado. Después de hacer funcionar el gel durante 60 minutos a una temperatura constante de 150 voltios, retire el gel y sumérjalo en la solución de tinción para visualizar los resultados.

Realizar ensayos de cristalización en fase cúbica detergente, bicelular y lipídica, utilizando métodos de Jove previamente publicados. Los cabezales de cristalización se visualizan bajo un microscopio UV para verificar que los cristales son, efectivamente, proteínas y no disolventes, lípidos o detergentes. Los cristales de plomo se filtran utilizando una fuente doméstica o en el sincrotrón para ver si los cristales se desfracturan.

Después de la recolección de datos de los cristales que se desfracturan bien, procese los datos utilizando software de procesamiento, como HKL2000. Transfiera los archivos resultantes a un paquete de software para la determinación de estructuras, como Phoenix Suit, y realice el reemplazo molecular para la determinación inicial de fases y estructuras. La estructura cristalina de YIUR se determinó con una resolución de 2,6 Angstrom utilizando este método.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos semanas, si se realiza correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo expresar y purificar proteínas bacterianas de la membrana externa para estudios estructurales.