Metodología para el Estudio de la transferencia horizontal de genes en Staphylococcus aureus

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar una metodología detallada para estudiar la transmisión horizontal del ADN en Staphylococcus aureus abordando las tres vías principales de transferencia. Conjugación, transducción y transformación natural. Este método consiste en la transferencia horizontal de genes resistentes a los antibióticos en el patógeno humano stafilococo aureus.

La principal ventaja de las técnicas introducidas aquí es que podemos probar tres modos principales de transferencia, incluida la transformación genética natural recientemente descubierta. La demostración del procedimiento correrá a cargo de Le Thuy, estudiante de doctorado de nuestro laboratorio. Para comenzar el experimento, prepare cinco mililitros de cultivo durante la noche del donante y de las bacterias receptoras en caldo de soja tríptico. O medio TSB con y sin 32 miligramos por litro de cloranfenicol, respectivamente.

Con temblores a 37 grados centígrados. Al día siguiente, ajuste la densidad óptica de los cultivos durante la noche a uno con medio TSB fresco. Mezcle 0,5 mililitros del cultivo del donante con 0,5 mililitros del cultivo del receptor.

Y agregue un mililitro de solución salina tamponada con fosfato, o PBS a la mezcla. Luego, usando un sistema de bomba de vacío, transfiera la mezcla de bacterias a una membrana de filtro de 0,45 micrómetros. Coloque las membranas del filtro en una placa de agar sangre de oveja.

Incubar las placas a 37 grados centígrados durante un día. Saque la membrana del filtro de la placa y cuélgala en 10 mililitros de PBS. Agite la mezcla durante aproximadamente un minuto para recoger todas las bacterias adheridas a la membrana.

Realice una dilución en serie de 10 veces de la suspensión bacteriana con TSB fresco. Placa de 100 microlitros de las muestras 0, 10, 4 diluidas en agar TSB. O placas TSA suplementadas con 32 miligramos por litro de cloranfenicol y ocho miligramos por litro de tetraciclina para seleccionar transconjugantes.

Coloque 100 microlitros de la suspensión diluida en placas TSA con ocho miligramos por litro de tetraciclina solamente. Para contar el número total de destinatarios. Después de la incubación, analizar las colonias de doble resistencia para detectar la presencia del gen CFR mediante PCR de colonias y sus perfiles de susceptibilidad.

Determine el antibiograma midiendo las concentraciones inhibitorias mínimas, MIC, de los antibióticos apropiados de acuerdo con el método estándar de microdilución o el método de difusión en disco. El perfil de susceptibilidad de los transconjugantes debe ser idéntico al del receptor. A excepción del cloranfenicol y otros compuestos afectados por el gen CFR.

Para descartar la resistencia a la tetraciclina desarrollada por la cepa donante. Prepare un cultivo nocturno de N315-45 en cinco mililitros de caldo de nutrientes suplementado con 3,6 milimolares de calcio. Prepare los subcultivos diluyendo el cultivo durante la noche de uno a 1.000 en un volumen final de 10 mililitros en viales de vidrio de 50 mililitros.

Cultive las bacterias durante una hora a 37 grados centígrados con agitación, 180 rotaciones por minuto. A continuación, prepare una serie de fagos MR83a diluidos en medio de cloruro de calcio NB. Añadir 20 microlitros del fago diluido en el cultivo bacteriano.

Preparar un cultivo de control sin infección por fagos para que sirva como control positivo para el crecimiento de células bacterianas. A continuación, cultive los cultivos a 37 grados centígrados con una suave agitación a 100 rotaciones por minuto durante la noche. Al día siguiente, seleccione uno o dos viales de cultivo aclarados con la dilución más alta del fago añadido.

Transfiera los cultivos a tubos de centrífuga de 15 mililitros. Agregue 250 microlitros de cloroformo a los tubos y mezcle bien el cultivo invirtiéndolos. Centrifugar el cultivo a 5.000 veces G durante 20 minutos a 4 grados centígrados.

Transfiera los sobrenadantes a tubos nuevos y guárdelos a 4 grados centígrados hasta su uso. Prepare el caldo de nutrientes agar medio y manténgalo caliente en un baño de agua a 55 grados centígrados. Agregue una solución de cloruro de calcio 0.5 molar esterilizada en autoclave al medio hasta una concentración final de 3.6 milimolares.

Viértalo en placas de Petri de 90 milímetros NB de cloruro de calcio. Prepare un cultivo nocturno de N315 en cinco mililitros de cloruro de calcio NB a 37 grados centígrados con agitación. Al día siguiente, agregue 10 microlitros del cultivo durante la noche en 200 microlitros de cloruro de calcio NB y extiéndalo uniformemente sobre la placa de cloruro de calcio NB.

Deje de esparcirse cuando la superficie de la placa esté cubierta de líquido. A continuación, deje que el plato se seque durante cinco minutos. Realizar una dilución en serie de uno a 10 del fago previamente preparado utilizando un medio de cloruro de calcio NB.

Localiza tres microlitros de cada dilución de fagos en la placa cubierta de bacterias. Incubar la placa durante la noche a 30 grados centígrados. A la mañana siguiente, cuente los números de placa y calcule el título de fagos utilizando la siguiente ecuación.

Prepare el cultivo nocturno de N315, COL o MU50, en cinco mililitros de cloruro de calcio NB a 37 grados centígrados con agitación a 180 rotaciones por minuto. Después del cultivo nocturno, diluir el fago en cloruro de calcio NB a 109 PFU por mililitro. En un frasco de vidrio de 50 mililitros, mezcle 500 microlitros de cultivo durante la noche, 500 microlitros de cloruro de calcio NB fresco y un mililitro de fago 109 PFU por mililitro.

Incubar la mezcla a 37 grados centígrados con una suave agitación a 100 rotaciones por minuto durante 30 minutos. Después de la incubación, agregue 50 microlitros de citrato trisódico al 20% a los cultivos. Continúe agitando suavemente durante 30 minutos a 37 grados centígrados.

Prepare el medio de infusión de corazón de cerebro derretido o agar BHI y manténgalo en un baño de agua a 55 grados centígrados, y trate el medio de agar con 32 miligramos por litro de cloranfenicol. A continuación, transfiera la mezcla de fagos de bacterias a un matraz de 100 mililitros. Agregue 50 mililitros de agar BHI tibio complementado con 32 miligramos por litro de cloranfenicol y mezcle bien.

Vierte la mezcla en las placas de Petri de 90 milímetros. Incubar la placa a 37 grados centígrados. Pruebe aún más las colonias generadas, los transductores, para determinar la resistencia, transfiriendo las colonias a nuevas placas de agar BHI suplementadas con 32 miligramos por litro de cloranfenicol.

Confirmar la presencia del gen CFR mediante PCR de colonias. Cultivar la célula receptora durante la noche, en cinco mililitros de TSB a 37 grados centígrados con agitación. A la mañana siguiente, transfiera 0,5 mililitros del cultivo nocturno a un tubo de 1,5 mililitros.

Precipitar las células por centrifugación. A continuación, suspenda las celdas con 10 mililitros de medio CS2 en un tubo de 50 mililitros. A continuación, cultive las bacterias a 37 grados centígrados agitándolas a 180 rotaciones por minuto durante ocho horas hasta la fase exponencial tardía.

Recolección de las células por centrifugación. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 10 mililitros de medio CS2 fresco. Agregue 10 microgramos de plásmido purificado o ADN genómico a la suspensión celular.

Agite el cultivo a 180 rotaciones por minuto. A continuación, recoja las células por centrifugación. Resuspender las células en 10 mililitros de medio BHI.

Mezcle la suspensión celular con 90 mililitros de suplemento de agar BHI derretido con 32 miligramos por litro de cloranfenicol, y cinco microgramos por litro de tetraciclina en el experimento de control. Vierta la mezcla en las placas de Petri de 90 milímetros y enfríe rápidamente y deje que el agar se solidifique. Replique las colonias utilizando palillos de dientes en placas que contengan antibióticos apropiados para confirmar sus características de resistencia.

El protocolo de conjugación es útil para la transmisión intraespecie donde se utilizó Staphylococcus epidermidis como donante de CFR. Y se utilizó como receptora la cepa N315 de Staphylococcus aureus. El protocolo utilizado para la transmisión entre especies arroja resultados similares utilizando el mismo vector conjugativo en diferentes donantes conjugativos.

Este es el primer trabajo en el que se describen detalles de la transformación natural. La metodología proporcionada sería útil para que el investigador estudie la transmisión y propagación de la resistencia a los antibióticos, así como el determinante primario en el patógeno humano stafilococo aureus.